Name: 长期慢性铜绿假单胞菌在呼吸道感染小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: 学习使用琼脂糖珠法建立小鼠铜绿假单胞菌慢性呼吸道感染模型。该方法通过将细菌包埋于琼脂糖珠中并气管内接种，可实现长达一个月的稳定细菌定植，为研究慢性肺部感染的发病机制和评估新型治疗方案提供可靠的动物实验平台。

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Bragonzi 实验室的研究工作由意大利囊性纤维化基金会（CFaCore）和欧盟第七框架计划项目（EU-F7-2009-223670）资助。本研究的部分工作在 ALEMBIC（先进显微镜实验室）完成，小鼠组织病理学分析在病理解剖科（San Raffaele 科学研究所）进行。

1. 慢性感染用细菌的制备（小鼠攻毒前3天和2天）
<ol>
	<li>选择待检测的适当铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株。</li>
	<li>从-80 °C保存的菌种中取一环铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）接种至胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板，于37 °C培养过夜。</li>
	<li>挑取单个菌落，接种至15 ml带盖试管中的5 ml胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中，在37 °C、200 rpm振荡培养箱中培养过夜。</li>
</ol>
2. 慢性感染用琼脂珠中细菌的包埋（感染前一天进行）
<ol>
	<li>取少量细菌过夜培养物，用磷酸盐缓冲液（PBS）按1:50稀释，测定600 nm处的光密度（OD）。</li>
	<li>将过夜培养的细菌按每2 OD加入到含有20 ml新鲜TSB的新离心管中进行稀释。</li>
	<li>在37 °C、200 rpm振荡培养箱中孵育约3–4小时，直至进入对数生长期，总OD达到10–15。</li>
	<li>在此期间，制备含1.5%琼脂的TSA，高压灭菌后置于水浴中50 °C平衡。将150 ml预先高压灭菌的重质矿物油置于锥形瓶中，同样在50 °C水浴中平衡。</li>
	<li>当P. aeruginosa达到对数生长期后，于4 °C下以2,700 × g离心15分钟收集菌体，并弃去上清液。</li>
	<li>用1 ml无菌PBS重悬菌体沉淀，充分涡旋以完全分散沉淀。</li>
	<li>将1 ml菌悬液与9 ml预平衡至50 °C的液态TSA混合。</li>
	<li>将10 ml TSA-P. aeruginosa混合物加入已预热至50 °C的重质矿物油中，立即在室温下搅拌6分钟。搅拌必须在油相中产生可见的涡流。</li>
	<li>将混合物在4 °C冷却，同时以最低转速持续搅拌35分钟（图1）。</li>
	<li>将琼脂珠-油混合物在冰上静置额外20分钟。</li>
	<li>将琼脂珠转移至50 ml Falcon管中，于4 °C下以2,700 × g离心15分钟。</li>
	<li>准确移除矿物油，并用无菌PBS洗涤六次，操作如步骤2.11所述。三次洗涤后，珠子可通过重力沉降而非离心收集。最后一次洗涤后，将琼脂珠重悬于20–30 ml PBS中。</li>
	<li>取一份珠子样品（约0.5 ml），无菌条件下充分匀浆。</li>
	<li>取100 µl匀浆后的珠子悬液，加入900 µl无菌PBS中稀释。随后进行10倍系列稀释至10-6。</li>
	<li>将系列稀释液接种于TSA平板，包括未稀释样品至10-6稀释度，并在37 °C培养平板。</li>
	<li>使用倒置光学显微镜在多个视野下测量珠子直径。珠子直径应在100–200 µm之间（图1）。</li>
	<li>将珠子在4 °C保存过夜。</li>
</ol>
