Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Probe für die Kryo-TEM vorzubereiten, indem eine fokussierte Ionenstrahllamelle aus einer kryogenisch gefrorenen Massenprobe extrahiert wird. Dies wird erreicht, indem die Probe zunächst eingefroren und in das kryofokussierte Ionenstrahl-REM eingefroren und in das kryofokussierte Ionenstrahl-REM eingelagert wird. Im zweiten Schritt wird mit dem Ionenstrahl ein dünnes LA Melo ausgeschnitten und mittels eines gekühlten Nanomanipulators auf ein TEM-Gitter übertragen.

Anschließend wird das TEM-Gitter in einer Übergabestation vom REM-Halter auf den TEM-Halter übertragen. Der letzte Schritt ist die Übergabe des TEM-Halters an das Kryo-TEM zur weiteren Analyse. Letztendlich wird das Kryo-TEM verwendet, um hochauflösende Bilder, Tomo Grahams oder Röntgenkarten der extrahierten Lamellen zu zeigen.

Diese Technik wird es uns ermöglichen, weiche Materie mit höchster Auflösung im Transmissionselektronenmikroskop zu analysieren, indem wir den Ort der Analyse durch andere Mikroskopien wie die Lichtmikroskopie oder die Rasterelektronenmikroskopie vorauswählen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mac-Kryo-Mikrotomie besteht darin, dass Präparationsartefakte wie Kompression und Def-Bildung der Probe vermieden werden. Montieren Sie zunächst zwei TEM-Gitter für fokussierte Ionenstrahlproben.

Befestigen Sie auf dem REM-Transferhalter die Gitter, indem Sie die entsprechenden Schrauben mit einem Schraubendreher festziehen und die Verschlüsse schließen, montieren Sie einen für die Probe geeigneten Probenstummel und fügen Sie einen Teil der Probe hinzu. Verwenden Sie z. B. eine Pipette, um Tröpfchen auf einen flachen Stummel zu legen. Montieren Sie dann den REM-Transferhalter auf das Vakuumtransfergerät oder VTD.

Nachdem Sie flüssigen Stickstoff in die Slushing-Station gegeben und abgepumpt haben, öffnen Sie die Station und frieren Sie den REM-Transferhalter wieder ein, bis das Kochen abgeschlossen ist und der Slush wieder erhalten wird. Ziehen Sie anschließend den REM-Transferhalter in die Vakuumkammer des VTD ein und versiegeln Sie ihn. Entlüften Sie die Slushing-Station und die Kryo-Vorbereitungskammer Airlock entlüften Sie die äußere Luftschleuse.

Passen Sie dann die VTD-Dichtung an die Gärschleuse der Kryo-Präparationskammer und der Pumpe an. Wenn ein gutes Vakuumniveau erreicht ist, messen Sie den Schleusenstift, um die Dichtung des VTD und die äußere Schleuse zu öffnen. Setzen Sie dann den SEM-Transferhalter ein.

Öffnen Sie anschließend mit einem kalten Messer die Schutzdeckel der TEM-Gitterschlitze. Schalten Sie die hohe Spannung am fokussierten Ionenstrahl REM aus und öffnen Sie die innere Luftschleuse. Verwenden Sie dann den VTD, um den REM-Halter in die Probenkammer zu übertragen.

Sobald sich der REM-Halter in der kalten Phase befindet, lösen Sie den VTD durch Drücken und Drehen. Ziehen Sie die VTD-Stange ganz in die VTD-Vakuumkammer ein und schließen Sie die innere Luftschleuse, die äußere Luftschleuse und die VTD-Dichtung. Erhitzen Sie zu diesem Zeitpunkt das Vorläufergas auf 24 bis 26 Grad Celsius und positionieren Sie das Gasinjektionssystem oder die GIS-Nadel in einer Höhe von etwa einem Millimeter über der Probenoberfläche.

