Name: 在大规模的基因敲除 C。线虫使用双链RNA料库产生失去功能的鲁棒表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 38 s
Description: 了解使用双链RNA细菌文库在秀丽隐杆线虫中进行大规模RNA干扰筛选的优化方案。该方法通过防止质粒丢失确保基因敲除效率，为神经科学与遗传学研究提供可靠的高通量基因功能分析工具。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 MH097163 的资助。部分菌株由CGC提供，CGC由NIH研究基础设施项目办公室（P40-OD010440）资助。

<ol><li>Mello, C. C., Conte, D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+world+of+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Revealing the world of RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+RNA+silencing+from+C.+elegans+tissues+does+not+require+the+RNA+channel+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+of+C.+elegans+using+the+hypersensitive+rrf-3+strain+reveals+novel+gene+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions.</a> PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).</li>
<li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li>
<li>Sieburth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genes+required+for+synapse+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genes required for synapse structure and function.</a> Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), (2001).</li>
<li>Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+ploidy%2C+and+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Karyotype, ploidy, and gene dosage.</a> WormBook. , 1-9 (2005).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).</li>
<li>Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+synaptic+transmission+by+EGL-30+Gqalpha+and+EGL-8+PLCbeta%3A+DAG+binding+to+UNC-13+is+required+to+stimulate+acetylcholine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release.</a> Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).</li>
<li>Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Galphaq+regulates+egg-laying+behavior+via+a+PLCbeta-independent+and+serotonin-dependent+signaling+pathway+and+likely+functions+both+in+the+nervous+system+and+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle.</a> Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).</li>
<li>Lickteig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurotransmitter+vesicles+by+the+homeodomain+protein+UNC-4+and+its+transcriptional+corepressor+UNC-37%2Fgroucho+in+Caenorhabditis+elegans+cholinergic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons.</a> J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).</li>
<li>Terami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+organization%2C+expression%2C+and+analysis+of+the+troponin+C+gene+pat-10+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).</li>
<li>Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+collagen+SQT-3+has+complex+and+essential+functions+in+nematode+collagen+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly.</a> Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).</li>
<li>Brundage, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+C.+elegans+Gqalpha+gene+disrupt+movement%2C+egg+laying%2C+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability.</a> Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).</li>
<li>Gönczy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+cell+division+in+C.+elegans+using+RNAi+of+genes+on+chromosome+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III.</a> Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).</li>
<li>Miller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+unc-4+gene+encodes+a+homeodomain+protein+that+determines+the+pattern+of+synaptic+input+to+specific+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons.</a> Nature. 355, 841-845 (1992).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+Caenorhabditis+elegans+unc-4+gene+alter+the+synaptic+input+to+ventral+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons.</a> Nature. 355, 838-841 (1992).</li>
<li>Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+and+inducible+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+Wormgate+and+the+ORFeome%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome.</a> Gene. 359, 26-34 (2005).</li>
<li>Wani, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1+dopamine+receptor+signaling+is+modulated+by+the+R7+RGS+protein+EAT-16+and+the+R7+binding+protein+RSBP-1+in+Caenoerhabditis+elegans+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons.</a> PLoS One. 7 (5), e37831(2012).</li>
<li>Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+to+identify+postembryonic+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3442(2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们描述了一种利用 commercially available 的 dsRNA 饲喂文库在 C. elegans 中进行大规模筛选的实验方案。我们提供了复制该文库并有效使用它的全部操作步骤。我们证明，该方法能够鉴定出参与动物不同组织中多种生物学过程的基因。尽管本文所描述的表型易于观察（如 Unc、Egl 和 Dpy），但该方案可被调整用于搜索几乎任何生物学过程所必需的基因。例如，我们已利用该方案鉴定了线虫中神经传递所必需的基因25。当动物摄食表达 dsRNA 的细菌后（P0 筛选通常为 3 天，F1 筛选为 6–7 天），可将其从饲喂平板中移出，并检测其是否存在任何行为表型。
质粒丢失：
我们发现，在大规模 dsRNA 筛选中观察到的基因沉默效率降低可直接归因于喂食线虫的细菌中丢失了 dsRNA 质粒。质粒的丢失发生在细菌培养过程中，原因是 dsRNA 文库质粒编码的 β-内酰胺酶能够降解氨苄青霉素和羧苄青霉素，导致这些抗生素的浓度随时间逐渐降低。当抗生素浓度降至足够低时，不含质粒的细菌便能...

