使用氢交换质谱分析蛋白质动力学

以下实验的总体目标是分析蛋白质的确认灵活性及其响应环境、配体结合或蛋白质蛋白质相互作用的变化。这是通过在怀疑会影响蛋白质确认（例如配体结合）的不同条件下预孵育目标蛋白质来实现的。然后将反应混合物稀释到氧化氘中，孵育不同的时间间隔，随后通过液相色谱质谱分析以确定氘掺入肽骨架的程度。

酰胺基团，因为保护区减少了氘的掺入，在不存在和存在结合伴侣的情况下比较实验的肽谱揭示了由于质子和氘之间的重量差异，谱的 OID 发生了变化。在添加结合伴侣后表现出突出保护的区域是潜在的结合位点。根据序列覆盖率和重叠肽的可用性，结合位点可以缩小到几个氨基酸。

这种方法可以帮助回答蛋白质折叠和蛋白质动力学领域的关键问题，例如蛋白质如何折叠、如何展开、它们如何对温度升高或重金属等物理和化学影响做出反应。类比结合和蛋白质-蛋白质相互作用如何影响蛋白质的确认。对于蛋白质药物的开发，验证正确折叠和一般质量控制也非常重要。

一般来说，刚接触这种方法的人可能会遇到一些困难。例如，如果蛋白质没有被胃蛋白酶很好地消化，则序列覆盖率会很低。如果蛋白质非常容易聚集，则可能会在孵育期间或添加淬灭缓冲液后聚集，从而导致质谱仪中的信号强度较低。

在本演示中，我们将使用氢交换质谱法研究酵母分子伴侣 HP 90 与其 cos 伴侣 Sty one 的结合 STY one 与 HP 90 结合，并通过抑制 HB ninety 的 ABA 活性促进客户结合。按照文本方案中的详细说明，从制备缓冲液、样品和珠子开始此过程。要准备用于酰胺氢交换的色谱柱，请拧下保护柱的一侧并拧紧过滤器。

将填料漏斗拧到色谱柱的开口端。使用第 16 英寸适配器将空的 5 mL 注射器连接到色谱柱的底部出口。确保将其气密固定在保护柱上。

漏斗顶部滴几滴浆珠材料。拉动注射器的柱塞，将浆液通过漏斗吸入保护柱中。在漏斗上涂抹更多的浆珠材料，并继续该过程，直到保护柱完全充满珠状材料。

然后取下漏斗，然后将过滤器和过滤环紧紧地放在开口端。将色谱柱盖拧到保护柱上，然后从另一侧取出注射器。用塞子关闭保护柱的两端。

为避免色谱柱材料变干，设置用于氢交换质谱的系统。首先，将捕集柱连接到高效液相色谱或 HPLC 系统。将泵 A 的流速设置为 0.4 mL/min，以 0.1% 甲酸为溶剂，以平衡色谱柱。

校准质谱仪后，将 HPLC 的出口连接到质谱仪的离子源。要首先测定肽，请将 Pepin 色谱柱连接到系统，然后将分析柱连接到系统。通过选择梯度类型和质谱方法，在控制软件中设置色谱和质谱的参数。

选择较长的梯度以确保良好的色谱分离度。在质谱仪上启用串联质谱。在 100 微升 H 2 L 缓冲液中制备 100 至 200 pomo 的热休克蛋白 90 或 HSP 90。

加入 100 微升淬灭缓冲液，上下吹打混合。使用 Hamilton 注射器将 200 μL 样品注入进样阀的进样口。将进样阀切换到进样位置并启动色谱程序。

接下来，通过在数据库中搜索所得肽来鉴定热休克蛋白 90 的消化肽。通过添加冰水将系统温度降低到零摄氏度。在没有串联质谱法的情况下，使用将用于实际氢交换实验的梯度重复此步骤。

对于热休克蛋白 90 和 STI one，使用从 90% 溶剂、10% 溶剂 B 到 45% 溶剂、A 55% 溶剂 B 的 10 分钟梯度，确定所用梯度中鉴定出的消化肽的保留时间，并创建一个包含肽序列、肽电荷、状态和保留时间的列表。这将用于在氢交换实验后识别每种肽。要鉴定蛋白质蛋白质相互作用界面，首先设置梯度和质谱方法。

