在大规模的基因敲除 C。线虫使用双链RNA料库产生失去功能的鲁棒表型

该程序的总体目标是使用细菌 DS RNA 饲养文库在 C 优雅中进行大规模 RNA 干扰筛选以敲低基因表达。这是通过首先从 DS RNA 文库中培养细菌克隆来实现的。在防止质粒丢失的生长条件下，首先复制每个初级文库板，然后使用 96 孔复制文库板在琼脂全孔板上生成临时的细菌茎。

来自这些全能板的细菌在液体培养物中生长过夜，然后转移到蠕虫饲养板的表面。文库中的每个细菌克隆都携带一个独特的 D-S-R-N-A 编码质粒，该质粒靶向一个 C elgan 基因进行敲低。第二步是将同步的蜗杆放在饲喂板上。

接下来，将蠕虫在 20 摄氏度的加湿室中生长数天。当蠕虫以细菌为食时，诱导的 DS RNA 被释放到动物的肠道中，然后扩散到周围组织，引起全身敲低效应。最后一步是检查饲养动物的基因特异性敲低引起的表型效应。

这些表型测定用于鉴定对所研究的生物过程很重要的基因。与现有方法（如将双峰链 RNA 显微注射到蠕虫性腺中）相比，该技术的主要优点是吞吐量高。使用饲养文库，我们可以在短短几周内检查几乎所有 sea elgin's 基因的生物学功能。

许多实验室都在努力采用这种敲低方法，因为大多数基因和 C 优雅都是单倍体足够的。因此 RNA 敲低必须将基因表达降低 50% 以上才能产生功能丧失表型。为了确保稳健的基因敲低，喂食蠕虫的所有细菌都表达双链 RNA 质粒至关重要。

要开始确定质粒损失的程序，请按照每个相关步骤中的说明取出一小块细菌样品，并将其添加到 450 微升无菌水中。使用 100 μL 这种稀释的样品，通过无菌水进一步进行连续稀释。在两次稀释之间充分混合溶液。

将 100 微升每种稀释液涂在 LB 和 LB AMP 板上，并在第二天在 37 摄氏度下孵育过夜，鉴定包含 100 到 500 个细菌菌落的 LB 板。计算该板和含有相同细菌稀释液的相应 lb amp 板上的菌落数。使用此方程确定质粒损失。

质粒的细菌的百分比的计算方法是从 LB 板上的菌落数中减去 LB amp 板上的菌落数，除以 LB 板上的菌落数，然后乘以 100质粒损失通过在高浓度的碳酸 sellin 中生长细菌来防止有效敲低。在喂养动物之前检查质粒损失，并且仅在质粒损失小于 15% 时继续从负 80 摄氏度冰箱中取出重复的文库板来开始此过程。在培养物仍冷冻时取下铝箔密封。

装回板塑料盖，将复制的文库板放在水平面上，使其在室温下解冻不超过 30 分钟。对口腔 96 针复制器进行消毒。将其放入乙醇浴中，然后燃烧乙醇。

用面包和燃烧器将销钉涂上。让火焰熄灭，然后重复。干净的复制器的销钉应用蒸馏水冲洗，然后在每次使用前消毒。

将灭菌的复制器放入解冻的复制板的孔中，并用它轻轻搅拌培养物。少量培养物将粘附在复制器的针脚上。小心地从复制板的孔中取出复制器，并将其轻轻固定在全向板的表面上。

小心不要刺穿琼脂表面。将复制器留在全向板表面 3 到 4 秒钟，以便复制器针脚中的细菌转移到琼脂表面。为防止质粒在固体培养基上损失，ate 每毫升含有 2 毫克。

碳酸 sellin。去除复制器，让少量细菌培养物吸收到琼脂中。复制两个板后。

第二天早上，将全能板在 37 摄氏度下倒置孵育 15 至 18 小时。这些全能板可用于接种 96 孔液体培养物，或在 4 摄氏度下储存长达 7 天。使用重复移液器和 50 毫升组合吸头，使用来自全向板的细菌将用于喂养蠕虫的细菌制备为液体培养物，将 1 毫升细菌生长培养基分配到每 2 毫升中。

