利用单抗体标记进行膜蛋白单分子定位显微镜

我的研究聚焦于T细胞膜，旨在揭示与治疗靶向相关的新的纳米尺度见解。现有成像方法通常无法直接观察细胞内纳米尺度的抗体-表位相互作用。该协议通过在细胞环境中实现直接观察，克服了这一限制。

将样品装载到显微镜上并沉积金胶体后，利用明场照明验证目标区域内是否沉积了足够的胶体。在继续前，确认目标区域内存在5到10个金胶体的理想密度。对于抗体探针荧光团的光学配置，请打开成像软件并访问光学配置设置。

选择合适的二色镜，设置激光激发波长和功率密度。调整相机积分时间并选择发射滤镜。然后，将相机像素分帧设置为150到160纳米的像素大小。

现在，通过在影像软件中选择照片漂白模式，创建光漂白步骤的光学配置。将激光功率设为100%，并将相机整合时间调整为一秒。在图像采集软件中，通过定义非照明间隔、帧数和光漂白步骤的频率来设置成像参数。

接着，将CD81抗体稀释至每毫升1微克浓度，用于200微升的5%BSA中，制备成像缓冲液。最终推荐的抗体浓度为Jurkat T细胞为0.5纳摩尔，U-2 OS细胞为2纳摩尔。将预备好的成像缓冲液加入含有细胞的井中，并在软件中开始图像采集，开始数据收集。

使用为膜单抗体标记配置的影像软件中的实时视图功能，实时监测抗体结合情况。在图像采集软件中配置成像参数，至少获得10帧的采集，并将非照明间隔设置为5秒。开始采集并评估录制影片中单分子定位的稀疏度。

如果在添加成像缓冲液后立即观察到多个重叠抗体结合事件，或单分子定位随时间积累，应中止采集。将抗体浓度降低两倍，并在新样本上重复采集。继续将抗体浓度降低两倍，并重新评估单位面积事件数量，直到达到所需的单分子定位密度。

如果事件密度稀疏，则将成像缓冲液中的抗体浓度增加两倍。在新样本上重复采集，并继续将抗体浓度增加两倍，同时重新评估单位面积的结合事件数量，直到达到所需的单分子定位密度。对于非照明间隔优化，可以在图像采集软件中配置成像参数以获得50帧的采集。

加入抗体并开始采集后，评估录像影片中单分子定位的密度和稀疏度。确定产生最佳单分子事件密度的最低非照明区间。最后，如果在图像采集过程中出现空间上重叠的结合事件，应在定时间隔引入光漂白步骤。

调整光漂白频率，使结合抗体的荧光在重叠事件积累前被去除。在MATLAB软件中将文件路径设置为包含重建的M单元逗号分隔值文件的文件夹。通过点击MATLAB工具栏中的“运行”来运行代码。

提示时，选择M单元CSV文件并点击打开将其加载到程序中。以之前定义的输入为起点进行分析。评估包含未聚类局部化数据的散点图。

选择一个最小点值，使其大于噪声定位数，但低于单元内定位数。评估显示聚类数据的窗口。确认簇在具有预期表型的细胞上得以保留，同时减少细胞外的定位。

如果聚类参数过于严格，则降低最低点数并增加ε。如果聚类参数过于包容，则提高最低点数并降低ε。最后，在调整最小点数和ε后，重新运行代码以获得最优聚类。

Jurkat T细胞被固定，保持膜完整性并允许抗体接触膜表位。金胶体被可视化并用作M细胞图像采集中侧向漂移校正的依据标记。非照明间隔的优化显示，五秒间隔在一纳摩尔抗体浓度下，空间重叠最小，形成抗体结合事件。

漂移校正的应用使重建后的M细胞图像相较于未校正重建时有所改善。基于密度的M细胞定位聚类减少了低密度背景相互作用，并突出了聚类CD81结合事件。我们可以观察到抗体在细胞环境中与其膜表位的相互作用，为治疗性抗体提供相关见解。

抗体浓度、非照明间隔和光漂白步骤对于优化至关重要。参数不优会影响结果。单抗体标记可以扩展到同时评估同一细胞环境中多种抗体对膜蛋白的结合情况。