一种吞噬作用检测方法：评估中枢神经系统吞噬细胞与神经元相互作用的实验方案

本实验的总体目标是观察并量化小胶质细胞对突触前输入的吞噬作用。首先向眼球内注射荧光顺行示踪剂，以标记外侧膝状体核中视网膜神经节细胞的突触前输入；第二步是解剖、固定并平衡脑组织。

接下来，对脑组织进行切片。最后一步是将脑切片置于盖玻片上，用于成像和分析。最终，通过共聚焦显微镜评估小胶质细胞对突触前输入的吞噬情况。

该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如吞噬性胶质细胞如何参与突触环路的可塑性与重塑。尽管该方法可用于揭示健康大脑中突触环路的重塑过程，也可应用于其他系统，例如神经系统疾病期间的突触环路重塑。本次实验操作将由 Stevens 实验室的技术员 Chris Heller 和研究生 Emily Laman 进行示范。

开始此操作时，将小鼠置于含4%异氟烷的有机玻璃诱导室中进行麻醉。一至三分钟后，通过夹捏尾巴确认小鼠已达到适当的麻醉深度。然后将小鼠侧置于体视显微镜下，将输送3%至4%异氟烷的鼻罩置于小鼠口鼻部。

为了暴露巩膜，使用一把小型弹簧剪刀打开眼睑并向后牵拉皮肤。对于新生儿，有时需要在眼角处另做一条垂直切口。剪切眼睑角落时需小心，因为此处存在血管。

使用无菌的30.5号针头在巩膜起始处的眼侧刺一个小孔。进针时需小心，避免损伤晶状体，针头插入深度以针尖斜面进入眼球为宜。让玻璃体液从小孔流出，并使用无菌剪切并去尖的涂抹棒吸收液体。

当玻璃体停止从孔中流出后，缓慢插入连接至已预装顺行示踪剂的汉密尔顿注射器的钝头针，将染料注入孔中，再缓慢将染料注射入眼内。通常使用与Alexa 594、647或488偶联的霍乱毒素β亚基进行顺行示踪。

晚期痕量R GC输入 将针头在孔中停留几秒钟，然后缓慢拔出。使用棉签吸收多余液体，防止染料溢出。然后向眼部涂抹少量抗生素软膏。

如果眼球经过手术切开，注射后应轻柔地将眼睑复位。将小鼠置于加热灯下或加热垫上，直至其从麻醉状态开始恢复。

将小鼠放回干净的饲养笼中，并监测其状态，确保完全清醒后再放回动物群。注射约24小时后，处死小鼠并解剖脑组织。将脑组织置于装有4%PFA的Falcon管中，于4°C条件下固定过夜，次日继续处理。

用 PBS 清洗脑组织三次：首先将脑组织和 PFA 倒入一个空的废液盒中，然后使用刮铲将脑组织转移至另一个装有 PBS 的废液盒中。再用 PBS 清洗脑组织两次，之后将其转移至装有 30% 蔗糖溶液的 Falcon 管中。在 4°C 条件下静置，直至脑组织沉降至管底。

随后，使用剃刀片去除脑组织中不需要的部分。将脑组织置于铝箔上，放在干冰上速冻。同时，将切片机的载物台预冷，并在24孔板的每个孔中加入0.5毫升的0.1摩尔磷酸盐缓冲液（PP），用于将冷冻的脑组织固定在冷冻载物台上。

在载物台上涂抹少量OCT包埋剂。待OCT开始冻结后，将脑组织置于其中，需切割的一侧应朝上。

接下来，用研磨成极细粉末的干冰覆盖脑组织和OCT包埋剂。将干冰保留在脑组织上约30秒，然后使用大号画笔刷去干冰。

开始以40微米厚度切片。然后使用湿润的小号画笔将含有目标区域的切片从刀片上取下，并转移至含有0.1摩尔磷酸缓冲液的24孔板中。待切片收集完毕后，在荧光解剖显微镜下观察前脑等级标记，选择含有目标区域的切片用于贴附到载玻片上。

首先，在带电的显微镜载玻片上滴加少量 0.1 摩尔的 PB 缓冲液。接着，将组织切片转移至 PB 缓冲液液滴中。然后使用画笔对组织进行定位并展开。

使用无尘纸吸去XSPB，并注意避免将切片一并吸走。待其完全自然晾干。随后在每个切片上滴加少量封片剂，并在最后盖上盖玻片。

用指甲油密封载玻片的边缘，并将载玻片保存在负20摄氏度，直至进行成像实验。以下是前向等级示踪策略的示意图。

左眼和右眼的RGC输入分别用CTB 6 47和CTB 5 94进行示踪。随后评估小胶质细胞介导的输入吞噬作用。此处为出生后第五天小鼠外侧膝状体核（DLGN）的代表性低倍图像，该图像来自左右眼输入的跨示踪标记。

这是从左右眼输入交界区域采集的小胶质细胞。所有位于小胶质细胞体积之外的CTB荧光信号已被减除，从而揭示出被吞噬的视网膜神经节细胞（RGC）输入，以及小胶质细胞及其吞噬内容物的表面渲染图像。此处显示的是被吞噬的RGC输入。

以下是来自出生后第5天、第9天和第30天小鼠的代表性表面渲染的小胶质细胞图像。在DLGN中，小胶质细胞对RGC输入的吞噬作用在修剪高峰期显著高于较晚的发育阶段。与野生型同窝小鼠相比，缺乏补体受体3的小鼠其小胶质细胞对RGC输入的吞噬显著减少。一旦掌握该技术，

如果操作得当，该技术可在72小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何对神经元进行示踪标记以及如何评估小胶质细胞与突触的相互作用。