Name: 使用氢交换质谱分析蛋白质动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T15:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学习氢交换质谱技术用于分析蛋白质构象动态变化及配体结合效应。该方法通过液相色谱质谱联用测定氘掺入程度，帮助研究人员精确定位蛋白质相互作用界面并深入理解蛋白质功能机制。

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感谢 M. Boysen 对手稿提出的建议。本项目由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助（SFB638 和 MA 1278/4-1 至 M.P.M.，以及卓越集群：CellNetworks EXC 81/1）。M.P.M. 是卓越集群 CellNetworks 的研究员。

1. 缓冲液和蛋白质样品的制备
<ol>
	<li>制备 H2O缓冲液。使用Hsp90标准缓冲液（40 mM HEPES/KOH，pH 7.5，50 mM KCl，5 mM MgCl₂）2，10% 甘油）作为 H2O缓冲液 
	注意：如果样品在分析前经过透析，则使用透析缓冲液作为 H2O缓冲液。D的缓冲液至关重要2O缓冲液与H不同2仅在氢同位素中使用O缓冲液。挥发性缓冲液如NH4CO3 或 NH4-乙酸盐或缓冲液组分不适用！</li>
	<li>制备 D2使用真空浓缩仪通过冻干Hsp90标准缓冲液制备O缓冲液。H完全蒸发后2O 加入纯 D2O 加入试管中，以达到初始总体积（例如 含15%甘油的1 ml缓冲液需要加入850 μl D2O). 重复完全蒸发缓冲液，并将缓冲液/盐成分重新溶解于 D2O 2x.</li>
	<li>制备淬灭缓冲液（0.4 M KH2PO4/3PO4 pH 2.2 
	注意为了提高对非常稳定蛋白质的胃蛋白酶消化效率，可添加4 M盐酸胍和0.5 M三(2-羧乙基)膦（TCEP-HCl）。</li>
	<li>制备100%对照样品（6 M 盐酸胍，D2O). 向一份 Hsp90 样品中加入盐酸胍，使其终浓度达到 6 M。将 H 完全蒸发2从样品中取出 O 并加入 D2加水至管中，以达到初始总体积（例如 含10%甘油的100 μl样品需加入90 μl D2O). 重复进行缓冲液的完全蒸发，并将缓冲液/盐成分重新溶解于 D2O. 
	注意每次进样需要 20–100 pmol 样品。应制备足够的样品，以确保每进行一天氢氘交换质谱（HX-MS）实验都设有 100% 对照。</li>
	<li>在5 μl Hsp90标准缓冲液中配制50 pmol Hsp90。 
	注意每次原始数据采集需要 20–100 pmol 的样品量。反应体系中的样品体积理想范围为 1–5 μl。请调整样品浓度以满足上述要求。可使用任何缓冲液，只要不含去污剂或挥发性成分即可。</li>
</ol>
2. 醛活化微珠上固定化胃蛋白酶的制备
<ol>
	<li>将80 mg新鲜胃蛋白酶溶解于2 ml 50 mM柠檬酸钠溶液（pH 5）中。</li>
	<li>将20 mg氰基硼氢化钠小心溶解于1 ml 2 M Na2SO4中（剧毒！），然后加入胃蛋白酶溶液中。</li>
	<li>室温下轻轻振荡（例如顶置式摇床）孵育混合物10分钟。</li>
	<li>向混合物中加入600 mg带有固定化醛基的磁珠，室温孵育5–10分钟。</li>
	<li>在一小时内，每隔3分钟加入100 μl 2 M Na2SO4（pH 5），共加入2.2 ml，以缓慢盐析出胃蛋白酶。每次加样间在室温下使用顶置式摇床轻轻混匀样品。</li>
	<li>将胃蛋白酶磁珠在4 °C下于顶置式摇床上孵育14–16小时（过夜）。</li>
	<li>加入1 ml 1 M乙醇胺以终止反应，并在室温下孵育2小时。</li>
	<li>在50 ml离心管中以500 rpm离心收集磁珠，弃去上清液，用0.1%甲酸重悬磁珠，重复此步骤两次。最后一次离心后，弃去上清液，估计磁珠体积，加入等体积的0.1%甲酸，于4 °C保存。</li>
</ol>
3. 酰胺氢交换柱的制备
<ol>
	<li>使用内径为 1 mm 的保护柱用于捕获柱，内径为 2 mm 的保护柱用于胃蛋白酶柱。</li>
