Name: 一种基于荧光的核酸外切酶测定法，用于表征人早衰样 WRN 核酸外切酶的直系同源物 DmWRNexo 及其在其他核酸酶中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学习基于荧光的核酸外切酶活性测定方法，用于分析WRN核酸外切酶的底物偏好和反应条件。该技术安全、可重复且成本低廉，适用于多种核酸酶研究。

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感谢跨理事会老龄化新动态计划对本工作的资助 [ES/G037086/1]，并感谢牛津大学生物化学系的 Dave Sherratt 教授提供使用 Fuji FLA-3000 的机会。

1. 底物寡核苷酸的制备
<ol>
	<li>合成定制寡核苷酸。
	<ol>
		<li>设计一条在5'端偶联荧光素分子的单链寡核苷酸；该链将作为每种底物的骨架。（注意：此设计适用于具有3'-5'外切酶活性的酶；若为5'-3'极性的外切酶，则应使用3'端偶联的骨架链。若极性未知，应同时测试3'和5'端偶联的骨架链。）</li>
		<li>设计互补链，使其与荧光标记的寡核苷酸退火后形成所需的一种或多种双链底物。注意：互补链不偶联荧光基团。订购时需注明采用PAGE纯化（仅脱盐纯化不够充分）。</li>
		<li>将寡核苷酸储备液以10 mM缓冲液配制为1 nmol/μl浓度，于−20 °C避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将标记的骨架寡核苷酸与各未标记的互补寡核苷酸按标记链:未标记链为1:1.2的摩尔比混合于缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 7.6，1 mM EDTA pH 8.0，50 mM NaCl）。（注意：理想比例为1:1，但更重要的是确保所有标记链均被结合。1:1至1:1.5的比例均可使用。）</li>
	<li>将水浴锅或加热块预热至95 °C，将退火混合物放入其中孵育3分钟，随后关闭加热源，使体系缓慢冷却（1 °C/min）至低于30 °C。</li>
	<li>通过跑原生10%聚丙烯酰胺凝胶（10% 19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺，溶于1×Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE，89 mM Tris碱，89 mM硼酸，2 mM EDTA），用0.05% w/v过硫酸铵（APS）和0.005% v/v TEMED引发聚合）检测标记寡核苷酸是否完全退火。通过磷屏成像仪检测结果（见下文第5节）。</li>
</ol>
2. 丙烯酰胺凝胶的制备
<ol>
	<li>设置凝胶制备系统 例如 Hoefer SE400 凝胶电泳仪，配备 16 cm × 18 cm 玻板和 1.5 mm 间隔垫片。
	<ol>
		<li>使用洗涤剂和水彻底清洗玻璃板和垫片。佩戴洁净手套，避免手指上的油脂再次污染玻璃板，以免影响凝胶的均匀形成。</li>
		<li>用大量蒸馏水（去离子水）冲洗平板，以去除洗涤剂残留，然后用无绒纸巾擦拭例如 Kimwipes）</li>
		<li>最后，用70%乙醇喷洒并擦拭——若玻璃板发出吱吱声，则表明其已清洁干净。将玻璃板直立放置，静置以使残留乙醇完全挥发。</li>
		<li>用蒸馏水清洗其余的凝胶制备设备（必要时先用洗涤剂），然后干燥。</li>
		<li>将玻璃板和垫片组装到凝胶成型装置中，确保系统不漏液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制所需浓度的聚丙烯酰胺凝胶溶液
	<ol>
		<li>对于核酸酶实验，使用含8 M尿素的1x TBE缓冲液配制的变性14%聚丙烯酰胺凝胶。</li>
		<li>配制100 ml溶液（足够制备2块凝胶，并有充足余量以应对泄漏）：取48.05 g尿素置于宽口烧杯中，加入35 ml 40% 19:1丙烯酰胺溶液和10 ml 10×TBE（890 mM Tris，890 mM硼酸，20 mM EDTA，用NaOH调节pH至8.3）。注意：请佩戴手套——丙烯酰胺为强效神经毒素。使用磁力搅拌子和磁力搅拌器搅拌溶解尿素（此过程需要一定时间）。</li>
		<li>溶解后，用去离子水定容至100 ml。使用0.22 μm滤膜过滤除菌。若不立即使用，可用抽滤装置短暂脱气，并避光保存（可维持数天）。切勿冷藏，否则尿素会析出沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚合并灌注凝胶。
