一种用于培养胚胎 C。线虫细胞

该程序的总体目标是在体外解离和培养胚胎、海洋优雅细胞。这是通过首先种植大量坟墓动物来实现的。接下来从成虫中分离出虫卵。

然后用几丁质酶处理鸡蛋以溶解蛋壳。最后，手动解离细胞并铺板用于培养。最终，可以通过免疫荧光、显微镜检查、电生理学和钙成像技术获得显示细胞特异性标志物表达的结果。

演示该程序的将是 rel ti，一个博士后实验室。在将至少四个 sea elegance 板培养到 GR 成人阶段并根据文本方案准备培养基和溶液后。首先将一管先前制备的花生凝集素原液浸入水中，开始鸡蛋分离。

将高压灭菌器盖玻片放入 24 孔板的孔中，向每个盖玻片中加入 200 μL 花生凝集素，在室温下孵育至少一小时。接下来，吸出溶液并使用无菌水清洗孔。一次去除所有痕迹的花生凝集素以防止细胞聚集。

然后使用无菌高压灭菌水，将 GR 成体从琼脂平板上洗掉，并将悬浮液收集在两个无菌锥形 50 毫升管中。将试管放在冰上长达 5 分钟，让蠕虫沉降到底部用移液管除去水，然后用新鲜、无菌的高压灭菌水离心机代替。蠕虫在 200 G 下放置 10 分钟。

最后一次洗涤后，复苏，将蠕虫悬浮在新鲜的无菌水中，并将其转移到无菌的 15 毫升锥形管中，然后再次以 200 G 离心 10 分钟。如果蠕虫没有完全沉淀，请将试管放在冰上 5 分钟。蠕虫完全沉淀后，除去水并加入 5 到 6 毫升裂解液。

然后轻轻摇动悬浮液 5 到 10 分钟，每 2 到 3 分钟，将一滴悬浮液滴在盖玻片上，并在立体显微镜下检查是否裂解。当 72 80% 的蠕虫被裂解时，加入 9 毫升鸡蛋缓冲液停止裂解反应，然后从此时开始旋转，点燃本生灯并保持打开以防止鸡蛋再次污染，小心去除上清液并使用鸡蛋缓冲液彻底清洗沉淀三到四次，直到溶液澄清。接下来，在去除最终上清液以将鸡蛋与动物尸体复苏分离后，将沉淀悬浮在 2 毫升无菌鸡蛋缓冲液中，并在鸡蛋缓冲液中加入 2 毫升 60% 蔗糖。

将鸡蛋在溶液中充分混合，然后离心 20 分钟。在 200 G 时，小心地从离心机中取出试管。鸡蛋会漂浮在溶液的顶部。

因此，使用移液器和无菌 1 毫升吸头将鸡蛋转移到新鲜的无菌 15 毫升锥形管中。在层流罩下工作时，使用无菌鸡蛋缓冲液清洗鸡蛋 3 次。为避免引入细菌污染，复苏后，将沉淀的鸡蛋悬浮在 1 毫升 2 毫克/毫升的激酶中，然后将它们转移到新鲜的 15 毫升锥形管中。

在室温下摇动试管 10 到 30 分钟，具体取决于酶的新鲜度，当大约 80% 的蛋壳被消化时。将鸡蛋以 900 G 离心 3 分钟。小心去除上清液后，加入 3 毫升 L 15 培养基，将鸡蛋转移到直径为 6 厘米的板中，并使用带有 18 号针头的 10 毫升无菌注射器开始手动解离。

为了监测解离的程度，将一滴悬浮液滴入新鲜的培养皿中，并在显微镜下观察。继续直到大约 80% 的细胞解离。要去除细胞块、未消化的卵和孵化的幼虫，请通过 5 微米过滤器轻轻过滤悬浮液，然后额外运行 4 至 5 毫升 L 15 培养基通过过滤器，以回收细胞以培养细胞。

将滤液以 900 G 离心 3 分钟后，复苏将细胞悬浮在每孔 1 毫升的完全 L 15 培养基中，并将板储存在 20 摄氏度的潮湿密封室中，并置于环境空气中。为了区分分离的胚胎秀丽隐杆细胞必须粘附在底物上。分化过程在铺板后约 2 至 3 小时开始，持续约 24 小时。

体外形态特征与体内形态特征非常相似。例如，如此处所示，LM 和 PLM 触摸神经元只发育两个神经元过程，一个比另一个长，因为它们在体内也是如此。这表明至少一些驱动秀丽隐杆线细胞分化的分子机制是细胞自主的，因此可以概括。

也可以在体外观察到细胞特异性的体外蛋白质标志物和翻译后修饰。例如，α 微管蛋白是 sea elgan 中仅在接触神经元中饱和的，如此处所示的触摸神经元的体外过程用针对饱和 α 微管蛋白产生的抗体染色。此外，如该面板所示，培养的触摸神经元表达有毒突变通道 MEC four D，这确实会导致触摸神经元在体内死亡。

由 MEC 4 DPE 4G FP 菌株制备的表达 GFP 的神经元最初存在于培养物中，但随后退化。然而，就像在体内一样，可以通过用 IDE 和丹曲林处理来拯救细胞免于死亡，如图所示。膜片钳技术用于研究 sea elgan 培养细胞中的钾离子、离子、非选择性和多巴胺转运蛋白依赖性通道。

由于样品池体积小，玻璃移液器必须有一个小吸头，然后是一个宽锥体，以抵消增加的输入电阻。此外，通过在移液器尖端下方的膜片上施加高压脉冲，而不是通过可能损坏细胞的抽吸进入整个细胞，从而获得更大的成功。在该图中，为了研究电压门控钙通道的作用，ION 4 用于渗透膜并校准表达变色龙 YC 两点 12 的触摸神经元，以便在不存在或存在钙的情况下进行钙成像。

此外，还确定了触摸神经元中的平均游离钙浓度为 200 纳摩尔。看完这个视频，你应该对如何进行体外分离和培养有一个很好的了解。参见优雅，胚胎细胞。