<img alt="铜绿假单胞菌在矿物油中形成微珠的过程，以及慢性肺部感染小鼠模型示意图。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 琼脂微珠制备及小鼠感染流程概览。P. aeruginosa 菌体重悬于1 ml PBS中，并加入9 ml温度为50 °C的液体TSA培养基。将该混合物加入盛有150 ml、50 °C重质矿物油的锥形瓶中，在室温下高速搅拌6分钟。随后将锥形瓶置于4 °C环境中，缓慢搅拌35分钟，使琼脂凝固形成微珠，同时将混合物中的细菌包裹于琼脂微珠内部。图中展示了含有细菌细胞的琼脂微珠细节（A）。通过多次无菌PBS洗涤去除矿物油后，所得琼脂微珠悬液即可用于经气管注射接种至小鼠肺部（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
3. 使用琼脂珠进行小鼠攻毒实验
伦理声明：本实验方案及实验操作遵循圣拉斐尔科学研究所在动物护理与伦理委员会的指导方针。
<ol>
	<li>计数 TSA 平板上的菌落形成单位（CFU）数量，以确定琼脂珠悬浮液中的 CFU/ml 数。用无菌 PBS 将琼脂珠稀释至 2-4 × 107 CFU/ml，使 50 µl 接种液中的接种量达到最佳浓度 1-2 × 106。</li>
	<li>通过腹腔注射给予 C57Bl/6NCr（20-22 g，6-8 周龄）雄性小鼠氯胺酮（50 mg/ml）和赛拉嗪（5 mg/ml）的 0.9 % NaCl 溶液，剂量为 0.002 ml/g 体重，进行麻醉。 
	注意：当动物安静不动、对外界刺激无反应，且心率和呼吸频率稳定时，表明麻醉已达到充分状态。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，并用 70% 乙醇对小鼠体表进行消毒。</li>
	<li>通过皮肤垂直切口暴露气管，并使用无菌、柔韧的 22 G 0.9 mm × 25 mm 静脉导管进行气管插管，插管过程中需注意在进入气管时及时撤出导丝。导管插入气管深度不宜过深，应在到达隆突（分叉处）前停止。</li>
	<li>立即用 1 ml 注射器吸取 50 µl 琼脂珠悬浮液，并将其连接至导管。轻柔推动注射器活塞，使珠粒植入肺部。使用缝合夹关闭切口。</li>
	<li>将动物置于加热垫上，直至完全清醒。</li>
</ol>
4. 小鼠评估
<ol>
	<li>每日观察小鼠的临床症状，包括毛发质量、姿势、活动能力及水合状态。每日监测体重。体重减轻≥20%的小鼠必须实施安乐死。</li>
	<li>按照第5步收集支气管肺泡灌洗液（BAL），并按照第6步或第7步收集肺组织，进行总菌落形成单位（CFU）分析、组织学分析、BAL中总细胞数及差异细胞计数所反映的炎症反应、细胞因子分析以及髓过氧化物酶（MPO）活性测定。</li>
</ol>
5. 支气管肺泡灌洗液的采集与分析
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 处死小鼠。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，用 70% 乙醇对小鼠体表进行消毒。</li>
	<li>沿皮肤做垂直切口，暴露气管和胸腔；剪开膈肌以暴露肺组织。</li>
	<li>使用镊子将缝合线从气管下方穿过，用无菌、柔韧的 22 号 0.9 mm x 25 mm 静脉导管插入气管，拉紧缝合线两端将导管固定于气管上，并打结固定。</li>
	<li>使用 1 ml 注射器吸取 1 ml RPMI 1640 培养基，连接至导管，推动注射器活塞冲洗肺部，并立即回收灌洗液，储存于 15 ml 离心管中。 
	注意：若需分析细胞因子，应在 RPMI 1640 中添加蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>重复此步骤三次，共使用 3 ml RPMI。此后，将支气管肺泡灌洗液（BAL 液）置于冰上保存。进行步骤 6 以收集和分析肺组织。 
	注意：请注意，并非所有液体均可完全回收（最多可回收 2.8 ml）。</li>
	<li>为定量 BAL 液中的细菌，取少量等分试样（300 µl），用无菌 PBS 进行 10 倍系列稀释，接种于 TSA 平板，37 °C 过夜培养。</li>
	<li>使用倒置光学显微镜，在细胞计数板（Burker 细胞计数室）中将 BAL 液等分试样用 Turk 溶液稀释 1:2，计数总细胞数。</li>