	<ol>
		<li>取尿素-丙烯酰胺溶液，加入0.5 ml 10% (w/v) 过硫酸铵（APS，用蒸馏水配制）和50 μl TEMED。缓慢旋转容器以混匀，避免引入空气（空气会抑制聚合反应），随后立即倒入制胶装置中。操作需迅速，以免凝胶在倾注完成前过早凝固。</li>
		<li>根据凝胶装置和待分析样品数量，选择合适的梳子以形成加样孔 例如 15 齿或 29 齿的梳子适用于 Hoefer 胶装置。检查梳子齿下是否引入气泡。</li>
		<li>静置凝固，观察是否渗漏。由于与空气接触，梳子处的凝胶聚合会延缓。当加样孔已变得坚实时，其余部分的凝胶即已凝固。</li>
		<li>移除梳子，并用水和移液器冲洗未聚合的丙烯酰胺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备凝胶电泳装置。
	<ol>
		<li>将凝胶放入电泳装置中，并向底部电泳槽和凝胶加样孔中加入适量的1×TBE电泳缓冲液。此时凝胶已准备就绪，可进行上样。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. His标签重组DmWRNexo蛋白的制备
<ol>
	<li>DmWRNexo 蛋白的细菌表达
	<ol>
		<li>使用接种环从保存在 -80 °C 的甘油菌种中刮取细菌（细菌为 E. coli T7 Iq LysY（NEB）感受态细胞转化pIVEX2.3d-DmWRNexo质粒。将菌液涂布于LB琼脂平板（10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g NaCl、15 g琼脂溶于蒸馏水中定容至1 L，pH调至7.4）并添加50 μg/ml氨苄青霉素。37 °C倒置培养过夜。</li>
		<li>从平板中挑取单菌落接种于50 ml LB培养基（10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g NaCl，加蒸馏水定容至1 L）中，LB培养基中添加50 μg/ml氨苄青霉素（溶于水，经0.22 μm滤膜过滤除菌）。于37 °C、220 rpm振荡培养过夜。</li>
		<li>接种1.8 L（每份600 ml分装至三个2 L容器中）&#160;锥形瓶中加入含氨苄青霉素的LB培养基，并接入50 ml过夜培养物，确保充分通气，继续培养至OD600 ~ 0.8。加入IPTG至终浓度为0.7 mM，在26 °C下振荡培养4–8小时（以防止蛋白聚集）。</li>
		<li>8,000 rpm、4 °C 离心 10 分钟收集细胞沉淀——使用 6 个 500 ml 无菌塑料离心管，每管加入 300 ml 细胞悬液。弃上清，将沉淀重悬于少量原始 LB-amp 培养基（10 ml）中，转移至 15 ml Falcon 管，再以 5,000 rpm 离心收集细胞沉淀——再次弃去上清，将细胞沉淀于 -80 °C 冻存。&#160;（这有助于裂解）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌细胞裂解
	<ol>
		<li>配制3.2 ml裂解缓冲液，其中包含1 ml 5 M NaCl、1 ml 1 M DTT、200 μl 1 M苯甲脒和1 ml 10 mg/ml溶菌酶（溶于蒸馏水中）。</li>
		<li>向每份由300 ml细菌悬液获得的沉淀中加入320 μl裂解缓冲液。尽可能充分重悬，使用截断的p1000枪头，通过吹打并搅拌的方式进行。冰上孵育20分钟。再加入100 μl裂解缓冲液，充分混匀，然后尽可能将重悬的裂解液转移至微量离心管中（溶液将非常黏稠，难以移液）。</li>
		<li>在4 °C条件下，将裂解液于预冷的微量离心转子中以14,000 rpm离心30分钟，随后将上清液转移至洁净的微量离心管中：此上清液含有重组蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>His-trap 纯化
	<ol>
		<li>试剂的配制：为每种以下浓度的咪唑分别标记5个微量离心管：40 mM、60 mM、100 mM、300 mM 和 500 mM（例如 标记 40-1、40-2、40-3 等等。），用于收集柱层析组分。将离心管置于冰上并打开管盖（在准备其他试剂时，可用保鲜膜或类似材料松散覆盖以保持洁净）。使用1×PBS（8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，用蒸馏水定容至1 L，pH调至7.4，作为稀释液。</li>