	<li>拧开保护柱的一端，取下滤片。将装填漏斗紧密地拧在柱子的开口端。使用 1/16&#160;英寸接头和管路将一个空注射器（5 ml）连接到柱子的底部出口。确保其与保护柱之间密封，防止漏气。</li>
	<li>在漏斗顶部加入数滴浆状珠粒材料。拉动注射器活塞，将浆液从漏斗吸入保护柱中。继续向漏斗中添加浆状珠粒材料，并重复操作，直至保护柱完全填充珠粒材料。取下漏斗，将滤片和滤环放置在开口端，然后将柱帽紧密拧上。从另一端取下注射器。用堵头封闭保护柱的两端，以防止柱内材料干燥。</li>
</ol>
4. 氢交换质谱（HX-MS）系统的设置
<ol>
	<li>将捕获柱与高效液相色谱系统连接（图1）。使用含0.1%甲酸的溶剂，将泵A的流速设为0.4 ml/min，以平衡色谱柱。此时暂不连接胃蛋白酶柱和分析柱。</li>
	<li>校准质谱仪，并将高效液相色谱系统的出口与质谱仪的进样源连接。</li>
</ol>
5. 交换动态范围的测定
<ol>
	<li>制备超纯溶剂 A（含 0.1% 甲酸的水溶液）和超纯溶剂 B（含 0.1% 甲酸的乙腈溶液）；预混溶剂可商业购买。对 HPLC 泵进行排空。在控制软件中设置色谱和质谱方法，选择一个在短暂脱盐步骤后采用阶梯梯度的程序。对于全长 Hsp90，使用 1–2 分钟的脱盐步骤，随后将六通阀从 DESALT/LOAD 切换至 ELUTE 位置，并实施从 90% 溶剂 A / 10% 溶剂 B 到 5% 溶剂 A / 95% 溶剂 B 的阶梯梯度。进样前，将进样阀置于 LOAD 位置，六通阀置于 DESALT/LOADING 位置。 
	注意：本实验中不得使用胃蛋白酶柱或分析柱。</li>
	<li>将 100–200 pmol 的 Hsp90 溶于 1–10 μl H2O 缓冲液中，30 °C 孵育 10 分钟。加入温度已平衡的 D2O 缓冲液，使样品体积达到 100 μl，并精确孵育一段定义的时间（例如 10 秒、100 秒、1,000 秒）。加入 100 μl 淬灭缓冲液，通过移液器上下吹打混合。使用 Hamilton 注射器将 200 μl 样品注入进样阀的进样口。启动色谱程序，并将进样阀切换至 INJECT 位置。2 分钟后，将六通阀从 DESALT/LOADING 切换至 ELUTE。至少重复三个时间点的操作。</li>
	<li>重复步骤 5.2，但在 30 °C 孵育 10 分钟前，向 Hsp90 样品中加入 2–3 倍过量的 Sti1。</li>
	<li>通过质谱软件对谱图进行去卷积，确定全长蛋白的分子质量。通过比较每次运行后（例如 10 秒、100 秒、1,000 秒）全长 Hsp90 的理论分子量与实测质量，计算掺入的氘代质子数。</li>
	<li>绘制 Hsp90 在无 Sti1 和有 Sti1 存在下掺入的氘代质子数（y 轴）随时间（x 轴）变化的曲线。确定在动态范围内两条曲线差异最大的时间点。在肽段水平上鉴定 Hsp90-Sti1 相互作用界面及动力学时，使用该时间点作为 D2O 孵育的孵育时间。</li>
</ol>
6. 使用 MS/MS 谱图测定胃蛋白酶肽段
<ol>
	<li>将胃蛋白酶柱和分析柱连接到系统上。</li>
	<li>在控制软件中设置色谱和质谱参数，选择梯度类型和质谱方法。选择较长的梯度（例如 超过90分钟），以确保良好的色谱分辨率。在质谱仪上启用MS/MS谱图。 
	注意： 此步骤中，HPLC的良好分辨率和高质谱准确性为最优先考虑因素。</li>
	<li>将100–200 pmol的Hsp90溶于100 μl H2O缓冲液中。加入100 μl淬灭缓冲液，并通过上下吹打混匀。使用Hamilton注射器将200 μl样品注入进样阀的进样口。启动色谱程序，并将进样阀切换至“INJECT”位置。2分钟后，将六通阀从“DESALT/LOADING”切换至“ELUTE”位置。 
	注意：若在HX-MS中需分析多个蛋白质（即 蛋白质-蛋白质相互作用界面），则每种蛋白质的肽段需单独确定。</li>
	<li>通过搜索数据库（例如 Mascot）鉴定Hsp90的胃蛋白消化肽段。 
	注意：可使用自定义数据库，因为目标是尽可能多地鉴定胃蛋白消化肽段，且分析使用的是纯化后的蛋白质。需考虑样品纯度。</li>
	<li>重复此步骤，但不进行MS/MS检测，并采用实际HX实验所用的梯度。对于Hsp90和Sti1，使用从90%溶剂A/10%溶剂B到45%溶剂A/55%溶剂B的10分钟梯度。 
	注意：梯度时间通常为5–15分钟，具体取决于样品复杂性和HX系统的性能参数。</li>
