长期慢性 铜绿假单胞菌 小鼠呼吸道感染

本实验的总体目标是在小鼠体内建立持续性的长期慢性铜绿假单胞菌气道感染。首先，需培养选定的铜绿假单胞菌菌株；第二步是将细菌嵌入小的琼脂微珠中，方法是将细菌与琼脂和矿物油在50摄氏度下混合，然后在4摄氏度、缓慢且持续搅拌的条件下冷却该混合物。

接下来，通过多次用 PBS 清洗去除矿物油，并将部分琼脂珠匀浆后涂布于琼脂平板上。为确定细菌含量，最后一步是将数微升琼脂珠悬液注入小鼠气管，以建立慢性铜绿假单胞菌肺部感染。最终，可在攻毒后的不同时间点收集支气管肺泡灌洗液和肺组织，将其涂布于琼脂平板，以检测慢性感染小鼠的比例及存活小鼠气道中的细菌载量。该琼脂珠方法相较于现有方法的主要优势在于，可在高比例小鼠中实现稳定的长期慢性感染，使细菌载量持续稳定长达一个月。

AGA 位点方法可在小鼠肺部形成微需氧环境，使细菌以微菌落形式生长。与囊性纤维化患者黏液中的细菌生长类似，该方法有助于研究人员探讨囊性纤维化及其他呼吸系统疾病的发病机制，并用于测试针对铜绿假单胞菌慢性肺部感染的新型疗法。该方法也可用于实现其他病原体的慢性感染，包括伯克霍尔德菌（Burkholderia）、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia complex）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的共感染；不同病原体之间的竞争实验亦可开展。演示本实验操作的人员分别为博士后 Pheno 和我实验室的博士生 Camil Riva。在小鼠感染实验前 3 天，用接种环从 -80°C 保存的铜绿假单胞菌菌种中取一环菌液，接种至胰蛋白胨大豆琼脂平板，于 37°C 培养过夜。

第二天。挑取单个菌落接种于5毫升胰蛋白胨大豆肉汤中，在37摄氏度、200转/分钟的摇床培养箱中过夜培养。次日早晨，取少量过夜培养的细菌培养物，按1:50比例稀释于磷酸盐缓冲液中，然后在600纳米波长下测定其光密度。

接下来，将过夜培养的细菌培养物进行稀释，取两 OD 的细菌悬液加入含有 20 毫升新鲜 TSB 的新离心管中，在 37 摄氏度、200 转/分钟的摇床培养箱中培养约三到四小时，使其进入对数生长期，直至总 OD 达到 10 至 50。当铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）达到对数生长期后，于 4 摄氏度、2,700 × g 条件下离心 15 分钟收集菌体，并弃去上清液。随后。

将细菌沉淀重悬于1毫升无菌PBS中，充分涡旋振荡使其完全重悬。然后取1毫升该细菌悬液与9毫升预先平衡至50摄氏度的液体TSA混合。将此混合液加入已预热至50摄氏度的重矿物油中。

立即在室温下搅拌六分钟。搅拌必须在油中产生可见的涡流。随后将混合物冷却至四摄氏度，并以最低转速持续搅拌35分钟。

然后在冰上静置额外20分钟。之后，将琼脂珠转移至50毫升离心管中，在4摄氏度下以2,700 × g离心15分钟。

准确去除矿物油，用无菌 PBS 洗涤琼脂糖珠沉淀。三次洗涤后，重复该步骤六次。最后一次洗涤后，可通过重力沉降而非离心方式使珠子沉淀。

将琼脂珠在 20 至 30 毫升 PBS 中无菌重悬，并充分混匀，取 0.5 毫升珠液。接着，取 100 微升匀浆后的珠液加入 900 微升无菌 PBS 中进行 10 倍系列稀释。连续稀释六次，直至稀释至 10⁻⁶。

然后将样品进行系列稀释，包括未稀释样品，接种到TSA平板上，稀释至10的负6次方，于37°C培养平板。使用倒置光学显微镜在多个视野下测量微珠直径。

在对小鼠进行攻毒前，微珠直径必须介于100至200微米之间。通过计数TSA平板上的菌落形成单位数量，确定琼脂微珠悬浮液中每毫升的CFU数量。然后将琼脂微珠的体积调整至每毫升含2至4×10⁷ CFU，以达到每50微升含1至2×10⁶ CFU的最佳接种量。

将一只预先用氯胺酮和赛拉嗪麻醉的六至八周龄雄性小鼠仰卧置于加热垫上，用70%乙醇消毒其毛发。通过皮肤的垂直切口暴露气管。接着，用镊子分离覆盖气管的肌肉。

然后用1 mL注射器吸取最多50 µL的琼脂珠悬浮液。接着，通过导管进行气管插管，并将装有琼脂珠悬浮液的1 mL注射器连接至导管。轻柔推动注射器活塞，使琼脂珠缓慢注入肺部。