		<li>将细菌裂解液用适量的2 M咪唑溶液调整至20 mM咪唑浓度&#160;M咪唑储备液，并将体积调整至至少1 ml（&#60;5 ml）使用 20 mM 咪唑进行洗脱。</li>
		<li>用带有鲁尔锁扣的5或10 ml注射器施加轻柔的手动压力，以10 ml MilliQ水洗涤1 ml His-Trap柱（Amersham），然后用10 ml含20 mM咪唑的PBS（见步骤&#160;3.3.1 上述）。</li>
		<li>将裂解液上样至层析柱。上样过程中可能会遇到明显的反向压力，这是完全正常的现象。切勿用力过猛推动注射器，应保持稳定且均匀的压力。裂解液进入层析柱时，通常可见轻微的颜色变化。用Sterilin离心管（7 ml容量）收集穿流液，并置于冰上保存。</li>
		<li>用10 ml 20 mM 咪唑溶液洗涤层析柱，并将洗脱液收集至预置冰上的25 ml通用管中，标记为“洗涤液”。</li>
		<li>将5 ml 40 mM 咪唑溶液通过层析柱，每管收集1 ml流出液至各微量离心管中（标记为40.1、40.2、40.3、 等等。：仔细观察注射器的推杆，以便准确量取1 ml。</li>
		<li>依次用 5 ml 的 60 mM、100 mM、300 mM 和 500 mM 咪唑溶液进行洗脱，每种盐浓度下收集 5 × 1 ml 的组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柱层析组分分析
	<ol>
		<li>点印迹：将每列组分（以及上样液、穿流液和洗涤液）各2 μl点样于硝酸纤维素膜上&#160;- 若预先用软铅笔绘制网格线会更方便。室温下自然晾干。将点印迹用含0.2%（v/v）吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS）配制的5%脱脂奶粉溶液在室温下封闭15分钟至1小时，随后用PBST缓冲液洗涤数次，并与HRP标记的抗His抗体孵育&#160;用 PBS-Tween 稀释 1:500，孵育 30–60 分钟。用 PBS-Tween 充分洗涤，再用 PBS 洗涤，随后采用增强型化学发光法（ECL）检测结合的抗体，并在 Hyperfilm MP 膜上显影。该点印迹法可在 SDS-PAGE 分析前清晰显示洗脱峰组分，必要时可为后续纯化步骤提供参考。例如 如果蛋白质稳定性存在问题，可根据点斑杂交结果合并洗脱峰组分，并直接上样至凝胶过滤柱（见下文步骤3.5）。</li>
		<li>SDS-PAGE：将每管柱洗脱组分各取50 μl，收集至已标记的微量离心管中，管内预先加入50 μl 2x SDS-PAGE上样缓冲液（4% w/v SDS，20% v/v甘油，120 mM Tris-HCl pH 6.8，含200 mM DTT）。将样品于95–100 °C煮沸5分钟（注意：若使用无加热盖的金属加热块，需用细针头注射器在每管管盖上刺一小孔，以防加热过程中管内压力积聚导致爆裂）。取每管洗脱组分10 μl上样，进行10% SDS-PAGE小型凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色，以确认主峰组分及蛋白纯度百分比。如有需要，还可通过SDS-PAGE分离蛋白后转至硝酸纤维素膜，进行His标签蛋白的Western印迹检测：用含5%脱脂奶粉的PBS-0.2% Tween 20封闭膜，随后洗涤并以HRP标记的抗His抗体（1:500稀释）孵育，操作同点印迹法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进一步提高纯度，可将 His-trap 柱的峰馏分合并后上样至 Superdex 75 凝胶过滤柱，并在盐浓度递增的条件下洗脱（如前所述 Boubriak&#160;等13 和&#160;梅森 等.14).</li>
</ol>
4. 核酸酶实验
<ol>
	<li>制备底物的工作液。
	<ol>
		<li>每次反应使用 20 pmol 底物（可根据具体研究问题进行调整），因此配制 200 pmol/μl 的工作液较为方便即 10倍浓度。工作液用少量退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.6，1 mM EDTA pH 8.0，50 mM NaCl）或不含盐和EDTA的10 mM Tris-HCl pH 7.0（可根据核酸酶要求调整至pH 8.5）配制，具体选择取决于酶的敏感性或所进行的实验类型。</li>
		<li>4 °C避光保存（用铝箔包裹）。底物可保持数周，双链完整性和荧光信号均无损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过比色分析或在吸收波长处进行紫外分光光度法测定外切核酸酶蛋白浓度260.