传统上，C. elegans 的遗传筛选是通过使用甲基磺酸乙酯等化学诱变剂处理线虫，从而在 DNA 中产生随机突变。随后分离经诱变处理的线虫的子代或孙代，筛选出具有特定异常表型的个体。然后通过耗时且繁琐的基因定位方法，或通过对突变线虫的全基因组进行测序，来确定导致该表型的突变位点。化学诱变筛选具有诸多优势，因其可在线虫基因组中产生永久性损伤，从而导致功能获得性或功能缺失性表型；但其基因定位过程较为缓慢且成本较高。
双链RNA干扰（dsRNAi）为鉴定参与重要生物学过程的基因提供了一种替代方法。该方法将与内源基因编码序列匹配的双链RNA导入线虫体内。该双链RNA被加工处理 体内 产生小分子（21-22个核苷酸）RNA，作为引导序列识别并结合互补的内源mRNA，从而靶向其降解 1该方法相对较快，但由于双链RNA（dsRNA）靶向的是mRNA而非DNA，因此使用此方法仅能观察到功能降低的表型。
将双链RNA（dsRNA）导入动物体内可通过直接注射dsRNA 2、将动物浸泡在dsRNA溶液中 3，或喂食表达dsRNA的细菌 4来实现。这些递送方法均可引起系统性的基因沉默效应，因为动物的大多数细胞都表达SID-1——一种能够摄取dsRNA的跨膜通道蛋白 5。最初，该技术被用作反向遗传学手段，逐个敲低单个基因的表达；随着两种喂食文库的开发，现已可进行大规模的遗传筛选。市面上可获得的dsRNA文库包含细菌克隆，分别覆盖了约55%或87%的全部C. elegans基因 6, 7。
遗憾的是，大规模 dsRNAi 饲喂筛选通常会导致基因敲低效率的差异8-10。尽管RNAi介导的基因敲低绝对水平难以直接测量，但在大规模筛选中观察到的敲低效率降低必然源于部分基因特异性mRNA未被RNAi机制降解而残留下来。这可能是由于在筛选过程中喂给动物的细菌丢失了表达dsRNA的质粒所致。支持这一观点的证据表明，当动物被喂食仅50%细菌表达靶基因dsRNA的混合菌液时，其基因敲低效果与对照组动物相比显著降低（甚至完全消失）11。在进行dsRNAi筛选时，基因敲低的程度成为一个关键问题，因为大多数 C. elegans 基因具有单倍充足性，因此基因表达水平必须至少降低50%，才能产生功能缺失表型12。
我们曾采用先前发表的饲喂方案进行大规模筛选，结果发现与他人报道的相同，基因敲低效果存在变异 8-10。在寻找可能原因的过程中，我们发现筛选中喂给线虫的细菌中近60%已丢失了dsRNA质粒。为此，我们开发了一种文库扩增与筛选方案，可显著减少甚至完全避免质粒丢失，从而大幅提高基因敲低效率。该方案适用于在C. elegans中开展大规模筛选，可用于筛选任意一种市售的dsRNA文库。采用此方案后，我们发现筛选过程中喂给线虫的细菌几乎100%均保留了编码dsRNA的质粒，并在所检测的所有组织中均引起强烈且高度完全的基因功能缺失表型。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>96孔Falcon平底板</td><td>Fisher Scientific</td><td>353072</td><td>无菌</td></tr><tr><td>粘性封口膜</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc omniplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>267060</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml深孔96孔聚丙烯Masterblock</td><td>USA Scientific</td><td>5678-0285</td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>深孔板盖</td><td>USA Scientific</td><td>5665-6101</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Combitips</td><td>USA Scientific</td><td>4796-5000</td><td>单独包装</td></tr><tr><td>储液槽</td><td>USA Scientific</td><td>2977-8500</td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7512</td><td>单独包装</td></tr><tr><td>dsRNA饲喂文库</td><td>OpenBiosystems</td><td>RCE1181</td><td>保存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td></td><td></td><td>允许2-4周交货时间 &lt;a href=&quot;http://www.biochemicaldirect.com&quot; target=&quot;_blank">www.biochemicaldirect.