	<li>将剩余 BAL 液在 4 °C 条件下以 330 x g 离心 8 分钟。取上清液用于 ELISA 检测细胞因子，并储存于 -80 °C。进行步骤 5.10–5.13 以通过细胞离心涂片法进行差异细胞计数。</li>
	<li>若沉淀呈红色，加入 250–300 µl 用超纯蒸馏水 1:10 稀释的红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，裂解红细胞，作用 3 分钟。加入 2 ml PBS 中和，于 4 °C 以 330 x g 离心 8 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 RPMI 10% 胎牛血清（FBS）重悬沉淀。根据总细胞计数，调整体积至终浓度为 1 x 106 个细胞/ml。</li>
	<li>将载玻片和滤纸按顺序放入细胞离心涂片机的相应槽位，滤纸的纸板面朝向离心机中心。用移液器将每份样品 150 µl 加入相应的孔中，在细胞离心机中以 300 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>按照制造商说明书及先前所述方法12，使用商品化试剂盒对载玻片进行 Romanowsky 染色。进行步骤 5.14–5.17 以分析髓过氧化物酶（MPO）活性。</li>
	<li>将剩余 BAL 液在 4 °C 条件下以 380 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 250 µl 含 0.5% 十六烷基三甲基氯化铵的超纯蒸馏水溶液重悬沉淀，以裂解细胞。样品可在 -20 °C 冻存数天后再进行检测。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 16,000 x g 离心 30 分钟，取上清液用于 96 孔板中的 MPO 活性检测，每孔加入两份相同样品，必要时可进行适当稀释。</li>
	<li>向每孔样品中加入等体积的 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）作为过氧化物酶底物。避光反应至少 5 分钟，直至颜色不再加深。</li>
	<li>加入 2 M H2SO4 终止反应，在 450 nm 处测定吸光度（OD）。OD 值与过氧化物酶活性成正比。</li>
</ol>
6. 肺组织细菌载量测定及细胞因子分析
<ol>
	<li>支气管肺泡灌洗液收集后立即取出小鼠肺组织，用无菌 PBS 冲洗，分离肺叶，放入含有 2 ml 无菌 PBS 的圆底管中，置于冰上保存。 
	注意：若需分析细胞因子，应在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂至管中。</li>
	<li>无菌条件下匀浆肺组织，从匀浆液中取少量样品（300 µl），用 PBS 进行10倍系列稀释，接种于 TSA 平板，37 °C 过夜培养。请注意，总气道细菌负荷量为支气管肺泡灌洗液和肺组织中检测到的菌落形成单位（CFU）之和。</li>
	<li>将剩余匀浆液在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 30 分钟，取上清液用于 ELISA 细胞因子分析，并于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
7. 组织学检查
<ol>
	<li>仅对未采集支气管肺泡灌洗液的肺组织进行组织学分析，以保持肺的形态和特性。</li>
	<li>通过吸入 CO2 对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>通过皮肤垂直切口暴露胸腔，剪开膈肌以暴露肺组织。</li>
	<li>切除肺组织，用 PBS 冲洗，分离肺叶后放入含有 5–10 ml 10% 中性缓冲福尔马林（4% 甲醛）的离心管中，于 4 °C 避光保存。</li>
	<li>按照标准操作程序将肺组织包埋于石蜡中。</li>
	<li>使用切片机切取 5 µm 厚的组织切片。</li>
	<li>按照标准操作程序对切片进行苏木精-伊红染色，并加盖盖玻片。</li>
	<li>使用倒置明场显微镜观察切片，并通过连接相机获取图像。</li>
</ol>

