在体外的方法来观察派生病人和人内皮细胞前列腺循环肿瘤细胞之间的E-选择素介导的相互作用

该程序的总体目标是使用微载玻片流动组件检查罕见的前列腺癌细胞和表达 e 选择素的内皮细胞之间的相互作用。这是通过首先用纤连蛋白包被微玻片来实现的。第二步是在通道宽度较小的微载玻片上的动态流系统中培养人脐静脉内皮细胞或 VE。

接下来，前列腺癌细胞用抗前列腺特异性膜抗原或 PSMA 人源化单克隆抗体标记，该抗体被内化。最后一步是将抗 PSMA 标记的前列腺癌细胞灌注到表达 e 选择素的 ve 上。最终，视频显微镜用于显示前列腺癌细胞和内皮细胞之间的相互作用。

与现有方法（例如平行板流室和其他动态组件）相比，该技术的主要优点是，使用该技术，您可以检查罕见的前列腺癌细胞之间的相互作用，例如动态流动系统中循环肿瘤细胞和培养的内皮细胞。这种方法可以帮助回答转移领域的关键问题，例如前列腺肿瘤细胞如何通过血管系统转移？它们使用的机制是否与白细胞在化过程中使用的机制相同？

通常，不熟悉这项技术的人会很挣扎，因为它涉及在组织培养罩下灌注下的狭窄通道中培养单层内皮细胞。首先，用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 冲洗微玻片。然后使用 1 毫升诱饵锁注射器，在微玻片上轻轻涂上 200 微升 50 μg/mL 纤连蛋白。

用盖子盖住微玻片，并将其放在组织培养罩内 30 分钟。接下来，在微玻片上灌注 200 μL 温热的 qve 生长培养基，并在室温下孵育 20 分钟。在微载玻片中缓慢分配液体可防止在通道中形成气泡。

在灌注过程中，用 PBS 冲洗 vex，并在室温下加入 0.1% 胶原酶加 0.05% EDTA 的 PBS 溶液 1 至 2 分钟，以制备 vex 混悬液。将 Have 以 180 倍 G 的离心力在 2 毫升生长培养基中离心 5 分钟。然后使用血细胞计数器测量细胞浓度，并每 100 微升生长培养基制备 1000 万个细胞。

接下来，小心地从微玻片的入口中取出培养基。使用 200 微升移液器吸头，将微玻片置于眼睛水平，然后使用 1 毫升诱饵锁注射器将 200 微升准备好的 vex 浓度轻轻注入通道。此步骤需要小心，以防止气泡形成，如果出现气泡，请保持灌注稍长的时间，直到气泡进入出口通道。

接下来，将等体积的约 80 微升 VE 培养基移液到微载玻片的入口和出口中。这可以防止细胞向任一方向流动。盖上载玻片，在 37 摄氏度的培养箱中放置 1.5 小时。

要开始流动室组装，将无菌 20 mL 注射器、内螺纹和外螺纹诱饵连接器、注射泵和管道放入培养箱中 15 分钟，以尽量减少死体积。使用内径为 0.04 英寸的管材。较小的管径可防止气泡形成。

接下来，在 20 毫升注射器中加入 12 毫升温热的 VE 培养基。从注射器中完全去除气泡。用 VE 培养基填充微玻片的入口。

将此组件连接到微型载玻片。轻轻地将出口连接器连接到微玻片上。将设置物放入培养箱中，并将其连接到注射泵。

然后将泵设置为每分钟 10 微升的剪切速率，然后将细胞在 37 摄氏度的培养箱中过夜。第二天，通过移除连接到微玻片入口的连接器来拆卸装置。然后取下出口连接器 2 以上调内皮细胞上的 e 选择素表达。

准备含有白细胞介素 one beta 的新鲜生长培养基。吸出 10 mL 注射器中的培养基。从载玻片的入口处取出剩余的培养基，然后加入新鲜的培养基，完全填充入口。

