Name: 利用单抗体标记进行膜蛋白单分子定位显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 了解单抗体标记技术用于T细胞膜蛋白纳米级成像的方法。该方案通过单分子定位显微镜实现抗体-表位相互作用的直接可视化，为治疗性抗体研究提供细胞水平的时空分布信息。

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本研究由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所根据资助编号R35GM146786以及伊利诺伊大学芝加哥分校文理学院资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有作者声明不存在任何需要披露的利益冲突。

质膜蛋白的排列在调控细胞功能中起着至关重要的作用。传统的荧光显微镜技术受限于光的衍射极限，无法揭示其纳米尺度上的组织结构。单分子定位显微镜（SMLM）通过实现10–20 nm的空间分辨率47，能够表征这些蛋白的纳米级组装结构10,48,49。然而，SMLM中的聚类伪影源于对同一荧光分子的重复检测50，可能导致出现虚假的蛋白聚集现象。单分子检测依赖于荧光分子的光开关特性，因此并不能完全反映局部表位的实际浓度51,52,53,54,55。基...

细胞质膜含有多种多样的蛋白质，可调控细胞运动性、黏附、感知以及细胞间通讯。了解质膜蛋白在纳米尺度上的分布十分重要，因为蛋白质的功能不仅取决于其表达水平，还常受其在膜上空间组织方式的调控1,2。值得注意的是，许多治疗性抗体以膜蛋白为靶点3,4，因此在纳米尺度上开展研究对于理解抗体相互作用如何受到局部膜蛋白组织结构的影响至关重要。然而，精确绘制膜蛋白分布图谱、对其丰度进行单分子水平分析，以及实时监测其与结合伴侣的动态相互作用，仍然具有挑战性。
广泛使用的单分子定位显微技术，如直接随机光学重建显微术（dSTORM）5,6 和基于DNA的纳米级拓扑成像点累积技术（DNA-PAINT）7，通常采用免疫荧光（IF）染色对样品进行标记。这些技术可实现约10 nm的横向分辨率，已为多种治疗性膜靶点的纳米级组织结构提供了深入见解，包括人表皮生长因子受体2（HER2）8,9、CD2010、T细胞受体11,12,13、程序性死亡配体114、B细胞受体15,16,17 以及CD1917,18。例如，使用治疗性单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）直接检测乳腺癌关键受体HER2的dSTORM研究揭示了HER2阳性患者之间存在不同的聚簇状态8，而不同治疗性抗体也被证明可调节HER2的聚簇行为9。结合晶格光片显微技术的DNA-PAINT已阐明了B细胞中CD20在利妥昔单抗（rituximab）、奥法木单抗（ofatumumab）和奥滨尤妥珠单抗（obinutuzumab）等治疗性单克隆抗体作用下的寡聚状态及相互作用特征10。尽管传统SMLM为纳米级结构组织提供了宝贵信息，但其潜力受限于传统的IF染色方法。SMLM图像质量依赖于IF染色效果，而后者又取决于标记抗体的特异性和亲和力。传统SMLM使用高亲和力抗体，通常可获得更优的IF染色和图像质量。然而，大多数治疗性抗体与活细胞膜受体的相互作用具有中等亲和力，以尽量减少脱靶副作用19。例如，双特异性T细胞衔接分子（bispecific T cell engagers, TCEs）对CD3具有较低亲和力，从而防止TCR内化20,21,22。此类相互作用无法通过传统IF技术准确捕捉。
我们此前已开发出一种直接利用单分子抗体-表位相互作用的策略，称为单抗体标记（single-antibody labeling, SAL）。SAL能够在保持天然结合平衡的同时，实现抗体-表位相互作用的高密度作图23。尽管我们此前已报道过针对细胞内细胞骨架和线粒体蛋白的实验方案24，但尚未在膜蛋白上实现SAL。在本方案中，我们提供了一套将SAL应用于膜蛋白的逐步操作流程，并以四跨膜蛋白CD81（一种已被报道的潜在治疗靶点25,26,27,28）为示例，在悬浮细胞和贴壁细胞中均完成了标记。通过使用荧光标记的抗CD81抗体，直接探测CD81在U2OS细胞和Jurkat T细胞膜上的空间分布，我们展示了SAL在膜蛋白纳米尺度研究中的应用。我们将该策略命名为膜蛋白SAL（membrane SAL, mSAL）。最后，我们描述了一种基于聚类的策略，用于减少细胞外孤立的单分子检测信号。
本质上，SAL 利用延时单分子标记技术捕获单个抗体-表位相互作用，随后通过单发射体去卷积，基于 SMLM 获得超分辨率图像。通过调节抗体浓度并选择连续图像帧之间适当的非照明间隔（NII），SAL 将抗体的结合速率与单分子检测速率相匹配，从而实现单分子定位。由于抗体固有的结合动力学较慢，SAL 需要较长的 NII，导致图像采集时间延长（约 3–17 小时）。SAL 最适用于需要对表位进行精确纳米级定位以及评估单个抗体-表位相互作用动态特性的应用。尽管通量较低，SAL 能够在接近生理条件下提供关于表位组织结构和抗体结合行为的独特信息，因此在原位表征治疗性抗体方面具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>抗CD81 Alexa Fluor 488 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-44132</td><td>成像抗体</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>8孔腔室盖玻片</td><td>Cellvis</td><td>C8-1-N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛，10%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>金胶体，100 nm</td><td>Ted Pella</td><td>15711&amp;minus;20</td><td>定位标记物</td></tr><tr><td>浸油&amp;nbsp;</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16245</td><td></td></tr><tr><td>配备TIRF模块的倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Jurkat E6.1细胞系</td><td>MilliporeSigma</td><td>88042803-1VL</td><td>悬浮细胞</td></tr><tr><td>六线激光发射器</td><td>Oxxius</td><td>L6CC-CS8-1511</td><td>激发激光器</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>显微成像软件</td><td>Nikon Instruments</td><td>NIS-Elements Advanced Research</td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>物镜，100x/1.49 CFI APO TIRF&amp;nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td>MRD01991</td><td>显微镜物镜</td></tr><tr><td>多聚甲醛，16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液，0.01%&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B sCMOS相机</td><td>Teledyne Vision Solutions</td><td>01-PRIME-95B-R-M-16-C</td><td>相机</td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>悬浮细胞培养基</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19038-1000</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>MilliporeSigma</td><td>213462-25G</td><td></td></tr><tr><td>T25培养瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>169900</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck微球</td><td></td><td></td><td>定位标记物</td></tr><tr><td>组织培养皿，100 mm&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>U2OS细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>贴壁细胞</td></tr></tbody></table>