	<li>确定在步骤6.4中鉴定出的胃蛋白消化肽段在步骤6.5所用梯度下的保留时间，并创建一个包含以下信息的列表：1）肽段序列；2）肽段电荷态；3）保留时间。该列表将用于HX实验后各肽段的鉴定。 
	注意：需注意，质荷比（m/z）差异较小、电荷态相同且保留时间相同的肽段可能引起鉴定歧义。</li>
</ol>
7. 蛋白质-蛋白质相互作用界面的鉴定
<ol>
	<li>在控制软件中设置梯度和质谱方法。使用10分钟线性梯度，从90%溶剂A/10%溶剂B逐渐变为45%溶剂A/55%溶剂B。载入一种优化用于检测300–1,500 m/z范围内质荷比的质谱方法，尽管大多数肽段的质荷比将低于1,000 m/z。将进样阀置于LOAD位置，六通阀置于LOADING/DESALTING位置。设置加载泵的流速为0.4 ml/min。 
	注意梯度的长度和类型取决于样品，可能需要进行优化。较长的梯度可提高色谱分辨率，但由于反向交换会降低蛋白质中氘的掺入程度。所有待比较的实验所采用的方法必须保持一致。</li>
	<li>对于未交换的参照样品，在 100 μl H2O缓冲液。加入100 μl预冷的淬灭缓冲液，轻轻吹吸混匀两次，将样品注入HPLC进样阀。立即启动色谱程序，并将进样阀切换至“进样”（INJECT）位置。2分钟后，将6通阀从“脱盐/上样”（DESALT/LOADING）切换至“洗脱”（ELUTE）位置。对Hsp90、Sti1分别以及蛋白混合物均需进行上述操作。</li>
	<li>准备20-100 pmol的Hsp90，溶于1-5 μl体积中。加入温度已调节的D2O缓冲液将样品体积补至100 μl，并精确孵育一段定义的时间（例如 30 秒；构象动力学见 注意加入100 μl预冷的淬灭缓冲液，用移液器吹打混匀2次，迅速将200 μl样品注入HPLC进样阀。立即启动色谱程序，并将进样阀切换至“INJECT”位置。2分钟后，将六通阀从“DESALT/LOADING”切换至“ELUTE”位置。每种蛋白质需单独处理，以测定在无相互作用蛋白存在时各肽段的氘代掺入水平。 
	注意研究构象变化动力学时，用 Hsp90 在 D 中不同的孵育时间重复实验2O缓冲液。通过选择对数间隔的孵育时间，以覆盖较宽的时间尺度（例如 10 秒，30 秒，100 秒，300 秒，1,000 秒 等等。）。D2O缓冲液和样品缓冲液必须完全相同，仅氢同位素不同。</li>
	<li>制备等量的100%对照样品（20–100 pmol），并加入D2O缓冲液将样品体积调至100 μl。加入100 μl预冷的淬灭缓冲液，轻轻吹打混匀2次，迅速将200 μl样品注入高效液相色谱（HPLC）的进样阀。立即启动色谱程序，并将进样阀切换至“进样”（INJECT）位置。2分钟后，将六通阀从“脱盐/上样”（DESALT/LOADING）切换至“洗脱”（ELUTE）位置。</li>
	<li>为了确定Hsp90与Sti1的相互作用界面，需将Hsp90与至少2倍摩尔过量的Sti1混合，以使平衡向结合状态偏移（参见 注意）并在所需温度下孵育，直至复合物形成达到平衡。加入经温度调节的D2O缓冲液补足样本体积至100 μl，并精确孵育指定时间（例如 30 秒）。加入 100 μl 冰冷的淬灭缓冲液，用移液器吹打混匀两次，迅速注入 HPLC 的进样阀。2 分钟后，将六通阀从脱盐/上样（DESALT/LOADING）位置切换至洗脱（ELUTE）位置。使用 20–100 pmol 的 Sti1 和过量的 Hsp90 重复该实验。 
	注意：绝对浓度取决于相互作用的解离平衡常数。理想情况下，稀释至 D 后2蛋白质过量添加的浓度应至少为10倍&#160;KD （对应于 &#62;85%的低浓度蛋白质发生结合。</li>
	<li>使用合适的软件分析所获得的数据，并利用步骤中确定的保留时间&#160;6.5 在分析中找到每种肽段。计算未交换蛋白质同位素分布的质心（步骤&#160;7.2）以及HX实验（步骤&#160;7.3). 
	注意尽管发生氢氘交换的肽段同位素峰型与其未交换形式有所不同，但凭借对肽段电荷态的了解以及质谱仪的高质荷比精度，可轻松确定其质心。</li>
	<li>比较仅有靶蛋白及靶蛋白与过量结合伴侣存在时的氘掺入情况。此步骤可通过商业软件自动完成，或使用电子表格程序手动完成。100%对照样品的数值表示每条肽段的最大氢氘交换水平，可用于确定氘掺入量2实验过程中因回交导致标签丢失。</li>
</ol>