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>细菌学琼脂，超纯级A</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td>用于线虫培养板</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>压板滚轮</td><td>USA Scientific</td><td>9127-2940</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#8211;kel 96针复制器</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-9</td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>微型振荡器</td><td>Thomas Scientific</td><td>1231A93</td><td>3 mm轨道</td></tr><tr><td>12通道多道移液器（0.5-10 &amp;mu;l）</td><td>USA Scientific</td><td>7112-0510</td><td></td></tr><tr><td>12通道多道移液器（30-300 &amp;mu;l）</td><td>USA Scientific</td><td>7112-3300</td><td></td></tr><tr><td>Repeater Plus手动移液器</td><td>USA Scientific</td><td>4026-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 dsrna 饲喂文库在 c. elegans 中进行大规模基因敲低以产生稳定的基因功能缺失表型

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

通过喂食表达双链RNA（dsRNA）的细菌来实现线虫的RNA干扰，已成为研究C. elegans基因功能的有效工具。尽管在靶向少数基因进行基因沉默时该策略效果良好，但在大规模喂食筛选中，基因沉默效率存在较大变异，限制了其应用价值。我们对先前发表的RNAi基因沉默实验方案进行了系统分析，发现导致沉默效率降低的主要原因是喂食过程中细菌丢失了编码dsRNA的质粒。基于这些发现，我们开发了一种dsRNA喂食方案，可显著减少甚至消除质粒丢失，从而实现高效、高通量的基因沉默。我们证明，该方案可在包括神经元在内的多种C. elegans组织类型中产生强烈且可重复的基因沉默效果，并适用于大规模筛选实验。本方案使用 commercially available 的dsRNA喂食文库，并详细描述了文库扩增及开展dsRNA筛选所需的全部步骤。该方案无需使用任何复杂仪器，因此任何C. elegans实验室均可实施。

在用表达dsRNA的细菌饲喂动物2-3天后，P0基因敲低的表型将开始出现。一些早期表型包括幼虫停滞和致死，应在所有饲喂孔中观察到约2-3%的发生率。这些相同的表型也将在F1代动物中出现。F1代中未能孵化的卵是另一种常见的F1代表型，这三种表型合计将在F1代筛选的所有孔中接近10%的孔中被观察到。
我们采用此处描述的方案，检测了多个在P0和F1代表型中于多种组织类型中表达的基因的敲低效应。由于我们还想检测神经组织中的基因敲低效应，因此在筛选中使用了eri-1; lin-15B突变体。eri-1和lin-15B的突变，以及rrf-3的突变，最初是在筛选增强RNAi敏感性突变体的研究中被发现的8,13,14。
我们测试了四个基因的敲低效果：egl-30、dpy-17、pat-10 和 unc-4。其中两个基因 egl-30 和 unc-4</e...