在控制软件中，使用从 90% 溶剂、10% 溶剂 B 到 45% 溶剂的 10 分钟线性梯度。55% 溶剂 B 上样质谱方法，该方法针对 300：1， 500 质荷比之间的检测进行了优化，但大多数肽段将低于 1000 质荷比。将进样阀设置到负载位置和六通阀。

在上样脱盐位置，将上样泵的流速设置为 0.4 mL/min。按照文本方案中的说明运行未更改的参比和 100% 对照样品后，制备 20 至 100 皮摩尔的热休克蛋白 90，体积为 1 至 5 微升。添加温度调整的氧化氘缓冲液，使样品体积达到 100 μL，并按照文本方案中先前定义的确切时间孵育。

在确定交换的动态范围时，然后加入 100 微升冰冷，淬灭缓冲液，上下移液两次，快速将 200 微升注入 HPLC 的进样阀中。将进样阀切换到进样位置，并立即启动色谱程序。两分钟后，将六通阀从脱盐上样位置切换到洗脱位置。

对每种蛋白质单独执行此作，以确定在没有相互作用蛋白的情况下掺入每个肽中的氘子，以确定相互作用表面将热休克蛋白 90 与至少两倍过量的 STI 混合，以将平衡转变为结合状态，孵育所需的温度直到复合物形成处于平衡状态。孵育后，加入温度调节的氧化氘缓冲液，使样品体积达到 100 μL，并孵育一段规定的时间。然后加入 100 微升冰冷淬灭缓冲液，上下移液两次，快速注入蛋白质并像以前一样运行。

使用合适的软件分析采集的数据，并使用确定的保留时间找到分析中的每种肽。计算未改变蛋白质和氢交换实验的同位素分布的 OID，比较单独靶蛋白的掺入与过量的结合伴侣的掺入。这可以使用商业软件自动完成，也可以使用电子表格程序 M 手动完成，通过比较氧化氘标记后不存在和存在 HS P 90 的 STI one 肽谱来测试 HS P 90 和 STI one 之间的直接蛋白质相互作用。

所得差异图显示，TPR 2 A 和 TPR 2 B 中的大多数肽在 HS P 90 存在下表现出很强的保护作用，表明这些区域与 HS P 90 相互作用。TPR two A 中的保护可以很容易地从 STY one TPR two A TPR 2 B 与 HS P 90 肽的复合物的晶体结构中合理化，HS P 90 肽根据受 DEUTERO 掺入保护的淀粉样质子的数量着色。在蛋白质蛋白质相互作用中并不总是观察到如此明显的保护。

HSP 90 在 STI one 存在下的保护作用不如 STI 1 那么明显，也不像 STI 1 那样局限。所有肽都显示出对 deutero 掺入的保护略有增加。这里显示的是酵母 HS P 90 的卡通表示，根据受保护的 amli 质子的数量进行着色，防止氘掺入，STY one 在全球范围内稳定 HS P 90，因为在其存在下，蛋白质的任何区域都没有显示出更大的灵活性。

目前尚不清楚这种减少的氘掺入是源于与 sty one 的直接相互作用还是通过变构效应。在确认 HSP 90 连续标记、氢交换、质谱法研究不同蛋白质区域的动力学后。此处显示的是来自 HSP 90 核苷酸结合域的肽 43 至 62 的光谱。

在存在和不存在 STI one 的情况下，肽谱显示氘的时间依赖性掺入，随着孵育时间的延长而增加。保护程度在整个孵化时间内发生变化，在较短的孵育时间下表现出更大的差异，在最长的时间点表现出几乎相似的汇率。这表明稳定性较低或动态相互作用的区域具有频繁的解离和解离。

在尝试此过程时，重要的是要记住保持条件一丝不苟地恒定，并在开始交换反应之前准备好一切。按照此程序，可以使用其他方法回答其他问题，例如蛋白质复合物中相互作用位点的位置。