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<li>Walters, B. T., Ricciuti, A., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+back+exchange+in+the+hydrogen+exchange-mass+spectrometry+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Minimizing back exchange in the hydrogen exchange-mass spectrometry experiment.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23 (12), 2132-2139 (2012).</li>
<li>Weis, D. D., Wales, T. E., Engen, J. R., Hotchko, M., Ten Eyck, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+EX1+kinetics+in+H%2FD+exchange+mass+spectrometry+by+peak+width+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of EX1 kinetics in H/D exchange mass spectrometry by peak width analysis.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (11), 1498-1509 (2006).</li>
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<li>Deng, Y., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unfolding+domains+in+large+proteins+by+their+unfolding+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of unfolding domains in large proteins by their unfolding rates.</a> Biochem. 37 (18), 6256-6262 (1998).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+unfolding+of+diverse+SH3+domains+on+a+wide+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Partial unfolding of diverse SH3 domains on a wide timescale.</a> J. Mol. Biol. 357 (5), 1592-1604 (2006).</li>
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<li>Abzalimov, R. R., Kaplan, D. A., Easterling, M. L., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformations+can+be+probed+in+top-down+HDX+MS+experiments+utilizing+electron+transfer+dissociation+of+protein+ions+without+hydrogen+scrambling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20 (8), 1514-1517 (2009).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