96 孔板的深孔对复制器进行消毒，并将其放在含有细菌菌落的全向板的表面上，确保针脚与 96 个细菌菌落中的每一个接触。小心地将复制器从全向板表面移动到深孔板中，确保针脚在浸入生长培养基之前不会刮擦深孔的侧面。将细菌驱散到生长培养基中。

沿着深孔板的内壁以方形运动缓慢移动复制器。小心不要飞溅和交叉污染井。对于每个 96 孔深孔培养板，应包括两个对照。

表达 DS RNA 的细菌作为预期敲低的阳性对照、表型和含有空 DS RNA 载体的细菌作为阴性对照。使用无菌接种环，从阳性对照板中取出单个孔分离的菌落，并在称为板的深孔中接种一个空孔。记录已接种的井的位置。

对阴性对照重复上述步骤。在 37 摄氏度的微型振荡器上以 650 RPM 的转速将深孔板平放摇晃过夜。培养物孵育过夜后，来自 96 个深孔板的细菌将被转移到 12 个深孔板中。

补孔板转移可以一次进行四个孔。将移液器吸头放在 12 通道多通道移液器的每三个通道上。从深孔板中取出 150 微升细菌培养物，然后喷射到 12 孔饲养板的四个孔的表面。

重要的是在转移过程中不要刺穿琼脂表面，因为蠕虫会挖洞，而不是以表达 DS RNA 的细菌为食。转移每组四个孔后，用四个新的无菌移液器吸头更换四个移液器吸头，并在饲养板的下一个四个孔中播种，将播种板在室温下在黑暗中直立存放过夜，以便细菌可以吸收到琼脂中。在转移 L 之前，将 C elgan 幼虫停滞到 DS RNA 饲喂板上进行饲喂筛选。

必须测定先前制备的 L 1 停滞幼虫的浓度。混合含有被捕的 L 1 幼虫的锥形瓶以分配动物。然后取出 10 微升等分试样，滴加到未放置的 6 厘米 NGM 板上。

分四到五滴从板的中心滴下。确保所有介质都从移液器中排出。使用移液器吸头的末端，将蠕虫悬浮液的点展开，形成一条跨越板直径的连续液体线。

使用解剖显微镜对所有动物进行计数，从液体线的一端开始，一直到另一端，直到液体吸收到板中并且动物分散之前。这可能需要不断重新调整解剖范围的焦点，以确保不会遗漏任何动物。对三个单独的 10 μL 等分试样重复此计数程序，以确定每 μL 蠕虫悬液的平均蠕虫数，并将此数字直接记录在锥形瓶上。

要开始饲喂筛选，请使用 L 1 停滞幼虫的悬浮液和无菌水制备每毫升含有 2000 条蠕虫的溶液。每个 12 孔饲养板需要 120 微升这种蠕虫悬浮液，充分混合，以确保动物均匀分布，并将动物转移到无菌储液槽中进行移液。使用每三个位置设置吸头的多通道移液器，将 10 微升蠕虫溶液直接转移到饲喂板的细菌草坪上。

注意不要刺穿琼脂表面，因为蠕虫会钻入琼脂中，而不是以表达 D-S-R-N-A 的细菌为食。将蠕虫溶液转移到每两排饲喂板后，在蠕虫沉淀时轻轻晃动蠕虫溶液，在储液器中重新混合蠕虫溶液，在解剖镜下快速检查早期的几个孔，以确保每个孔有 20 到 30 个蠕虫。一旦所有饲喂盘都有蠕虫，在蠕虫悬浮液吸收到板中的第二天，将板子直立存放在 20 摄氏度培养箱中的加湿箱中，倒置板并在 20 摄氏度下放回雪茄盒。