	<ol>
		<li>于 -80 °C 分装保存。</li>
		<li>若样本经历一次冻融，假设蛋白质错误折叠率为5%（或针对待检测的每种蛋白质通过实验确定该值），并相应调整浓度。</li>
		<li>经过两次冻融循环后，弃用该蛋白质进行外切酶活性检测，并在每次实验中记录蛋白质的状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计实验并计算样品的预混液（MM）用量。
	<ol>
		<li>配制一种混合液（MM），其中包含被测样品共有的所有组分（通常为除酶或底物以外的所有成分），以减少样品间的差异。</li>
		<li>配制 MM 时需考虑移液误差 例如 按 N 个样本的体积计算，制备足够用于 (N + 0.1N) 个样本的体积。</li>
		<li>在每个样品中设置总反应体积为 20 μl，包含 1 pmol 酶和 20 pmol 底物（在优化前默认条件——显然，具体用量需根据所测试内容进行调整） 例如 如果检测酶浓度的影响，则调整酶的用量。对于 DmWRNexo，通过实验确定其核酸酶活性的最适缓冲液含有 40 mM Tris-HCl pH 8.0、4 mM MgCl₂2，5 mM 二硫苏糖醇，含 0.1 mg/ml 分子生物学级 BSA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置反应体系。
	<ol>
		<li>将所有试剂置于 4 °C（冰桶或冷冻架）中保存。</li>
		<li>配制主混合液，并分装至适当数量的无菌无DNase的0.5 ml微量离心管中。设置无酶对照，以观察初始底物（未降解对照）。</li>
		<li>将热块设定至适合酶活性的适当温度（对于 DmWRNexo，37 °C 并以 30 分钟为终末时间点效果最佳，但该条件可能需通过比较所选酶在不同温度和时间下的活性来经验性确定）。应仔细检测缓冲液中常见潜在酶抑制剂的存在例如 EDTA 抑制 DmWRNexo，过量 ATP 也有同样作用14，可能是通过螯合 Mg2+ 对核酸酶活性至关重要）。请注意，即使咪唑浓度较高（&#62;300 mM）对 DmWRNexo 酶活性无影响，也不会淬灭荧光。</li>
		<li>配制STOP溶液（80%甲酰胺，1×TBE），此为3×储存液。根据需要可加入溴酚蓝等染料。室温保存。</li>
		<li>在加热块附近准备好以下物品：需最后加入反应体系的试剂（通常为酶）、1-10 μl移液器及吸头、计时器、冷冻管架或冰桶，以及终止液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始反应。
	<ol>
		<li>向第一支试管中加入酶后立即启动计时器。将试管放入加热块中。</li>
		<li>以适当的时间间隔向其余试管中继续添加酶。（对于仅需加入终止液即可完成的简单反应，15秒间隔已足够。）添加酶后立即放入加热块中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>终止反应。
	<ol>
		<li>当计时器到达指定时间（例如15分钟）时，向第一个样品中加入10 μl终止液，通过移液混匀，立即置于冰上或冷冻架中。</li>
		<li>继续按照反应体系建立的相同顺序，在适当的时间间隔终止反应，以确保每个反应的孵育时间完全相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品现已准备好上样至已制备的变性凝胶中。
	<ol>
		<li>使用凝胶加样枪头准确移取每个样品的一半（或全部）。在本反应所用寡核苷酸的浓度下，取一半反应产物即可获得良好的可视化结果，并可保留剩余样品用于重复实验。例如 如果初始凝胶电泳结果不正确。</li>