相互作用伙伴与蛋白质结合时，不可避免地会引起结合位点处溶剂可及性的变化。此外，许多蛋白质在结合过程中会发生动态的构象变化，这些变化会影响实际结合界面以外的其他区域。氢氘交换质谱法（HX-MS）是一种用于监测这些变化的可靠方法，甚至能够揭示其他技术难以覆盖的时间尺度上的蛋白质构象变化。
成功实施氢氘交换质谱（HX-MS）需把握三个关键点：1）优化的系统配置；2）精确的样品处理操作；3）在指认肽段谱图和解析结果时进行严谨的数据分析。
系统设置
由于质谱技术用于检测氘代标记在肽段中的掺入情况，因此HDX-MS（氢-氘交换质谱）在样品制备过程中需遵循相同的注意事项。在分析前应避免或去除干扰质谱检测的去垢剂、盐类及其他化合物。尽管HDX-MS可用于分析大型蛋白质复合物，但其更高的复杂性对肽段分离和质谱分析的质量提出了更高要求。色谱条件的优化是获得高质量数据的关键，包括选择高品质的有机溶剂、反相色谱材料，以及梯度和溶剂条件的优化。可在实验间或过夜使用有机溶剂清洗色谱柱，以降低背景信号。质谱...

近年来，蛋白质及蛋白质复合物的晶体结构数量迅速增加。这些结构为了解这些蛋白质的组织架构提供了宝贵的快照，并为结构-功能分析奠定了基础。然而，X射线晶体学通常难以揭示蛋白质的动力学行为及其功能所必需的构象变化。另一方面，冷冻电子显微镜能够捕捉蛋白质及蛋白质复合物在不同构象状态下的图像，但通常无法将构象变化解析到二级结构水平1。在溶液中以原子级细节解析蛋白质构象动态的唯一方法是核磁共振（NMR），但该方法仍局限于相对较小分子量的蛋白质（通常≤ 30 kDa），且需要较高的蛋白质浓度（≥ 100 μM），这限制了其在易发生寡聚化或聚集的蛋白质上的应用2。一种能够弥合高分辨率X射线晶体学与冷冻电子显微镜之间差距、且不受蛋白质大小或浓度限制的方法是酰胺氢-1H/2H交换（HX）结合质谱（MS）技术。近年来，该方法已发展成为研究蛋白质动力学、蛋白质折叠、蛋白质稳定性及构象变化的重要分析工具3-5。该方法的分子基础在于蛋白质主链酰胺氢的不稳定性，当蛋白质置于D2O溶液中时，这些氢原子会与氘原子发生交换。随后随时间推移的蛋白质质量增加可通过高分辨率质谱进行测定。
简而言之，无规卷曲肽段中的氢氘交换（HX）仅依赖于温度、催化剂浓度（OH⁻）-，H3O+ 即 pH，参见 图3）以及相邻残基的氨基酸侧链，这是由于诱导效应、催化效应和空间位阻效应所致。这些效应会影响固有化学交换速率 kch 已被 Bai 精确量化 等.6 并提供一个程序（由 Z. Zhang 提供），可用来计算 kch 对于多肽中每种氨基酸，其性质依赖于 pH 和温度。在中性 pH 和常温条件下，kch 在10的数量级上1-103 秒-1在折叠蛋白中，氢交换（HX）速率通常会减慢2到9个数量级，这主要归因于二级结构中的氢键作用，次要原因则是水合氢氧根（OH⁻）的可及性受限。- 离子进入紧密折叠蛋白质的内部。因此，天然蛋白质中的氢氘交换（HX）涉及部分或全局去折叠、化学交换以及根据方程（1）重新折叠至天然状态，所观察到的交换速率k观察 取决于开启速率 kop，关闭速率kcl 以及内在化学交换速率 kch 根据公式(2)。
<img alt="蛋白质折叠机制方程；化学动力学，速率常数；科学分析。" src="/files/ftp_upload/50839/50839eq1-2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1-2"> 
在天然状态条件下，kop 远小于 kch，因此在分母中可忽略不计。存在两种极端的交换机制，分别称为 EX1 和 EX2。如果 kcl 远小于 kch（EX1），则观测到的速率实际上等于开环速率，氢氘交换（HX）可直接反映结构单元的去折叠过程。在这种交换机制下，结构单元一旦打开，所有酰胺质子即同时发生交换，在质谱（MS）中表现为同位素峰的双峰分布7，易于观测。如果 kcl 远大于 kch（EX2），则观测到的速率与 kch 成正比，比例常数等于折叠-去折叠平衡常数 Ku = kop/kcl。在此条件下，在所有酰胺质子完全被氘代之前，需经历多次开环与闭环事件，导致平均质量逐渐增加，而同位素分布基本保持不变。EX2 机制可用于测定去折叠自由能 ΔGu，从而评估结构单元的稳定性。在天然状态下，EX2 机制最为常见。提高 pH 或加入变性剂可使交换机制向 EX1 转变。因此，HX-MS 可用于研究蛋白质折叠及构象变化的热力学和动力学参数。
如上所述，氢交换（HX）本质上受pH值和温度的影响，在生理pH值（pH 7.6）条件下，主链酰胺基团中完全暴露于溶剂的质子的交换半衰期为5–400毫秒。 30 °C，但10分钟到 &gt;15 小时，平均为 &gt;pH 2.9 条件下 2 小时 0 °C （除了多肽主链第一个酰胺键的质子，其交换的半衰期为 ca1-2 分钟）。在这种缓慢交换条件下，可以使用蛋白酶对样品进行消化。例如 胃蛋白酶）在这些条件下具有活性，同时不会丢失掺入的氘原子所包含的全部信息。自从引入在慢交换条件下进行胃蛋白酶消化的方法以来，不仅能够分析全长蛋白质的整体氢氘交换动力学，还可将氢氘交换定位到特定区域8,9空间分辨率目前受限于胃蛋白酶切割产生的肽段大小，通常为10-30个残基。然而，由于胃蛋白酶切割特异性较低，可产生重叠肽段，从而可能提高空间分辨率。此外，已有研究发现多种其他蛋白酶在淬灭条件下仍具有活性，但其效率远低于胃蛋白酶。10通过气相中保留氘代模式的肽段碎裂方法，例如电子捕获解离（ECD）、电子转移解离（ETD）和红外多光子解离（IRMPD），可进一步提高空间分辨率。11-13这些技术可防止因分子内质子迁移（“窜扰”）导致的空间分辨率丢失，该现象在最常用的碎裂技术——碰撞诱导解离（CID）中经常被观察到。然而，这些方法需要针对每种肽单独进行优化，因此仍然具有较大挑战性。
HX-MS 已被用于分析蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用，包括病毒衣壳的组装14-17。研究人员已利用该方法探究了蛋白质的去折叠与重折叠过程，以及由温度诱导的构象变化7,18,19。此外，还分析了与磷酸化、单个氨基酸突变相关的构象变化16,20，以及核苷酸诱导的构象改变21,22。因此，该方法似乎非常适用于研究分子机器的组装过程及其动态特性。一个极具吸引力且其作用机制广受关注的候选对象是 Hsp90 分子伴侣复合物。