尽管在C. elegans中通过喂食dsRNA是评估基因功能的有力工具，但现有的大规模喂食筛选方案常导致基因沉默效率不稳定。本文介绍了一种改进的大规模RNAi喂食筛选方案，可实现高效且可重复的基因表达沉默。

使用 dsRNA 饲喂文库在 C. elegans 中进行大规模基因敲低以产生稳定的基因功能缺失表型

通过喂食表达双链RNA的细菌使线虫产生RNA干扰，已成为评估秀丽隐杆线虫基因功能的有效工具。尽管该策略效果良好……

本实验的总体目标是利用细菌来源的双链RNA（dsRNA）喂养文库，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中进行大规模RNA干扰筛选，以实现基因表达的敲低。该过程首先培养来自dsRNA文库的细菌克隆；在防止质粒丢失的生长条件下，先对每个初级文库板进行复制，然后利用96孔复制文库板在琼脂OMNI平板上生成细菌的临时菌株。将这些 omni 平板中的细菌在液体培养基中过夜培养，随后转移至线虫饲喂平板表面。文库中的每个细菌克隆均携带一种独特的 D-S-R-N-A 编码质粒，可靶向敲低一个秀丽隐杆线虫基因。第二步是将同步化的线虫放置到饲喂平板上。接下来，将线虫在20摄氏度的湿润培养箱中培养数天。当线虫摄食细菌时，所诱导产生的双链RNA（DS RNA）会释放到动物肠道内，并进一步扩散至周围组织，从而引起系统性的基因沉默效应。最后一步是观察经喂食处理的线虫，检测由特定基因敲低所引起的表型变化。这些表型检测用于鉴定对所研究生物学过程重要的基因。与现有的方法（如将双链RNA显微注射到线虫性腺中）相比，该技术的主要优势在于其高通量性。利用饲喂文库，我们仅需数周时间即可检测几乎全部海鞘基因的生物学功能。许多实验室在使用这种基因敲低方法时遇到了困难，因为大多数基因和秀丽隐杆线虫（C. elegans）都是单倍剂量足够的。因此，RNA敲低必须将基因表达水平降低50%以上，才能产生功能缺失的表型。为了确保基因敲低效果显著，关键在于喂给线虫的所有细菌都必须表达双链RNA质粒。开始质粒丢失率测定实验时，按照各相关步骤所述，取少量细菌样品加入到 450 微升无菌水中。取 100 微升该稀释后的样品，用无菌水进行进一步的连续稀释。每次稀释之间需充分混匀溶液。将每种稀释液各100微升涂布于LB和LB AMP平板上，于次日在37摄氏度下过夜培养，找出含有100至500个细菌菌落的LB平板。计数该平板上的菌落数量，以及对应含有相同细菌稀释度的LB AMP平板上的菌落数量。使用此公式确定质粒丢失率。通过从 LB 平板上的菌落数减去 LB 氨苄平板上的菌落数，再除以 LB 平板上的菌落数并乘以 100，计算不含质粒的细菌百分比。为防止质粒丢失，需在高浓度碳酸菌素中培养细菌以实现有效基因沉默。在喂食动物前检查质粒丢失情况，仅当质粒丢失率低于 15% 时方可继续实验。本实验步骤首先从 −80 °C 冰箱中取出重复的文库平板，在菌体仍处于冷冻状态时撕去铝箔封口。更换培养板的塑料盖，将含有重复文库的培养板置于水平表面上，室温下解冻，时间不超过30分钟。对口腔拭子96针复制器进行灭菌：将其浸入乙醇浴中，随后点燃乙醇以灼烧灭菌。使用烧瓶和本生灯将接种针上的涂层烧尽。待火焰熄灭后，重复此操作。清洁的接种针在每次使用前应先用蒸馏水冲洗，然后进行灭菌处理。将灭菌后的复制器放入解冻的重复板的孔中，轻轻搅拌培养物。少量培养物会附着在复制器的针上。小心地将复制器从重复板的孔中取出，轻轻将针端向下放置在全能板表面。注意不要刺破琼脂表面。将复制器停留在 Omni 培养板表面三到四秒，使复制器针上的细菌转移到琼脂表面。为防止质粒在固体培养基上丢失，培养基中含有两毫克每毫升的 ate。