使用单抗体标记法对膜蛋白进行单分子定位显微成像

Single-Molecule Localization Microscopy of Membrane Proteins using Single-Antibody Labeling

细胞质膜决定了细胞的形态，并作为调控细胞间通讯的界面。膜蛋白是一类重要的治疗靶点，因此通过其组成蛋白对细胞膜进行超分辨率成像，在推动细胞生物学和抗体药物研发方面具有重要意义。在此背景下，单分子定位显微镜（SMLM）能够实现生物结构上蛋白质分布的纳米级可视化。尽管如此，将SMLM应用于质膜蛋白仍面临独特挑战。本实验方案介绍了一种有效的时间分辨单抗体标记方法，称为膜单抗体标记法（mSAL）。我们提供了详细的分步操作指南，包括抗体浓度、激光功率密度、非照射时间间隔时长的优化，图像重建以及基于密度的聚类分析，以解析膜蛋白的纳米级分布特征和膜的形态结构。我们以四跨膜蛋白CD81作为模型膜蛋白，展示了mSAL在贴壁和悬浮培养的哺乳动物细胞中的应用能力。除了实现细胞膜及膜蛋白分布的超分辨率成像外，该技术还能够在天然膜环境中研究治疗性抗体与其膜靶点相互作用的药效动力学。

本方案中描述的mSAL技术能够可视化单个抗体与其相应质膜蛋白靶标的结合事件，从而生成膜蛋白分布的超分辨率图谱。此处以CD81作为代表性示例，但该方法可轻松适用于其他膜蛋白。
将Jurkat T细胞固定并保持细胞间足够的间距，可确保抗体能够接触到细胞膜表位，同时便于玻璃表面的定位标记物沉降（图1A）。此外，移液操作技术会直接影响脆弱膜结构的保存。因此，在溶液更换步骤中应轻柔移液。将溶液加入孔板的角落，同时将样品腔室倾斜持握，有助于防止液流冲走细胞并破坏脆弱的膜结构（图1B）。
添加金胶体作为基准标记，以校正图像重建过程中可能发生的任何横向载物台漂移。显微镜系统的完美聚焦系统（PFS）通过使用近红外光追踪盖玻片表面并持续调节物镜高度，自动校正焦平面漂移，从而在长时间成像过程中保持样本始终聚焦。如果使用与近红外激发荧光染料偶联的抗体，则应关闭PFS功能。成像前必须确认视野中存在足够数量的金胶体。<strong cl...