将注射器连接到载玻片上。在白细胞介素一β孵育vex期间，将注射泵设置为每分钟10微升的剪切速率，在培养箱中放置4小时，制备抗PSMA Alexa 4 88抗体标记的前列腺癌细胞。首先，将 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 添加到 MDA 前列腺癌细胞中 1 分钟。

不要将细胞长时间暴露在胰蛋白酶中，因为它会影响细胞表面存在的糖肽。将细胞以 200 倍 G 离心 5 分钟。接下来，将 MDA 细胞上颚重悬于 1 mL Hank's Buffer 中，并加入抗 PSMA 抗体，在室温下在黑暗处孵育 30 分钟，在孵育过程中重新悬浮细胞。

30 分钟后，将细胞溶液以 800 倍 G 离心 5 分钟。吸出沉淀并重悬于 1 mL Hank 缓冲液中。对标记的 MDA 细胞进行计数，使最终浓度达到每毫升 100 万个细胞。

将标记的 MDA 细胞填充到 5 毫升注射器中，并去除气泡。打开倒置显微镜并将卷曲器照明设置为 10 倍物镜。将注射泵置于与显微镜样品台相同的水平，并将其设置为每平方厘米 1 角硬币的剪切应力。

接下来，打开 Zeiss Axio 视觉软件。在计算机屏幕上选择目标。在软件中的工具选项下创建一个新文件夹。

打开 Axio vision 中的智能实验选项，并调整设置以录制 30 分钟的第 32 个短视频对于实时荧光视频，请设置图像选项。这些参数有助于使用蔡司 MRM 相机获得接近视频帧速率的视频，以便在计算机屏幕上以 10 倍物镜可视化流道的全宽，在将注射器和包含细胞的连接器放置到注射泵上之前，使用汞灯上的 CM 安装适配器开关。接下来，将连接器连接到含有白细胞介素 one beta 刺激 ax 的微载玻片的填充入口通道。

使用连接到管路的连接器连接出口通道。将管路放入培养皿或 15 mL 锥形管中，以收集流出物。以每分钟 10 微升的速度通过微玻片开始输注。

观察内皮细胞与标记的 MDA 细胞或来自 488 纳米以下患者的标记 CTC 之间的相互作用。在落射荧光显微镜上进行滤光片。开始将实验录制为第 32 个短视频。

在回放分析期间，测量滚动速度。滚动速度的测量方法是将单元随时间移动的距离除以。此处显示的是单层内皮细胞的过夜培养。

在微型幻灯片上。缩放显示，使用 5 倍物镜时可以看到 100% 的微玻片，而使用 10 倍物镜时可以看到 70% 的微玻片对于选定的中介交互，不考虑在边缘滚动的细胞，这使得超过 70% 的微玻片可用于视频录制和回放分析。箱形图显示了在不同剪切应力条件下，未标记和抗 PSMA、标记的 MDA 细胞在白细胞介素 1 β 刺激的内皮细胞上的滚动速度分布。

在每平方厘米 10 角硬币的较高剪切应力下，在 1 和 5 平方厘米处的滚动速度没有观察到显着差异。在未标记和抗 PSMA、标记的 MDA 细胞的滚动速度之间观察到统计学上的显着差异，使用前列腺癌患者血液拍摄的时间拼接视频显示标记的前列腺 CTC 和表达凝集素的内皮细胞之间的三种类型的相互作用栓系，其中 CTC 附着和重新附着稳定的粘附，其中 CTC 即使在 30 秒后也没有分离，并且没有相互作用，因为非相互作用的 CTC 进入视野。微玻片可以很容易地进行免疫染色和荧光成像，以检测抗 PSMA、标记的 MDA 细胞的牢固粘附。

在白细胞介素大量后，可以在此处看到 1 β 刺激的内皮细胞。观看此视频后，您应该对如何检查此程序后循环前列腺肿瘤细胞和表达 S 选择素的内皮细胞之间的相互作用有很好的了解。也可以进行其他方法，例如免疫荧光，以回答其他问题，例如是否存在 s 选择素。配。

像这样的技术可以帮助研究人员了解转移所涉及的不同步骤。