<table><tbody><tr><td>maXis QTOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nanoAcquity UPLC</td><td>Waters Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu 10AD-VP</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-通道电动阀 EPC6W，带微型电动执行器</td><td>Valco</td><td>#EPC6W</td><td></td></tr><tr><td>进样阀（手动）</td><td>Rheodyne</td><td>#7725</td><td></td></tr><tr><td>Poros AL20 介质</td><td>Applied Biosystems</td><td>#1-6029-06</td><td></td></tr><tr><td>Poros R2</td><td>Applied Biosystems</td><td>#1-1118-02</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>#P6887</td><td>使用新鲜胃蛋白酶</td></tr><tr><td>微径管（1 mm）</td><td>IDEX</td><td>#C-128</td><td></td></tr><tr><td>微径管（2 mm）</td><td>IDEX</td><td>#C-130B</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C8 色谱柱</td><td>Waters Corp.</td><td>#186002876</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>#5355000.011</td><td></td></tr><tr><td>管路（多种直径）</td><td>IDEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>接头</td><td>IDEX</td><td>#PK-110 与 PK-100 配套使用</td><td></td></tr></tbody></table>

利用氢交换质谱法分析蛋白质动力学

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

所有细胞过程都依赖于蛋白质的功能。尽管特定蛋白质的功能直接由其独特的氨基酸序列决定，但只有当多肽链折叠成单一确定的三维结构，或更常见地形成一组相互转换的构象集合时，该功能才能得以实现。因此，研究蛋白质构象与其功能之间的联系，对于全面理解蛋白质如何完成其多种多样的任务至关重要。研究蛋白质在执行其功能循环过程中所经历的构象变化的一种方法是氢-1H/2氢交换结合高分辨率质谱（HX-MS）。HX-MS 是一种多功能且稳健的方法，可为通过其他手段获得的结构信息提供新的维度 例如 晶体学。它可用于研究蛋白质的折叠与去折叠、小分子配体的结合、蛋白质-蛋白质相互作用、与酶催化相关的构象变化以及变构效应。此外，当蛋白质样品量非常有限或难以获得结晶时，通常采用氢氘交换质谱法（HX-MS）。本文提供了一种利用HX-MS研究蛋白质动力学的通用实验方案，并以实例说明如何揭示蛋白质复合物中两个蛋白质之间的相互作用界面。

Hsp90 是酵母中的一种分子伴侣，属于 Hsp90 伴侣蛋白家族。它通过一个复杂的 ATP 酶循环，协助多种客户蛋白的后期折叠过程。有效的折叠需要客户蛋白从 Hsp70 转移，并与共伴侣蛋白 Sti1/Hop 相互作用。Sti1 可直接结合 Hsp90，并通过抑制 Hsp90 的 ATP 酶活性来促进客户蛋白的结合。近期已采用氢氘交换质谱（HX-MS23）研究了 Hsp90 与 Sti1 的相互作用。本文展示了遵循上述方案所获得实验的代表性结果。
通过在平衡状态下用D标记蛋白质复合物，检测了蛋白质间的直接相互作用2O，并比较Sti1肽段在有无Hsp90存在下的质谱图。所得差异图如图所示。 图 5A （数据来自23）。肽段从顶部到底部排列，起始于N端。在Hsp90存在的情况下，TPR2a和TPR2b中的大多数肽段显示出强烈的保护作用（ΔD值为负）。+Hsp90 - DHsp90)，表明这些区域与Hsp90发生相互作用。TPR2a中的保护效应...