		<li>加入含有染料的1x STOP溶液非常方便（例如 溴酚蓝）在一条或多条泳道中，以确定凝胶的电泳情况。</li>
		<li>可将已知大小的荧光标记寡核苷酸与样品一同电泳，作为大小标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行凝胶电泳。
	<ol>
		<li>将上层电泳缓冲液室安装到凝胶装置上，并加入电泳缓冲液（1×TBE），确保样品不受扰动。检查是否有缓冲液泄漏。</li>
		<li>将凝胶电泳装置连接至电源，以200 V恒定电压运行150–200分钟，或直至溴酚蓝染料（若使用）迁移至凝胶约三分之二处（在此浓度凝胶中，其迁移位置与10 nt DNA大致相当）。注意监测缓冲液是否泄漏，以防造成电泳条带偏移或阻碍分离。</li>
		<li>停止电泳，将凝胶从电泳装置中取出。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 凝胶分析与成像
<ol>
	<li>确定所用成像仪的灵敏度， 例如 富士FLA-3000磷屏成像仪/荧光成像仪可使用473 nm蓝色激光检测荧光素的荧光信号，在灵敏度最高设置F1000及最小像素读取（分辨率）50 μm条件下进行成像。</li>
	<li>扫描凝胶。
	<ol>
		<li>移除间隔条和一块凝胶板，小心操作。用清水彻底但轻柔地冲洗另一块凝胶板上残留的凝胶，以去除析出的尿素痕迹，否则将干扰后续扫描。</li>
		<li>将凝胶板（凝胶仍附着）凝胶面向下放置于凝胶架的玻璃面上，并将其放入成像仪中。记录凝胶在玻璃面上的位置坐标（如果未覆盖整个表面）。</li>
		<li>在连接的计算机上打开相应的软件，扫描凝胶所在扫描区域的指定部位。使用步骤5.1中确定的最佳条件进行扫描。生成的文件将相对较大（数兆字节），但可根据需要对图像进行裁剪和压缩。</li>
		<li>保存，然后导出为可被分析软件读取的文件 例如 导出为 .tiff 格式，以便使用 ImageJ 进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析数据。
	<ol>
		<li>成功的外切核酸酶实验将导致底物沿寡核苷酸链向荧光素方向依次降解，从而在凝胶上形成特征性的梯状荧光DNA片段条带。在凝胶中迁移率较高的条带（迁移距离更远）比未降解的起始底物更小，因此代表了外切核酸酶降解的产物。</li>
		<li>使用 ImageJ 中的“Gels”工具，根据每条带中各物种的迁移率来量化其相对强度，以确定各样品中降解程度，从而评估外切核酸酶活性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
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<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

纯化蛋白外切酶活性的测定需要分析其DNA切割产物。通过聚丙烯酰胺凝胶分离标记的切割产物，可观察外切酶对DNA的连续切割过程。传统方法涉及使用放射性标记物对DNA底物进行末端标记。例如 32P 或 35S），但存在使用放射性标记固有的缺点（成本高、安全性问题以及随时间推移的不稳定性）。为克服这些问题，我们开发了一种采用荧光标记DNA底物的外切酶检测方法，并展示了该检测系统在测定WRN外切酶同源物核酸酶活性中的实用性 黑腹果蝇DmWRNexo10本检测方法的关键优势在于，荧光标记的底物在时间上具有稳定性，从而提高了实验的可重复性和标准化程度 例如 在比较不同批次纯化的重组外切核酸酶时，我们已利用该检测方法对DmWRNexo核酸酶活性进行了详细分析，从而确定了其核酸酶极性、持续性以及底物和阳离子偏好（另见13,14).