<ol><li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li>
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<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, Forthcoming.</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

P. aeruginosa-微珠制备及小鼠感染实验中的关键步骤如下所述。
用于小鼠攻毒实验的P. aeruginosa菌株至关重要。根据所用细菌菌株的不同，攻毒后可能导致显著差异的死亡率、慢性感染或清除效果。与PAO1标准实验室菌株相比，优先选用P. aeruginosa RP73临床菌株，因其导致的死亡率相对较低，但病变更严重，且更易建立慢性感染。在临床前药物测试中，应选用能够高效建立长期慢性感染的P. aeruginosa菌株进行实验。这有助于在满足科学验证和统计学分析要求的前提下，最大限度地减少实验所需小鼠数量10,11。
P. aeruginosa 单个琼脂珠制剂在大小和 CFU/ml 上存在差异。直径平均为 150 µm、含 2 x 107 CFU/ml 被认为是最佳状态。珠子大小受冷却阶段搅拌速度（步骤 2.9）的影响。以最高速搅拌的珠子较小且呈球形（&#60;50 µm），而搅拌极...

囊性纤维化（CF）是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起的遗传性疾病。该基因编码一种在大多数上皮细胞膜上表达的氯离子通道。Pseudomonas aeruginosa 感染主要导致支气管扩张、黏液栓塞和肺实质破坏，这些病变在大多数囊性纤维化患者中逐渐进展为严重的肺部疾病并最终导致死亡1。了解囊性纤维化的发病机制以及开发新型疗法依赖于具有囊性纤维化特征的动物模型。目前已构建出多种Cftr基因遗传修饰的小鼠模型，但这些动物模型在模拟囊性纤维化患者的肺部病变及其他多个器官异常方面存在明显局限性，相关问题已有广泛报道2。
	
	感染的发生是囊性纤维化（CF）动物模型中的主要挑战之一。文献明确表明，只有将细菌包埋于固定剂（如琼脂、琼脂糖或海藻酸盐）中接种，才能实现持续一个月以上的慢性感染3-5。这些固定剂可提供微氧/厌氧环境，使细菌以微菌落形式生长，类似于细菌在CF患者黏液中的生长方式6。这种慢性感染模型可导致细菌在肺部长期存留，引发气道炎症和组织损伤7。然而，根据所采用的方法、细菌菌株以及接种至肺部的剂量不同，慢性感染小鼠的比例以及在不同时间点从肺部回收的细菌载量可能存在显著差异。特别是，长期慢性感染面临的主要挑战在于，P. aeruginosa 的细菌负荷较低，且在攻毒数周后感染小鼠的比例较低，表明细菌细胞正被宿主逐步清除。通过从一组CF分离株中筛选出P. aeruginosa RP73临床菌株8，我们成功实现了较低的死亡率、更严重的病理损伤，并在C57Bl/6NCrl小鼠中获得较高的慢性感染比例，且细菌载量稳定维持达一个月之久。
	
	本文详细介绍了将P. aeruginosa包埋于琼脂糖珠中的方法；我们通过气管内滴注感染小鼠，测定肺组织中的细菌负荷量和细胞因子水平，收集支气管肺泡灌洗液并进行组织学检查。总体而言，该实验方案将有助于研究人员深入探究病原菌致病机制8,9方面的关键科学问题，并为针对P. aeruginosa慢性感染的新疗法提供测试平台10,11。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>颗粒状Difco琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>重矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-氯胺酮盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器 25 G 5/8 英寸&amp;nbsp;0.5 mm x 16 mm</td><td>PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>导管 22 G 0.9 mm x 25 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe镊子 - 0.5 mm 尖端，弯曲型</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪，11 cm，直刃</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>缝合夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 Burker一次性计数板</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk溶液</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ细胞离心涂片装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost超白载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik罗马诺夫斯基染色试剂盒</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>十六烷基三甲基氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96孔EIA/RIA板</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;,5,5&amp;rsquo;-四甲基联苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10%中性缓冲福尔马林</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精（非巴氏染色法）</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>伊红醇溶液</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>细胞离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>低成本加热垫</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>匀浆探头</td><td>Ystral</td><td>2366925（小型）</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>旋转式切片机</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