蛋白质构象与动力学对于理解蛋白质结构与功能之间的关系至关重要。氢交换结合高分辨率质谱法是一种多功能方法，可用于研究蛋白质的构象动力学，以及表征蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用，包括结合界面和变构效应。

所有细胞过程都依赖于蛋白质的功能。尽管特定蛋白质的功能直接源于其独特的……

以下实验的总体目标是分析蛋白质的构象柔性及其在环境变化、配体结合或蛋白质-蛋白质相互作用下的改变。该目标通过在不同条件下预先孵育目标蛋白质来实现，这些条件可能影响蛋白质的构象，例如配体结合。随后将反应混合物稀释至重水（D₂O）中，孵育不同时间间隔，再通过液相色谱-质谱联用技术分析肽骨架中氘代的掺入程度。由于酰胺基团在受到保护的区域中氘的掺入量减少，通过比较实验在有和无结合伴侣存在时的肽段质谱图，可观察到质谱图中氧化氘同位素分布（OID）因质子与氘核之间的质量差异而发生偏移。在加入结合伴侣后表现出显著保护效应的区域，可能是潜在的结合位点。根据序列覆盖度以及是否存在重叠肽段，可将结合位点精确定位至少数几个氨基酸残基。该方法有助于解答蛋白质折叠和蛋白质动力学领域的关键问题，例如蛋白质如何折叠、如何去折叠，以及它们如何响应温度升高或重金属等物理和化学因素的影响。相似的结合及蛋白质-蛋白质相互作用如何影响蛋白质的构象。该方法对于蛋白质药物的研发也极为重要，可用于验证蛋白质的正确折叠以及进行常规质量控制。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到一些困难。例如，如果蛋白质不能被胃蛋白酶有效消化，则序列覆盖度会较低。如果蛋白质极易发生聚集，则可能在孵育过程中或加入淬灭缓冲液后发生聚集，导致质谱仪中的信号强度降低。在本实验中，我们将利用氢交换质谱法研究酵母分子伴侣HP 90与其共伴侣Sty one的结合。Sty one与HP 90结合，并通过抑制HP 90的ATP酶活性来促进客户蛋白的结合。开始本实验前，请按照文本方案中的说明准备缓冲液、样品和磁珠。为准备酰胺氢交换所用色谱柱，先拧开保护柱的一端，小心取出内部的滤膜。将装填漏斗拧到色谱柱的开口端。使用1/16英寸接头将一个空的5毫升注射器连接到色谱柱底部出口。确保将其紧密固定至保护柱，保证气密性。在漏斗顶部加入几滴浆料珠状材料。拉动注射器的活塞，将浆料通过漏斗吸入保护柱中。继续在漏斗上添加更多浆料珠状材料，并重复操作，直至保护柱完全填满珠状材料。然后在将滤膜和滤圈紧密安装到开口端之前，先取下漏斗。将色谱柱端盖拧紧到保护柱上，并从另一侧取下注射器。用堵头封闭保护柱的两端。为防止色谱柱填料干燥，需先搭建氢交换质谱分析系统。首先将捕获柱连接至高效液相色谱（HPLC）系统。使用含0.1%甲酸的溶剂，将泵A的流速设为0.4毫升/分钟，以平衡色谱柱。校准质谱仪后，将高效液相色谱（HPLC）的出口连接至质谱仪的进样源。为首先确定胃蛋白酶肽段，先将胃蛋白酶柱连接至系统，然后再连接分析柱。在控制软件中设置色谱和质谱参数，选择梯度类型及质谱分析方法。选择长梯度以确保良好的色谱分辨率。在质谱仪上启用串联质谱模式。在100微升H₂O缓冲液中制备100至200飞摩尔的热休克蛋白90或HSP 90。加入100微升淬灭缓冲液，通过上下吹打混匀。使用汉密尔顿注射器将200微升样品注入进样阀的进样口。将进样阀切换至“进样”位置，并启动色谱程序。接下来，通过将生成的肽段与数据库进行比对，鉴定热休克蛋白90的胃蛋白酶肽段。通过加入冰水将系统温度降至0°C。在不使用串联质谱的情况下，重复此步骤，并采用将用于实际氢交换实验的梯度条件。对于热休克蛋白90和STI1，使用10分钟梯度，从90%溶剂A、10%溶剂B转变为45%溶剂A、55%溶剂B，确定在该梯度条件下鉴定出的胃蛋白酶肽段的保留时间，并建立一个包含肽段序列、肽段电荷、状态和保留时间的列表。