Öffnen Sie während der Bildgebung mit dem Elektronenstrahl das Gasventil für einige Sekunden. Anschließend härten Sie die Ablagerung über dem interessierenden Bereich oder ROI aus, indem Sie einen 1000 Pico Ampir-Ionenstrahl bei geringer Vergrößerung verwenden. Kippen Sie die Probe nach dem Aushärten um 52 Grad, so dass die Oberfläche senkrecht zum Ionenstrahl steht.

Mahlen. Zwei terroristische Schützengräben. Kippen Sie die Probe auf beiden Seiten des ROI um null Grad zurück und schneiden Sie mit dem Ionenstrahl die Seiten und die Unterseite der Lamelle ab, wobei Sie darauf achten, dass die Schnittmarken durch die gesamte Lamelle gehen.

Nachdem die GIS-Nadel eingeführt wurde, manövrieren Sie den Nanomanipulator, bis seine Spitze in physischem Kontakt mit der Lamelle ist, vorzugsweise an der Seite. Öffnen Sie das GIS-Ventil für einige Sekunden und überwachen Sie die Kryoabscheidung durch kontinuierliche Bildgebung mit dem Elektronenstrahl. Wenn eine zusätzliche ein bis zwei Mikrometer dicke Platinschicht kryoabgeschieden wurde, schließen Sie das Ventil nach dieser Aushärtung das Platin nur in den wenigen Mikrometern um die Stelle, an der der Nanomanipulator mit der Lamelle in Kontakt kommt.

Verwenden Sie dann einen hohen Ionenstrahlstrom, um die Lamelle freizuschneiden. Manövrieren Sie den Nanomanipulator vorsichtig, um die Lamelle aus den Gräben zu entfernen, und bewegen Sie sie mindestens 500 Mikrometer über die Probenoberfläche. Nach dem Zurückziehen der Nadel senken Sie den Probentisch einige Millimeter ab und bewegen ihn, bis eines der TEM-Gitter sichtbar ist.

Verschieben Sie den Zuordnungsbereich auf dem Raster in die Arbeitsposition, und setzen Sie die GIS-Nadel ein. Manövrieren Sie anschließend den Nanomanipulator vorsichtig, um die angehängte Lamelle in physischen Kontakt mit dem Befestigungsbereich auf dem TEM-Gitter zu bringen, öffnen Sie das Gasventil für einige Sekunden und lagern Sie eine zusätzliche ein bis zwei Mikrometer dicke Platinschicht kryo ab, um das Platin nur wenige Mikrometer um den Kontaktpunkt zwischen der Lamelle und dem TEM-Gitter herum auszuhärten. Verwenden Sie dann einen hohen Ionenstrahlstrom, um die Lamelle vom Nanomanipulator zu befreien.

Kippen Sie die Probe um 52 Grad und verwenden Sie den Ionenstrahl, um sie auf Elektronentransparenz zu verdünnen. Nachdem Sie die Kryo-Transferstation mit trockenem Stickstoffgas gespült haben, setzen Sie den Kryo-Transfer-TEM-Halter in den entsprechenden Schlitz der Kryo-Transferstation ein und füllen Sie ihn mit flüssigem Stickstoff. Tauchen Sie anschließend einen Schraubendreher, das TEM-Probenspannwerkzeug und eine Pinzette in einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Kryobecher, um die Spitzen auf die gewünschte Temperatur abzukühlen.

Sobald der VTD an die äußere Schleuse angepasst ist, bringen Sie die Kaltstufe auf die Transferhöhe von 16 Millimetern. Nach dem Ausschalten der Hochspannung die VTD-Dichtung, die äußere Luftschleuse und die innere Luftschleuse öffnen. Verwenden Sie dann die VTD-Stange, um sie durch Drücken und Drehen im Uhrzeigersinn in den REM-Transferhalter einzurasten.

Ziehen Sie zu diesem Zeitpunkt den REM-Transferhalter in die Kryo-Präparationskammer ein. Verwenden Sie das kalte Messer, um die Schutzdeckel der TEM-Gitter zu schließen. Schieben Sie dann die Probe mit dem VTD-Stab in die Vakuumkammer des VTD, schließen Sie die Schleuse und verschließen Sie sie.