尽管该检测方法最初是为测定 DmWRNexo 及相关同源的 3'-5' DNA 外切核酸酶活性而开发，但它同样适用于具有相反极性的...

核酸酶在细胞中具有重要作用，包括清除受损的DNA、解析Holliday连接体等非双链结构，以及在DNA复制过程中提供校对功能，这种校对能力既可内源于DNA聚合酶本身，也可由其外在因子提供1核酸酶可通过从游离末端逐步降解DNA（外切核酸酶）或切割较长DNA分子内部的磷酸二酯键（内切核酸酶）发挥作用。核酸酶活性的丧失可导致高度特异性的基因组不稳定性表型。尽管RecQ解旋酶家族成员BLM发生突变会导致姐妹染色单体交换频率显著升高以及整体癌症发生率显著上升（由Payne和Hickson综述）2），WRN 蛋白的突变会导致早衰3；这两个家族成员之间最主要的区别在于WRN含有一个3'-5'外切酶结构域4. 对沃纳综合征（WS）患者基因型的分析已积累大量证据，表明WRN外切酶在维持基因组稳定性中发挥关键作用5，结合人类细胞中的点突变和缺失研究，并得到分离的外切酶结构域晶体学研究的支持6然而，WRN的外切酶活性与其核心解旋酶活性之间存在协同作用和相互交流7 使其难以区分每个功能域及其对基因组稳定性的相对贡献。在植物和低等后生动物中，WRN 外切酶活性存在于一条缺乏解旋酶活性的单一多肽链上8-10 （综述见于&#160;Cox 和 Boubriak11）；已在生物化学上证实 拟南芥 该外切酶与相应的WRN解旋酶协同作用，有效重建了在脊椎动物WRN中观察到的联合酶活性9我们已对WRN外切酶进行了研究 果蝇 由于优异的遗传工具允许在整体生物水平及发育过程中分析外切酶突变的影响（且不影响其假定的同源解旋酶）10,12此外，我们已克隆、表达并纯化了重组 果蝇 WRN 外切酶（DmWRNexo），可用于对其酶学特性进行全面的生物化学分析13,14.
核酸酶分析 体外 传统上使用放射性标记的寡核苷酸，通过观察丙烯酰胺凝胶上降解产物的梯状条带来评估降解情况4,8,15尽管此类检测方法具有较高的灵敏度，但由于标记底物的放射性衰变，其日间定量重复性较差。此外，放射性试剂的处理与处置会带来显著的环境和健康问题，且放射性标记物的获取也日益困难。一种近期的替代方法是通过质谱法测定最终降解产物的含量。16然而，该方法耗时较长（需数天），需要专用设备，且检测结果为终产物（单个核苷酸）的量，因此不适合对酶的持续性等敏感参数进行精确测量，也无法判断某些核苷酸、序列或修饰是否会导致核酸酶暂停或停止切割。为克服这些问题，我们改进了传统的基于凝胶的检测方法，采用荧光标记的寡核苷酸作为底物，制备出可长期稳定保存并可重复使用的标记底物，从而能够直接比较不同条件下核酸酶活性的差异。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>定制寡核苷酸</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>必须以高纯度获得这些寡核苷酸&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>荧光素-5' GAACTATGGCTCTC&lt;br/&gt; GAGTGCTAGGACATGTCTGA&lt;br/&gt; CTACGTACAAGTCACC - 3'</td></tr><tr><td></td><td></td><td>bubble</td><td>5'- GGTGACTTGTACGT&lt;br/&gt; AGTCAGACATGTCCTAGCAC&lt;br/&gt; TCGAGAGCCATAGTTC-3'</td></tr><tr><td>40% 19:1 丙烯酰胺溶液</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>注意：该物质为强效神经毒素，操作时必须始终佩戴手套</td></tr><tr><td>His-Trap 柱（1 