该列表将用于氢交换实验后鉴定每条肽段。为鉴定蛋白质-蛋白质相互作用界面，首先需建立梯度和质谱方法。在控制软件中，使用10分钟线性梯度，从90%溶剂A、10%溶剂B变为45%溶剂A、55%溶剂B。加载一种质谱方法，该方法针对300至1,500质荷比范围内的检测进行优化，尽管大多数肽段的质荷比将低于1000。将进样阀设置为加载位置，并设置六通阀。在上样脱盐步骤中，将上样泵的流速设置为0.4毫升每分钟。在按照文本方案运行完未改变的参照样品和100%对照样品后，准备20至100皮摩尔的热休克蛋白90，溶于1至5微升的体积中。加入温度调节后的重水缓冲液，使样品体积达到100微升，并按照文本方案中先前确定的精确孵育时间进行孵育。在确定交换的动态范围时，加入100微升预冷的淬灭缓冲液，快速吹打混匀两次后，立即将200微升样品注入HPLC的进样阀。将进样阀切换至“进样”位置，并立即启动色谱程序。两分钟后，将六通阀从脱盐上样位置切换至洗脱位置。对每种蛋白质分别进行此操作，以确定在没有相互作用蛋白存在的情况下，每个肽段的氘掺入量。将热休克蛋白90与至少两倍过量的STI1混合，以使平衡向结合状态偏移，在所需温度下孵育直至复合物形成达到平衡。孵育后，加入温度已调好的重水缓冲液，使样品体积达到100微升，并精确孵育一段定义的时间。然后加入100微升冰冻的淬灭缓冲液，快速上下吹打混匀两次，立即注入蛋白质样品并按之前方法运行。使用合适的软件分析所获得的数据，并利用确定的保留时间在分析中查找每种肽段。计算未修饰蛋白及氢交换实验中同位素分布的质心偏移（OID），比较目标蛋白单独存在以及与过量结合伴侣共存时的氘掺入情况。该分析可通过商业软件自动完成，或使用电子表格程序 M 手动完成。通过比较氧化氘标记后 STI1 肽段谱图在有无 HS P 90 存在下的差异，可直接检测 HSP90 与 STI1 之间的蛋白质-蛋白质相互作用。最终的差异图显示，在HSP90存在的情况下，TPR2A和TPR2B区域的多肽大多表现出显著的保护效应，表明这些区域与HSP90发生相互作用。TPR2A区域的保护效应可从STI1-TPR2A-TPR2B与HSP90多肽复合物的晶体结构中得到合理解释，该结构中根据酰胺质子免受氘代掺入的数目进行着色。在蛋白质-蛋白质相互作用中，并不总是能观察到如此清晰的保护现象。在STI 1存在的情况下，HSP 90的保护作用不如STI 1显著，且保护区域也不如STI 1集中。所有肽段均显示出氘代掺入的保护作用略有增强。图中展示的是酵母HSP 90的卡通示意图，根据酰胺质子受保护免于氘代掺入的数量进行着色；STI 1使HSP 90整体稳定，因为在STI 1存在时，该蛋白质的任何区域均未显示出更高的灵活性。目前尚不清楚这种氘掺入减少是源于与 sty one 的直接相互作用，还是通过变构效应产生的。为了确认 HSP 90 的连续标记，采用氢氘交换质谱法来研究不同蛋白质区域的动力学。此处展示的是 HSP 90 核苷酸结合域中第 43 至 62 位肽段的质谱图。在存在和不存在STI一的情况下，肽段质谱显示氘的掺入具有时间依赖性，并随孵育时间延长而增加。保护程度在孵育过程中随时间变化，在较短的孵育时间内差异较大，而在最长的时间点处交换速率几乎相同。这表明稳定性较低，或存在频繁解离与结合的动态相互作用区域。在进行该实验操作时，重要的是需始终牢记保持条件严格恒定，并在开始交换反应前确保所有准备工作均已就绪。在完成本方案后，还可采用其他方法来回答更多问题，例如蛋白质复合物中相互作用位点的位置。

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使用氢交换质谱分析蛋白质动力学

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