Entlüften Sie dann die äußere Luftschleuse und lösen Sie den VTD. Passen Sie den VTD an den SEM-Anschluss der Kryo-Transferstation an. Während Sie mit trockenem Stickstoff spülen, verwenden Sie den Stift an der Station, um die Dichtung des VTD zu öffnen, und schieben Sie den REM-Transferhalter in den Regler der Kryo-Transferstation.

Öffnen Sie mit dem gekühlten Schraubendreher einen der Deckel und lösen Sie die entsprechende Schraube, wobei Sie das TEM-Gitter an Ort und Stelle halten. Nehmen Sie dann das TEM-Gitter auf und legen Sie es mit der gekühlten Pinzette in die TEM-Halterung. Befestigen Sie anschließend das TEM-Gitter an der TEM-Halterung.

Schließen Sie mit dem gekühlten Sechskantring den Verschluss des Kryotransfer-TEM-Halters und trennen Sie die Kryotransferstation vom Pumpsystem. Transportieren Sie die Station und den Heizungsregler des TEM-Halters in die Nähe des TEM und schließen Sie diese wieder an. Stellen Sie den TEM-Probentisch auf eine Neigung von minus 70 Grad ein.

Stellen Sie als Nächstes die kürzeste Pumpzeit für die Schleuse mit nur einem Spülzyklus mit trockenem Stickstoffgas ein. Entfernen Sie den TEM-Halter aus der Kryo-Transferstation und setzen Sie ihn in die erste Stufe des gekippten Goniometers ein, die den Pumpzyklus startet. Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, stellen Sie das Goniometer so ein, dass es auf null Grad zurückgekippt wird, während Sie den TEM-Halter so halten, dass er sich nicht mit dem Goniometer dreht.

Setzen Sie dann den Halter vollständig durch das Goniometer in das TEM ein. Befüllen Sie abschließend den Kryo-Transfer-TEM-Halter mit flüssigem Stickstoff. Bei dieser Methode werden Aspergillus Niger-Sporen zunächst per REM abgebildet, um die Extraktionsstelle zu identifizieren.

Ein Querschnitt einer beliebigen Spore ist ausreichend, aber es ist möglich, den ROI für die Extraktion mit Submikrometergenauigkeit zu positionieren, um eine bestimmte Zelle in einem bestimmten Abstand von der Zellmembran zu schneiden. Sobald das interessierende Merkmal identifiziert wurde, wird der erste Schritt der Kryo-Abscheidung durchgeführt: Um die Probe während des Ionenfräsens vor Strahlschäden zu schützen, wird die Probe um 52 Grad geneigt, gefolgt vom Sputtern von zwei Gräben auf beiden Seiten der Mella. Die Probe wird dann nach hinten gekippt und weiter gefräst, so dass nur zwei kleine Brücken übrig bleiben, die sie mit dem Volumen verbinden.

Der abgekühlte Nanomanipulator wird mit der Mella in Kontakt gebracht und durch eine weitere Kryoabscheidung von Platin werden sie miteinander verlötet. Die kleinen Verbindungsbrücken werden weggefräst, und der Nanomanipulator bewegt die Lamelle in die Nähe des TEM-Grade-Befestigungsbereichs, wo sie mit einer abschließenden Kryoabscheidung von Platin verlötet wird. Der Nanomanipulator wird dann von der Lamelle getrennt, die bis zur Elektronentransparenz dünn ist.

Mit dem Ionenstrahl wird die Lamelle in das TEM übertragen, wo hochauflösende bildgebende Spektroskopie, Tomographie und andere Techniken eingesetzt werden können. Diese Methode wird dazu beitragen, die Grenzflächen der weichen Substanz des Herzens in Systemen wie Neurosonden oder Knochenimplantaten zu verstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kryo-TM-Proben vorbereitet, die Artefakt drei sind und die aus einer bestimmten Region einer Insektenprobe mit einer Genauigkeit von unter einem Mikrometer extrahiert werden können.