通过荧光基冰平面亲和力确定防冻蛋白的冰结合平面

以下实验的总体目标是可视化由荧光标记的防冻蛋白结合的冰平面。这是通过生长单个冰晶来实现的，防冻蛋白可以作为第二步结合到该冰晶上。通过交叉偏振器观察每个晶体，以确定其奇点和取向。

接下来，将冰晶安装在温控冷指上并形成一个半球。然后将其浸入荧光标记的防冻蛋白溶液中，以便将防冻蛋白吸收到不断增长的半球的特定结合面上。通过在黑暗的冷藏室中使用波长特异性光和滤光片，对与荧光标记的防冻蛋白结合的冰进行可视化和成像，获得冰结果。

与冰蚀刻等现有方法相比，该技术的主要优点是防冻蛋白被荧光标记 为了立即看到蛋白质结合的冰平面 通过准备零下 0.5 摄氏度的温控乙二醇浴并找到一个适合并可以漂浮在其上的干净金属盘来开始晶体生长。晶体是在模具中形成的。使用从聚氯乙烯管上切割的 3 到 4 厘米高的圆柱形模具。

每个模具的一侧应有一个 1 毫米宽、2 毫米高的缺口。在切下缺口的环侧面涂上一层薄薄的真空润滑脂。将这个涂有油脂的缺口表面密封在金属锅上，使缺口远离锅的中心。

确保不要用油脂填充或堵塞槽口。准备尽可能多的模具。接下来，将过滤后的脱气和去离子水添加到模具外的锅中心。

小心不要引入任何气泡。当水层升高到 5 毫米时，水应通过槽口缓慢进入模具。完成后，将平底锅完全水平放入乙二醇浴中。

锅和水达到零下 0.5 摄氏度后，在模具外的锅中间加入一小块冰块。在接下来的三天内孵育过夜以形成一层冰。返回浴槽，向模具中加水。

将 13 毫升 4 摄氏度、脱气和去离子水浇注到每个模具中。加水后每天一次，降低乙二醇浴的温度。到第 4 天，模具应该完全装满冰。

取回模具并为冰准备干净的表面。将每个模具从锅中取出，将冰晶推出。将带有模具的干净表面放入零下 20 摄氏度的冰箱中 1 小时。

处理前。冰准备好后，将其带到冷冻室或冷藏室以确定它是否是单晶。将冰块放在两个交叉的偏振器之间。

如果冰是单晶，则不应看到裂纹或不连续性，并且晶体内的光向不应改变。在偏振器仍在原位的情况下，通过观察冰旋转时透射的光来确定 C 轴的方向。要确定 A AE 的方向，请将冰紧紧包裹在铝箔中。

将针垂直于海轴的方向，在箔片上戳一个小孔，进入冰中。接下来，将冰块置于 0.5 毫巴真空中 20 分钟。取回晶体后，在冷藏室中将其揭开。

观察基平面上的六边形蚀刻。A AE 穿过六角星的顶点。这种晶体将沿着平行于恒星上相对点的线切成两半。

要曝光主棱镜平面，请将晶体牢固地放在工作台上。用钢锯将水晶切成两半。收集这些碎片以安装在冰冷的手指上。

必须进一步准备冰晶才能安装在冷手指上，找到两根直径略有不同但尺寸与冷手指相当的铝棒。当有冷指可以容纳的空腔时，交替使用棒将空腔熔化到晶体挡的顶部。将冰冷的手指冷却至零下 0.5 摄氏度，然后将其放入冰腔中。

将晶体固定到位，直到它冻结在金属上。接下来，将冷却至 4 摄氏度的过滤去离子水装满一个半球形杯，其中装满大约两倍于冰晶直径的半球形杯子。将冰冷的手指绑住的冰晶浸入杯中，去除多余的水，使冰晶的顶部与液体大致齐平，并且冰不会接触。

杯壁用绝缘材料覆盖杯子，并将温度降低到零下 5 摄氏度。让冰在大约一个小时内形成一个半球。准备添加荧光蛋白。

当半球准备就绪时。从杯子中取出冰晶，从杯子中取出水。然后加入 25 至 30 毫升所需浓度的预冷荧光标记蛋白溶液。

在保持总液体体积不变的情况下，将冰晶浸入杯中。再。确保晶体的顶部与液体齐平，并且没有接触杯壁。将冷手指温度降至零下 8 摄氏度，让蛋白质溶液在晶体中冷冻 2 到 3 小时。

当蛋白质溶液形成至少 5 毫米的冰时，停止冰的生长。在冰冷的手指仍然连接的情况下，从杯子中取出冰晶。通过将冷却液加热到略高于零摄氏度来分离冰冷的手指。

等到冰晶融化。当晶体从冰冷的手指上融化时，将其平放到干净的表面上。小心不要触摸新形成的冰。

将晶体在零下 20 摄氏度下存放至少 20 分钟，然后在可以变暗的冷藏室中观察荧光工作。准备带有特定波长激发滤光片的灯，以激发荧光标记和相机发射滤光片。为了阻挡非特定光线，请将冰平的一面朝下放在灯下，使房间变暗并观察被照亮的冰中的图案。

为了估计与防冻蛋白结合的冰平面，将传统的冰蚀刻图像与相应的基于荧光的冰平面图像进行比较使用 trixy 的亲和力分析都显示冬季比目鱼假胸 Americana 产生的 1 型防冻蛋白。该技术可用于同时比较不同防冻蛋白的冰结合模式。在这种情况下，Pacific Blue 标记的 3 型 NFEA FP 8 和 trixy 标记的 1 型防冻蛋白。

这是仅可视化 3 型 N-F-E-A-F-P 8 的结果，在此图像中仅可视化了 1 型防冻蛋白。两者一起可视化。请注意，每个图像的 C 轴都相同。

观看本视频后，您应该对如何生长和定位单个冰晶有很好的了解，并使用基于荧光的冰平原亲和力分析来评估荧光标记的防冻蛋白的冰平原结合模式。