ml）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>其他所有试剂</td><td>任一信誉良好的供应商</td><td></td><td>必须为分子生物学级别（无DNase）；微量离心管同样应无DNase和RNase</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hoefer SE400 凝胶电泳装置</td><td>Hoefer</td><td>SE400-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>FLA-3000（磷屏与荧光成像仪）</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Reader V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Gauge V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于荧光的外切酶检测方法用于表征人类早衰相关wrn外切酶的果蝇同源蛋白dmwrnexo及其在其他核酸酶中的应用

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN 外切核酸酶参与修复在 DNA 复制过程中或暴露于内源性或外源性基因毒素后发生的 DNA 损伤。它可能在防止重组中间产物的积累中发挥作用，这些中间产物通常会在暂时停滞的复制叉处积聚，这与缺乏 WRN 的细胞表现出的高重组表型一致。在人类中，外切核酸酶结构域是更大蛋白的N端部分，该蛋白还具有解旋酶活性，并含有对DNA和蛋白质相互作用重要的其他位点。相比之下，在果蝇（Drosophila）中，WRN 的外切核酸酶活性（DmWRNexo）由一个与推测的解旋酶不同的遗传位点编码，从而允许对外切核酸酶活性在基因组稳定性机制中的作用进行生化（和遗传）分析。在此，我们展示了一种荧光方法，利用纯化的重组 DmWRNexo 蛋白和末端标记的荧光寡核苷酸来测定 WRN 外切核酸酶活性。该系统比放射性检测具有更高的可重复性，因为底物寡核苷酸可稳定保存数月，同时提供一种更安全且相对快速的方法，用于对外切核酸酶活性进行详细分析，可确定其切割方向性、持续性和底物偏好性。

执行 体外 除了实际分析外，外切酶活性分析还需要进行多项 preparatory 步骤。各步骤的概览如图所示。 图1. 
在进行基于荧光的外切酶活性检测之前，必须优化尿素-丙烯酰胺凝胶分离后荧光标记寡核苷酸底物的检测条件，使用合适的荧光成像系统以获得最佳结果。滤光片的选择至关重要，因为它会显著影响整个检测的灵敏度——我们的寡核苷酸底物采用荧光素标记，因此需要能够支持470 nm激发光和520 nm发射光的滤光片。使用该滤光片时，可通过调整成像仪的灵敏度和分辨率，增强对低浓度底物（或产物）的检测能力（图2A 和 2B）。需要注意的是，滤光片带宽具有一定容差，即使使用非最优滤光片（激发520 nm/发射580 nm），仍可实现对底物的部分检测，但灵敏度显著降低（图2C）。我们建议选择适当的标记寡核苷酸浓度和成像仪设置，以确保底物信号稳定可检（图2B 及 图2 右侧图中...

外切核酸酶在维持基因组稳定性方面发挥着关键作用。WRN外切核酸酶功能的缺失会导致早衰。研究该核酸酶的底物及其他需求因素 体外 有助于阐明其作用 体内在此，我们展示了一种快速且可重复的基于荧光的检测方法，用于测量其核酸酶活性。

一种基于荧光的外切酶检测方法用于表征人类早衰相关WRN外切酶的果蝇同源蛋白DmWRNexo及其在其他核酸酶中的应用

WRN 外切酶参与修复在 DNA 复制过程中或暴露于内源性或外源性基因毒素后产生的 DNA 损伤。