本方案描述了单抗体标记法（SAL），用于解析质膜蛋白的纳米级空间分布。通过利用单分子水平上的抗体-表位累积相互作用，膜蛋白单抗体标记法（mSAL）可在原生细胞环境中同时绘制局部表位分布图并捕获抗体结合行为。

细胞膜决定细胞形态，并作为调控细胞间通讯的界面。膜蛋白是其主要组成部分……

我的研究聚焦于T细胞的膜结构，旨在揭示与治疗靶向相关的新的纳米尺度机制。现有的成像方法通常无法直接观察细胞内纳米尺度的抗体-表位相互作用。本方案通过在细胞环境中实现直接观测，克服了这一局限性。将样品安装到显微镜上并在表面沉积金胶体后，使用明场照明确认在目标区域内已沉积足够数量的胶体。在继续操作前，需确认目标区域内存在每区域5至10个金胶体的理想密度。对于抗体探针荧光染料的光学配置，请打开成像软件并进入光学配置设置。选择合适的二向色镜，并设置激光激发波长和功率密度。调整相机的积分时间，并选择发射滤光片。然后，设置相机的像素合并，以获得150至160纳米的像素尺寸。现在，通过在成像软件中选择光漂白模式，为光漂白步骤创建光学配置。将激光功率设置为100%，并将相机积分时间调整为1秒。在图像采集软件中设置成像参数，定义非照射间隔、帧数以及光漂白步骤的频率。接下来，将CD81抗体用200微升含5% BSA的DPBS稀释至浓度为每毫升1微克，以制备成成像缓冲液。Jurkat T细胞的推荐终浓度为0.5纳摩尔，U-2 OS细胞为2纳摩尔。将制备好的成像缓冲液加入含有细胞的孔中，并在软件中启动图像采集以开始数据收集。使用成像软件中针对膜单抗体标记配置的实时成像功能，以实时监测抗体结合过程。在图像采集软件中设置成像参数，至少采集10帧图像，并将非照明间隔设为5秒。启动采集后，评估所记录视频中单分子定位的稀疏程度。如果在加入成像缓冲液后立即观察到多个重叠的抗体结合事件，或随时间推移单分子定位信号持续累积，则中止数据采集。将抗体浓度降低一倍，并在新的样品上重复采集。继续将抗体浓度逐次降低一倍，并重新评估单位面积内的事件数量，直至达到理想的单分子定位密度。如果事件密度较稀疏，可将成像缓冲液中的抗体浓度提高一倍。在新样本上重复采集，并持续将抗体浓度逐次提高一倍，同时重新评估单位面积上的结合事件数量，直至达到理想的单分子定位密度。对于非激发间隔的优化，在图像采集软件中设置成像参数，以获取包含50帧的采集数据。加入抗体并开始采集后，评估所记录视频中单分子定位的密度与稀疏程度。确定能够产生最佳单分子事件密度的最短非照射间隔时间。最后，如果随着图像采集的进行出现空间上重叠的结合事件，应定期引入光漂白步骤。调整光漂白频率，以便在重叠事件累积之前去除结合抗体的荧光信号。在 MATLAB 软件中将文件路径设置为包含重建 M 细胞逗号分隔值文件的文件夹。点击 MATLAB 工具栏中的“运行”按钮执行代码。当系统提示时，选择 M 细胞的 CSV 文件，然后单击“打开”以将其加载到程序中。使用先前定义的输入作为起点运行分析。评估包含未聚类定位数据的散点图。选择一个最小点值，该值应高于噪声定位数量，但低于细胞上的定位数量。评估显示聚类数据的窗口，确认具有预期表型的细胞上保留了聚类，而细胞外的定位被最小化。如果聚类参数过于严格，请降低最小点数阈值并增大 epsilon 值。如果聚类参数过于宽松，请提高最小点数阈值并减小 epsilon 值。最后，在调整完最小点数阈值和 epsilon 值后，重新运行代码以获得最优聚类结果。将Jurkat T细胞以足够的间距固定，以保持膜的完整性，并允许抗体结合到膜上的表位。金胶体被用于可视化，并在M细胞成像过程中作为基准标记，以校正横向漂移。通过对非照射间隔的优化发现，在1纳摩尔抗体浓度下，五秒间隔产生的抗体结合事件空间重叠最少，优于更短或更长的间隔。与未校正的重建结果相比，应用漂移校正改善了M细胞图像的重建效果。基于密度的M细胞定位聚类减少了低密度背景信号，突显出CD81结合事件的聚集特征。我们能够观察抗体在细胞环境中与其膜表位的相互作用，从而为治疗性抗体的相关研究提供重要见解。抗体浓度、非照射间隔时间以及光漂白步骤的优化至关重要。参数不理想将会影响实验结果。单抗体标记技术可进一步扩展，用于在同一细胞环境中同时评估多种抗体对膜蛋白的结合。

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Bioengineering

生物工程

利用单抗体标记进行膜蛋白单分子定位显微镜

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