长期慢性 铜绿假单胞菌 小鼠呼吸道感染

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

一种慢性气道感染小鼠模型是囊性纤维化（CF）研究中的重要工具，尽管该模型本身存在一些问题。炎症与感染的早期阶段已通过使用该模型得到广泛研究。 铜绿假单胞菌 琼脂珠小鼠模型，而仅有少数报道关注长期慢性感染 体内长期慢性感染的主要挑战在于细菌载量较低 P. aeruginosa 攻毒数周后感染小鼠的比例较低，表明宿主正逐步清除细菌细胞。
本文介绍了一种在小鼠中建立高效长期慢性感染的方法。该方法基于将 P. aeruginosa 琼脂珠中的临床菌株 体外，随后在C57Bl/6NCrl小鼠中进行气管内灌注。双侧肺部感染可产生多种可量化的检测指标，包括体重下降、死亡率、慢性感染及炎症反应。 P. aeruginosa RP73 临床菌株相较于 PAO1 参考实验室菌株更受青睐，因其导致的死亡率相对较低，但病变更为严重，且慢性感染程度更高。 P. aeruginosa 定植可在肺部持续超过三个月。小鼠肺部病理特征与囊性纤维化患者晚期慢性肺部疾病相似。
该小鼠模型最接近人类疾病的病程，既可用于发病机制的研究，也可用于评估新的治疗方法。

当操作正确时，P. aeruginosa 琼脂珠的直径应在 100–200 µm 之间，可通过移液少量琼脂珠悬液至载玻片上，用倒置光学显微镜观察。琼脂珠内的单个细菌细胞清晰可见，具体如图 1所示。
P. aeruginosa 菌株的选择在琼脂珠制备过程中至关重要。图2 和 表1 展示了使用参考实验室菌株 P. aeruginosa PAO1 与临床分离株 RP73 感染小鼠后获得的数据。两种菌株在感染后前3天内的死亡率均较低，但PAO1的死亡率更高（图2A和2B）。在存活小鼠中，PAO1与RP73攻击组在慢性感染比例方面存在显著差异。感染后第3天，所有小鼠仍携带两种P. aeruginosa菌株；但在此之后，部分小鼠清除了细菌，而另一些则发展为稳定的慢性感染。从第7天开始，两种菌株所致慢性感染小鼠的比例均保持稳定，直至第28天。PAO1导致的慢...