然后使用缝合夹闭合切口。在此步骤中，将安乐死的小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇对其皮毛进行消毒。

接着，通过垂直切开皮肤暴露气管和胸腔。然后，通过切开膈肌暴露肺部。使用镊子将缝合线穿入气管下方，并通过导管对气管进行插管。

然后拉动缝合线的两端，将导管固定在气管上，而不是将线缠绕在气管周围。现在使用1 mL注射器吸取1 mL细胞培养基，并将其连接到导管上。推动注射器活塞以立即灌洗肺部，回收液体后将其保存在15 mL离心管中。

用总共三毫升的培养基重复此步骤三次，然后将支气管肺泡灌洗液置于冰上，用于肺组织的收集与分析。将小鼠肺组织切除，用无菌 PBS 冲洗。

然后分离肺叶，将其放入含有两毫升无菌 PBS 的圆底管中，置于冰上保存。在无菌条件下将肺组织匀浆并进行连续稀释。

将匀浆以1:10的比例用PBS稀释。然后对包括未稀释样本在内的系列稀释液进行涂布，接种于TSA平板上，并在37摄氏度下培养过夜。将支气管肺泡灌洗液从冰上取出，在倒置光学显微镜下按1:2的比例用Turk溶液稀释。

使用血球计数板计数总细胞数量，用于分类细胞计数。将支气管肺泡灌洗液在4摄氏度下以330×g离心8分钟。随后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于含10%胎牛血清的细胞培养基中，浓度为每毫升100万个细胞。将显微镜载玻片和滤膜放入细胞离心机的相应插槽中，滤纸面向中心放置。

将每种样品各150微升移液至相应的孔中，用于胞嘧啶检测，并在细胞离心机中以300 × g离心5分钟。然后在染色后观察细胞沉淀，可在显微镜下进行差分计数。该图显示了铜绿假单胞菌PA oh one参考菌株和RP 73在慢性感染过程中的时间进程。

每个时间点的临床菌株。柱状图中红色表示菌血症引起的死亡率百分比，灰色表示存活率百分比，白色表示清除感染的动物百分比，绿色表示建立慢性感染的动物百分比。与铜绿假单胞菌PAO1实验室菌株相比，临床菌株铜绿假单胞菌RP73在建立慢性感染方面更具效率。

在指定时间点处死存活的小鼠，取出肺组织，进行匀浆并在TSA平板上培养，以测定细菌载量。P oh one和RP 73菌株在小鼠肺组织中的生长曲线显示，感染后第3天，P oh one菌株的细菌数量高于RP 73菌株。随后，在感染进入第7天及以后、慢性感染建立后，两种菌株的细菌载量均稳定在每肺10⁴至10⁵ CFU之间。在RP 73临床菌株感染7天后进入慢性感染阶段时，评估了支气管肺泡灌洗液（BAL）中炎性细胞的募集情况。

与未感染小鼠相比，RP 73 感染小鼠的白细胞总数显著升高。其中数量最多的细胞是中性粒细胞，表明先天免疫系统对慢性感染产生了显著反应。下图方框中箭头所示为细胞涂片经细胞离心涂片后在显微镜下观察到的中性粒细胞和一个巨噬细胞。

图中显示了小鼠肺组织在接种 rp.73 临床菌株后七天的慢性感染期间的苏木精和伊红染色结果。如箭头所示，支气管腔内可见菌珠，以及细菌细胞的微菌落。在感染区域，支气管和肺实质表现出大量炎性细胞浸润。

未感染小鼠的气道中无炎症细胞浸润。BES 的直径及其最终浓度是非常重要的细节。为获得良好结果，需注意在冷却阶段，微球的尺寸会受到搅拌速率的影响，且起始细菌量会影响微球的最终稀释度。此外，选择适当的假单胞菌菌株（该菌株对小鼠的致死率低且能引起高比例的慢性感染）可最大限度地减少实验所需小鼠的数量。

小鼠感染后，需进行细菌计数。此外，还可通过支气管肺泡灌洗液中的总细胞和差异细胞计数、细胞因子分析、髓过氧化物酶检测以及组织学分析，以研究对细菌感染的炎症反应。请注意，操作铜绿假单胞菌等机会性病原体时，必须始终采取必要的安全措施，例如佩戴手套、在生物安全柜内操作细菌以及使用无菌技术。

合适的动物模型的建立使得新型抗菌和抗炎分子的临床前测试成为可能。这对于囊性纤维化或其他呼吸系统疾病患者肺部感染的未来治疗干预具有重要意义。