这些平板上的动物可以在 3 天后观察到 P 零表型，然后在 6 天后再次观察到 F1 表型。此处描述的方案用于测试敲低鸡蛋 L 30、dumpy 17、PAT 10 的 4 个基因，以及 4 个鸡蛋 L 30 和 4 个在神经系统中表达的基因。Pat 10 在体壁肌肉中表达，Dumpy 17 在表皮细胞中表达。

筛选中使用 Erie one Lin 15 B 突变体，因为它们对作为阴性对照的 RNAi 敏感性增强。蠕虫被喂食含有空 PL 44 40 质粒的细菌，该质粒未按预期表达 DS RNA。RIE 1 Lin 15 B 动物喂食含有空质粒中的细菌，未表现出任何形态学或行为缺陷。

这张照片显示了自由移动的动物，它们正常的身体姿势证明了这一点。黑色箭头表示年轻成年动物的位置。白色箭头表示一组产蛋的位置。

蠕虫的正常行为显示在此视频剪辑中，蛋 L 30 编码 G 蛋白亚基 G alpha Q.当 L 一期伊利一林 15 B 幼虫被喂食表达蛋 L 30 DS RNA 的细菌时。幼虫长成成虫，在运动和产卵行为方面表现出明显的缺陷。3 天后，100% 饲喂 DS RNA 对抗蛋 L 30 的动物瘫痪，无法产蛋。

这张照片显示，所有动物都采用了瘫痪动物典型的僵硬外表。还应注意盘子上完全没有产下的鸡蛋。Dumpy 17 编码在海洋中角质层形成所需的胶原蛋白。

Elgan 和 dumpy 17 null 突变体比野生型动物矮小、更胖。在本实验中，在喂食 dumpy 17 D-S-R-N-A 的 P 0 只动物中未观察到形态学缺陷。然而，如图所示的 98% 的 F1 动物显示出 dumpy 表型。

请注意，田间的成年动物（其中一只用箭头标记）比黑色箭头标记的成年动物矮小、更胖。在图 A.缺乏矮小和肥胖的 P zero 动物表明在幼虫早期阶段需要 dumpy 17 基因功能才能获得适当的身体形态。Pat 10 编码体壁肌肉肌钙蛋白 CA 蛋白，其中包含四个结合钙的 EF 手基序。

在这项研究中观察到，100% 喂食 Pat 10 DS RNA 的伊利一林 15 B 动物在三天内瘫痪，没有产卵，导致致命的表型。请注意，尽管动物瘫痪了，但它们仍然可以移动头部肌肉来进食，如四个编码上的箭头标记的头部附近细菌的清除所指示的那样，这是一种在腹侧脊髓运动神经元中表达的同源结构域蛋白，是正确突触输入所必需的。在本研究中，选择 4 作为测试基因，因为它已被证明对以前的 DS RNA 喂养策略具有抗性。

这项研究的结果表明，与野生型动物相比，62% 的动物以文库制备物中表达 DS RNA 的细菌为食，这些动物在刺激头部时以正弦运动自由后退，UNC 四个无效突变体不会后退，而是紧紧收缩，导致背屈肌， 这通常会变得如此极端，以至于动物的头部和尾巴接触使身体处于盘绕位置。该表显示了当喂食针对四个测试基因中的每一个的 DS RNA 时表现出无效样表型的动物的百分比，每个敲低实验检查了 100 只动物。这些结果证明了质粒保留对 DS RNA 成功的重要性。

干扰筛选 在所有组织中都可以观察到稳健且高度渗透的功能丧失表型。当喂食给蠕虫的所有细菌都表达 DS RNA 一旦掌握，一个人可以在大约两个月内筛选整个饲养库。为了提高通量，我们只在补料筛选中对每个细菌克隆进行一次测试。

然后重新测试在第一次通过文库时鉴定出的任何基因。一式三份，我们坚持在所有重新测试中观察到所需的表型，以便将基因平方为阳性命中。然后从细菌中纯化质粒并进行测序以验证编码基因的身份。

一旦鉴定出基因，我们就会订购一个 L 突变体（如果有），并在对基因进行任何其他表征之前对其进行所需的表型测试。