我们描述了利用琼脂珠方法在小鼠模型中建立持续性长期慢性Pseudomonas aeruginosa呼吸道感染的技术。

一种慢性气道感染小鼠模型是囊性纤维化（CF）研究中的重要工具，尽管该模型存在一些值得关注的问题……

本实验的总体目标是在小鼠体内建立持续性的长期慢性铜绿假单胞菌气道感染。首先，需培养选定的铜绿假单胞菌菌株；第二步是将细菌嵌入小的琼脂微珠中，方法是将细菌与琼脂和矿物油在50摄氏度下混合，然后在4摄氏度、缓慢且持续搅拌的条件下冷却该混合物。接下来，通过多次用 PBS 清洗去除矿物油，并将部分琼脂珠匀浆后涂布于琼脂平板上。为确定细菌含量，最后一步是将数微升琼脂珠悬液注入小鼠气管，以建立慢性铜绿假单胞菌肺部感染。最终，可在攻毒后的不同时间点收集支气管肺泡灌洗液和肺组织，将其涂布于琼脂平板，以检测慢性感染小鼠的比例及存活小鼠气道中的细菌载量。该琼脂珠方法相较于现有方法的主要优势在于，可在高比例小鼠中实现稳定的长期慢性感染，使细菌载量持续稳定长达一个月。AGA 位点方法可在小鼠肺部形成微需氧环境，使细菌以微菌落形式生长。与囊性纤维化患者黏液中的细菌生长类似，该方法有助于研究人员探讨囊性纤维化及其他呼吸系统疾病的发病机制，并用于测试针对铜绿假单胞菌慢性肺部感染的新型疗法。该方法也可用于实现其他病原体的慢性感染，包括伯克霍尔德菌（Burkholderia）、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia complex）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的共感染；不同病原体之间的竞争实验亦可开展。演示本实验操作的人员分别为博士后 Pheno 和我实验室的博士生 Camil Riva。在小鼠感染实验前 3 天，用接种环从 -80°C 保存的铜绿假单胞菌菌种中取一环菌液，接种至胰蛋白胨大豆琼脂平板，于 37°C 培养过夜。第二天。挑取单个菌落接种于5毫升胰蛋白胨大豆肉汤中，在37摄氏度、200转/分钟的摇床培养箱中过夜培养。次日早晨，取少量过夜培养的细菌培养物，按1:50比例稀释于磷酸盐缓冲液中，然后在600纳米波长下测定其光密度。接下来，将过夜培养的细菌培养物进行稀释，取两 OD 的细菌悬液加入含有 20 毫升新鲜 TSB 的新离心管中，在 37 摄氏度、200 转/分钟的摇床培养箱中培养约三到四小时，使其进入对数生长期，直至总 OD 达到 10 至 50。当铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）达到对数生长期后，于 4 摄氏度、2,700 × g 条件下离心 15 分钟收集菌体，并弃去上清液。随后。将细菌沉淀重悬于1毫升无菌PBS中，充分涡旋振荡使其完全重悬。然后取1毫升该细菌悬液与9毫升预先平衡至50摄氏度的液体TSA混合。将此混合液加入已预热至50摄氏度的重矿物油中。立即在室温下搅拌六分钟。搅拌必须在油中产生可见的涡流。随后将混合物冷却至四摄氏度，并以最低转速持续搅拌35分钟。然后在冰上静置额外20分钟。之后，将琼脂珠转移至50毫升离心管中，在4摄氏度下以2,700 × g离心15分钟。准确去除矿物油，用无菌 PBS 洗涤琼脂糖珠沉淀。三次洗涤后，重复该步骤六次。最后一次洗涤后，可通过重力沉降而非离心方式使珠子沉淀。将琼脂珠在 20 至 30 毫升 PBS 中无菌重悬，并充分混匀，取 0.5 毫升珠液。接着，取 100 微升匀浆后的珠液加入 900 微升无菌 PBS 中进行 10 倍系列稀释。连续稀释六次，直至稀释至 10⁻⁶。然后将样品进行系列稀释，包括未稀释样品，接种到TSA平板上，稀释至10的负6次方，于37°C培养平板。使用倒置光学显微镜在多个视野下测量微珠直径。在对小鼠进行攻毒前，微珠直径必须介于100至200微米之间。通过计数TSA平板上的菌落形成单位数量，确定琼脂微珠悬浮液中每毫升的CFU数量。然后将琼脂微珠的体积调整至每毫升含2至4×10⁷ CFU，以达到每50微升含1至2×10⁶ CFU的最佳接种量。将一只预先用氯胺酮和赛拉嗪麻醉的六至八周龄雄性小鼠仰卧置于加热垫上，用70%乙醇消毒其毛发。