碳酸盐琼脂。移去复制器，使少量细菌培养物被琼脂吸收。待两块平板均完成复制后。将 omni 培养皿倒置于 37 摄氏度下孵育 15 至 18 小时，次日进行后续操作。这些 omni 培养皿可用于接种 96 孔液体培养物，或在 4 摄氏度下保存最多七天。用于喂食线虫的细菌通过从 omni 培养皿中取菌制备液体培养物，使用重复移液器和 50 毫升排头，向每个 2 毫升培养管中分装 1 毫升细菌生长培养基。将96孔深孔板的深孔进行灭菌，然后将复制器灭菌，并将其放置在含有细菌菌落的omni板表面，确保每个针头均与96个细菌菌落中的每一个接触。小心地将复制器从omni板表面转移至深孔板中，注意针头在浸入培养基之前不要刮擦深孔的侧壁，以使细菌脱离并进入培养基中。缓慢地沿深孔板内壁以方形轨迹移动复制器。注意避免溅出，防止孔间交叉污染。每块96孔深孔培养板应包含两个对照孔。表达dsRNA的细菌作为预期基因敲低和表型的阳性对照，含空dsRNA载体的细菌作为阴性对照。使用无菌接种环，从阳性对照平板上挑取一个分离良好的单菌落，接种至深孔板中一个空孔内。记录接种菌落所在的孔位位置。对阴性对照重复上述操作。将深孔板置于37摄氏度的微型摇床上，以650转/分钟的速度水平振荡过夜。培养物经 overnight 培养后，将96孔深孔板中的细菌转移至12孔板中。每次可同时转移四个孔的培养物。将移液器吸头安装在12通道多通道移液器的每第三个通道上。从深孔板中吸取150微升细菌培养物，排加至12孔饲喂板的四个孔表面。转移过程中切勿刺破琼脂表面，否则线虫会钻入其中而无法摄食表达 dsRNA 的细菌。每转移完四个孔后，需更换为四个新的无菌移液枪头，再接种下四个孔。将接种好的培养板正立存放于暗处室温过夜，使细菌充分渗入琼脂。在将 L1 期滞育的秀丽隐杆线虫（C. elegans）幼虫转移至 dsRNA 细菌喂食板进行喂食筛选之前，完成上述步骤。必须确定先前制备的L1期停滞幼虫的浓度。轻轻摇动含有停滞L1期幼虫的锥形瓶，使动物均匀分布。然后吸取10 µL等分试样，逐滴加入未铺满的6 cm NGM平板上。在培养皿中央滴加四到五滴。确保将移液器中的所有培养基完全排出。用移液器吸头的末端将线虫悬液的液滴涂抹，形成一条贯穿培养皿直径的连续直线。使用解剖显微镜，在液体被培养板吸收且动物分散之前，从液滴一端开始计数所有动物，持续计数至另一端。为确保不遗漏任何个体，可能需要持续重新对焦解剖显微镜。重复此计数过程三次，每次使用 10 微升虫液样品，以确定每微升虫悬液中的平均蠕虫数量，并将该数值直接记录在三角烧瓶上。开始进食筛选实验时，使用 L1 停滞期幼虫的悬浮液和无菌水配制每毫升含 2000 条线虫的溶液。每块 12 孔进食板需要取 120 微升该线虫悬浮液，充分混匀以确保动物分布均匀，并将线虫转移至无菌储液槽中用于移液。使用多通道移液器，枪头安装在每三个位置处，将 10 微升线虫溶液直接转移至进食板的细菌菌苔上。注意不要刺破琼脂表面，以免线虫钻入琼脂中而无法摄食表达 D-S-R-N-A 的细菌。将线虫溶液转移至每两排喂食板后，需通过轻轻晃动储液槽重新混匀线虫溶液，因为线虫沉降迅速。操作初期应在解剖显微镜下检查少量孔，确保每孔含有 20 至 30 条线虫。所有喂食板加完线虫后，将培养板直立存放于湿润盒中，置于 20 摄氏度培养箱内。次日待线虫悬液完全渗入培养板后，将培养板倒置，并放回 20 摄氏度的保湿盒中继续培养。在这些培养板上的动物可在三天后观察P零代表型，六天后再次观察F1代表型。本实验方案用于检测四个基因的敲低效果：egg L 30、dumpy 17、PAT 10 和 on four egg L 30，以及 on four，其中部分基因在神经系统中表达。