本实验采用一种稳定且可重复的基于荧光的检测方法来测定外切核酸酶活性。将纯化的酶与荧光标记的DNA底物共同孵育，使酶逐步降解DNA。随后通过含尿素的丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA，按大小区分降解产物。接下来，使用荧光成像技术来鉴定并量化外切核酸酶活性的程度。分析结果可确定酶的偏好性底物反应条件、过程性活性及总体活性。与现有的基于放射性的技术相比，该技术的主要优势在于DNA底物稳定性高，可长期保存，从而实现良好的可重复性，降低成本并提高安全性。首先，加入适量的 2 摩尔/升 emit ole 储备液，将细菌裂解液调整至 20 毫摩尔/升 ole。然后使用 20 毫摩尔/升 ole 洗涤液将体积调至至少 1 毫升。使用 1 毫升 hist trap 柱，先以 10 毫升超纯水进行预处理。随后用 10 毫升 20 毫摩尔/升 ole 平衡层析柱。接下来，将裂解液上样到层析柱中。在上样过程中，可能会遇到明显的反压，这是完全正常的现象。切勿用力过猛地推动注射器，应保持稳定且均匀的压力。当裂解液进入层析柱时，通常会观察到轻微的颜色变化。用无菌的七毫升容量 BijU 瓶收集穿流液，并置于冰上保存。然后用 10 毫升 20 毫摩尔的 EMIT Ole 缓冲液洗涤层析柱。现在将5 mL的40毫摩尔碘溶液通过层析柱。仔细观察注射器的活塞，以量取每1 mL的洗脱液，并分别收集到各微量离心管中。同样地，依次将每种浓度的碘溶液各5 mL依次通过层析柱，每次均收集5份1 mL的洗脱液。通过点斑印迹法检测各组分，并使用HRP标记的抗his抗体进行杂交，以确定峰值组分。所有试剂均需保持在4°C，将主混合液分装至无菌、无DNA的0.5毫升微量离心管中，同时设置无酶对照，以便观察初始底物。现在将加热模块设置为适合酶活性的温度。准备含有终止液的 IDE，并在室温下保存。整理加热模块附近的实验区域，包括反应中最后需加入的试剂。使用一支1至10微升的移液器，配备吸头、计时器、冷冻管架或冰桶以及终止溶液。在向第一支试管中加入酶时启动计时器，并将该试管立即放入加热块中。随后每隔15秒依次向其余试管中加入酶，并在计时器到达相应时间点时立即将各试管放入加热块中。向第一个样品中加入10 µL终止液，通过移液混匀，立即置于冰上。按照反应体系建立的相同顺序，在相应的时间间隔依次终止反应，以确保每个反应的孵育时间完全相同。将每个样品的一半或全部上样至丙烯酰胺凝胶中，在其中一条或多条泳道中加入含有染料的1×终止缓冲液，以监测电泳运行情况。电泳结束后，取下垫条和一块凝胶板。小心冲洗并彻底擦拭凝胶板，以去除析出的尿素残留物。将带有凝胶的一面朝下放置在凝胶支架的玻璃面上，必要时将其放入成像仪中。记录凝胶在玻璃板上的位置坐标。打开相应的软件，并根据文本方案中详述的条件，扫描指定区域的成像范围。对图像进行裁剪并压缩数据。如有需要，可先保存，然后导出为文件以进行分析。进行体外外切酶活性分析需要多个准备步骤。除了进行这些基于荧光的外切酶检测的实际分析外，优化荧光成像系统的检测也至关重要。例如，对于荧光素标记的寡核苷酸底物，需要使用一种允许在470纳米激发、520纳米发射的滤光片。使用该滤光片，可通过调整成像仪的灵敏度和分辨率，提高对底物或产物低浓度的检测能力。需要注意的是，滤光片的带宽具有一定容差范围。尽管使用非最优的滤光片仍可实现对底物的部分检测，但灵敏度会显著降低。通过选择合适的标记寡核苷酸浓度与成像仪设置组合，可实现对底物的稳健检测。这一点至关重要，因为当底物与有活性的外切核酸酶共孵育后，其降解产物会在每条带中以较低的量存在，原因是底物已被逐步切割成片段。成功的外切核酸酶实验将导致底物向花序方向依次降解，产生具有特征性的梯状DNA条带，代表外切核酸酶的降解模式。在检测条件优化后，该实验可用于定性和定量地检测不同的酶活性。例如，可检测核酸酶突变体相较于野生型蛋白是否存在活性。也可测试不同底物是否可被该核酸酶降解。正在研究中。该体外实验可用于检测目标核酸酶的底物特异性和反应过程。

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