通过皮肤的垂直切口暴露气管。接着，用镊子分离覆盖气管的肌肉。然后用1 mL注射器吸取最多50 µL的琼脂珠悬浮液。接着，通过导管进行气管插管，并将装有琼脂珠悬浮液的1 mL注射器连接至导管。轻柔推动注射器活塞，使琼脂珠缓慢注入肺部。然后使用缝合夹闭合切口。在此步骤中，将安乐死的小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇对其皮毛进行消毒。接着，通过垂直切开皮肤暴露气管和胸腔。然后，通过切开膈肌暴露肺部。使用镊子将缝合线穿入气管下方，并通过导管对气管进行插管。然后拉动缝合线的两端，将导管固定在气管上，而不是将线缠绕在气管周围。现在使用1 mL注射器吸取1 mL细胞培养基，并将其连接到导管上。推动注射器活塞以立即灌洗肺部，回收液体后将其保存在15 mL离心管中。用总共三毫升的培养基重复此步骤三次，然后将支气管肺泡灌洗液置于冰上，用于肺组织的收集与分析。将小鼠肺组织切除，用无菌 PBS 冲洗。然后分离肺叶，将其放入含有两毫升无菌 PBS 的圆底管中，置于冰上保存。在无菌条件下将肺组织匀浆并进行连续稀释。将匀浆以1:10的比例用PBS稀释。然后对包括未稀释样本在内的系列稀释液进行涂布，接种于TSA平板上，并在37摄氏度下培养过夜。将支气管肺泡灌洗液从冰上取出，在倒置光学显微镜下按1:2的比例用Turk溶液稀释。使用血球计数板计数总细胞数量，用于分类细胞计数。将支气管肺泡灌洗液在4摄氏度下以330×g离心8分钟。随后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于含10%胎牛血清的细胞培养基中，浓度为每毫升100万个细胞。将显微镜载玻片和滤膜放入细胞离心机的相应插槽中，滤纸面向中心放置。将每种样品各150微升移液至相应的孔中，用于胞嘧啶检测，并在细胞离心机中以300 × g离心5分钟。然后在染色后观察细胞沉淀，可在显微镜下进行差分计数。该图显示了铜绿假单胞菌PA oh one参考菌株和RP 73在慢性感染过程中的时间进程。每个时间点的临床菌株。柱状图中红色表示菌血症引起的死亡率百分比，灰色表示存活率百分比，白色表示清除感染的动物百分比，绿色表示建立慢性感染的动物百分比。与铜绿假单胞菌PAO1实验室菌株相比，临床菌株铜绿假单胞菌RP73在建立慢性感染方面更具效率。在指定时间点处死存活的小鼠，取出肺组织，进行匀浆并在TSA平板上培养，以测定细菌载量。P oh one和RP 73菌株在小鼠肺组织中的生长曲线显示，感染后第3天，P oh one菌株的细菌数量高于RP 73菌株。随后，在感染进入第7天及以后、慢性感染建立后，两种菌株的细菌载量均稳定在每肺10⁴至10⁵ CFU之间。在RP 73临床菌株感染7天后进入慢性感染阶段时，评估了支气管肺泡灌洗液（BAL）中炎性细胞的募集情况。与未感染小鼠相比，RP 73 感染小鼠的白细胞总数显著升高。其中数量最多的细胞是中性粒细胞，表明先天免疫系统对慢性感染产生了显著反应。下图方框中箭头所示为细胞涂片经细胞离心涂片后在显微镜下观察到的中性粒细胞和一个巨噬细胞。图中显示了小鼠肺组织在接种 rp.73 临床菌株后七天的慢性感染期间的苏木精和伊红染色结果。如箭头所示，支气管腔内可见菌珠，以及细菌细胞的微菌落。在感染区域，支气管和肺实质表现出大量炎性细胞浸润。未感染小鼠的气道中无炎症细胞浸润。BES 的直径及其最终浓度是非常重要的细节。为获得良好结果，需注意在冷却阶段，微球的尺寸会受到搅拌速率的影响，且起始细菌量会影响微球的最终稀释度。此外，选择适当的假单胞菌菌株（该菌株对小鼠的致死率低且能引起高比例的慢性感染）可最大限度地减少实验所需小鼠的数量。小鼠感染后，需进行细菌计数。此外，还可通过支气管肺泡灌洗液中的总细胞和差异细胞计数、细胞因子分析、髓过氧化物酶检测以及组织学分析，以研究对细菌感染的炎症反应。请注意，操作铜绿假单胞菌等机会性病原体时，必须始终采取必要的安全措施，例如佩戴手套、在生物安全柜内操作细菌以及使用无菌技术。合适的动物模型的建立使得新型抗菌和抗炎分子的临床前测试成为可能。这对于囊性纤维化或其他呼吸系统疾病患者肺部感染的未来治疗干预具有重要意义。