Pat 10 在体壁肌中表达，dumpy 17 在表皮细胞中表达。由于 Erie one Lin 15 B 突变体对 RNAi 具有增强的敏感性，因此在筛选中将其用作阴性对照。这些线虫被喂食含有空 PL 44 40 质粒的细菌，该质粒不表达 dsRNA，符合预期。喂食含有空质粒细菌的 Erie one Lin 15 B 动物未表现出任何形态学或行为学缺陷。这张照片显示了自由活动的动物，其正常的身体姿态为此提供了证据。黑色箭头指示一只年轻成年动物的位置。白色箭头指示一群已产卵的位置。该视频片段展示了线虫的正常行为。egg L 30 编码 G 蛋白亚基 Gαq 的秀丽隐杆线虫同源基因。当将表达针对 egg L 30 的双链 RNA（DS RNA）的细菌饲喂给 L1 期 Erie 1 Lin-15B 幼虫后，这些幼虫发育为成虫，表现出明显的运动和产卵行为缺陷。三天后，100% 摄入针对 egg L 30 的 DS RNA 的动物出现瘫痪，并无法产卵。该照片显示所有动物均呈现出麻痹动物特有的僵硬外观。还应注意，培养皿上完全没有产下的卵。Dumpy 17 编码一种海胆表皮形成所必需的胶原蛋白。elgan 和 dumpy 17 缺失突变体比野生型动物更短且更粗。本实验中，以 dumpy 17 D-S-R-N-A 饲喂的 P 零代动物未观察到形态学缺陷。然而，如本图所示，98% 的 F1 代动物表现出 dumpy 表型。请注意，图中箭头标记的野外成年动物比黑箭头标记的成年动物更短且更粗壮。在 A 图中，缺乏短而粗壮的 P 零动物表明，dumpy-17 基因功能在幼虫早期阶段对正常体态的形成是必需的。Pat-10 编码体壁肌钙蛋白 C 蛋白，该蛋白含有四个可结合钙离子的 EF 手模体。本研究观察到，喂食 Pat 10 DS RNA 的 Erie one Lin 15 B 动物中有 100% 在三天内出现瘫痪，且不再产卵，导致致死表型。需要注意的是，尽管动物已瘫痪，但其头部肌肉仍可活动以进行摄食，这一点可通过箭头所标记的头部附近细菌被清除的现象得以证实。four 编码一种在腹侧神经索运动神经元中表达的同源结构域蛋白，对正常的突触输入至关重要。本研究选择 four 作为测试基因，是因为此前的研究已证实其对多种 DS RNA 喂食策略具有抗性。本研究结果显示，与野生型动物相比，62%摄取了文库构建中四种表达dsRNA的细菌的动物表现出运动行为缺陷。野生型动物在头部受到刺激时会自由地以正弦波形式后退；而unc-4基因功能完全缺失的突变体不会后退，反而会强烈收缩身体，导致背屈反应，这种现象往往极为明显，致使动物头部与尾部相接触，身体呈盘绕状态。该表格显示了在分别针对四个测试基因喂食dsRNA后，表现出类似功能完全缺失表型的动物百分比，每次基因敲低实验均检测了100只动物。这些结果表明质粒的稳定维持对于dsRNA实验的成功至关重要。干扰筛选可在所有组织中观察到稳定且高度外显的功能丧失表型。当喂食线虫的全部细菌均表达双链RNA后，一旦掌握该技术，一个人大约可在两个月内完成整个喂食文库的筛选。为了提高通量，在喂食筛选中我们仅对每个细菌克隆进行一次测试。在初次筛选文库中鉴定出的任何基因都将进行重复验证。我们要求以三复孔进行重复实验，并且只有在所有重复测试中均观察到目标表型时，才将该基因确认为阳性结果。随后，从细菌中提取质粒并进行测序，以确认其所编码基因的身份。一旦鉴定出某个基因，我们会订购相应的突变体（若可获得），并在对该基因进行任何进一步表征之前，检测其是否具有预期的表型。

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