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科研

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免疫学与感染

长期慢性<em&gt;铜绿假单胞菌</em&gt;在呼吸道感染小鼠

来源： de Vries, C. R., 等一种慢性延迟接种模型 铜绿假单胞菌 伤口感染 视频实验杂志 (2020)本视频展示了将发光的Pseudomonas...

建立小鼠慢性铜绿假单胞菌皮肤伤口感染模型

我们通过气管内注射铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

Pseudomonas aeruginosa 诱导的肺损伤模型

本实验方案旨在提供一种自动化方法，用于量化慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型中的慢性肺部病理变化。该方案包括将小鼠暴露于香烟烟雾（CS）中、测定肺功能、灌注膨胀肺组织，以及采用形态计量学方法测量小鼠肺气肿和小气道重塑情况。...

香烟烟雾暴露小鼠肺气肿及小气道重塑的自动化测量

尽管 体外 宿主-病原体相互作用的研究有助于表征特定的免疫应答， 体内 需要使用模型来观察复杂反应的影响。 白色念珠菌 暴露后...

研究微生物群落 体内宿主介导的相互作用模型 白色念珠菌 和 铜绿假单胞菌 在气道中

文献中已描述了多种在小鼠中建立细菌性肺炎模型的方法。本文介绍一种非侵入性、低成本且快速的方法，通过将细菌接种物滴加至口咽部，使其吸入（即，经气道吸入）以诱导肺炎。同时详细阐述了用于评估肺部固有免疫反应的后续检测方法。...

一种用于小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的非侵入性且技术简便的方法

本研究描述了通过反复将小鼠暴露于高浓度臭氧中，成功建立一种新的慢性阻塞性肺疾病（COPD）动物模型的方法。...

通过反复臭氧暴露在小鼠中建立慢性阻塞性肺疾病模型

本文报道了分析小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能及肺部细菌清除能力的常用方法。这些方法用于研究体外荧光素异硫氰酸酯微球的吞噬作用以及体内的吞噬作用 铜绿假单胞菌 绿色荧光蛋白。我们还描述了一种清除方法 P. aeruginosa...

小鼠肺泡巨噬细胞吞噬作用与细菌清除

我们描述了一种用于在免疫功能健全的小鼠中建立慢性伤口感染的延迟接种方案。...

一种慢性延迟接种模型 铜绿假单胞菌 伤口感染

本文描述了建立小鼠肺炎感染模型的方法，以及对损伤修复过程的相应表征，并介绍了细菌培养和经气管灌注的技术。文中还描述了一种利用高维流式细胞术评估免疫格局的新方法。...

评估肺炎消退的实验模型

小鼠通常对脓肿分枝杆菌（Mycobacterium...

琼脂糖珠制备 脓肿分枝杆菌 通过气管内接种免疫活性小鼠

学习使用琼脂糖珠法建立小鼠铜绿假单胞菌慢性呼吸道感染模型。该方法通过将细菌包埋于琼脂糖珠中并气管内接种，可实现长达一个月的稳定细菌定植，为研究慢性肺部感染的发病机制和评估新型治疗方案提供可靠的动物实验平台。

长期慢性铜绿假单胞菌小鼠呼吸道感染

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