一个吞噬含量:一个协议，以评估之间的中枢神经系统吞噬细胞和神经元的相互作用

该程序的总体目标是可视化和量化小胶质细胞对突触前输入的吞噬。这是通过首先将荧光前级示踪剂注射到眼睛中以标记外侧基因核中的视网膜神经节细胞突触前输入来实现的。第二步是解剖、修复和平衡大脑。

接下来，对大脑进行切片。最后一步是将大脑切片安装在盖唇上进行成像和分析。最终，共聚焦显微镜用于评估小胶质细胞对突触前输入的吞噬。

这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如吞噬土壤如何促进突触回路的可塑性和重塑。虽然这种方法可以深入了解健康大脑中的突触回路重塑，但它也可以应用于其他系统，例如神经系统疾病期间的突触回路重塑。演示该程序的是技术员 Chris Heller 和史蒂文斯实验室的研究生 Emily Laman。

通过在有机玻璃感应室中用 4% ISO 氟麻醉小鼠来开始此过程。一到三分钟后，通过捏住尾巴确保达到适当的麻醉水平。然后将鼠标侧卧放在立体显微镜下，放置鼻锥，鼻锥在鼻子上提供 3% 到 4% 的 ISO 氟。

要露出巩膜，请使用一把小弹簧剪刀打开眼睑并向后拉皮肤。对于新生儿，有时需要在眼角再做一次垂直切口。切开眼睑角时要小心，因为有血管。

使用无菌的 30.5 号针头在巩膜开始的眼睛一侧刺穿一个小孔。小心避免损坏镜头，将针插入足够远的位置，使斜面进入眼睛。让玻璃体从孔中流出，并使用无菌切割和倾斜的涂抹器吸收液体。

一旦玻璃体停止从孔中流出，慢慢插入一根钝头针头，该针头连接到预装了前级示踪剂的 Hamilton 注射器上。将染料注入孔中，慢慢将染料注入眼睛中。通常，与 Alexa 5 94、6 47 或 4 88 偶联的霍乱毒素 β 亚基用于前级。

延迟迹线 R GC 输入 将针留在孔中几秒钟，然后慢慢将其取出。使用棉签涂抹器吸收多余的液体并防止染料泄漏。然后在眼睛上涂抹少量抗生素软膏。

如果眼睛是通过手术睁开的。注射后轻轻地将眼睑重新定位在一起。将鼠标放在加热灯下或加热垫上，直到它开始从麻醉中恢复。

将鼠标放回干净的家笼中并对其进行监测，以确保它在返回蜂群之前完全清醒。注射后约 24 小时，处死小鼠并解剖大脑。第二天将大脑固定在装满 4% PFA 的 Falcon 管中，在 4 摄氏度下过夜。

先将大脑和 PFA 倒入空乳清船中，然后在 PBS 中冲洗大脑 3 次，然后使用刮刀将大脑转移到另一艘装满 PBS 的乳清船上。在 PBS 中再洗涤大脑两次，然后将其转移到装有 30% 蔗糖溶液的 Falcon 管中。将其置于 4 摄氏度的蔗糖中，直到它沉到管底。

之后，用剃须刀片去除大脑中不需要的任何部分。将大脑冷冻在干冰上的一块铝箔上。同时，冷冻切片机台，并在 24 孔板的每个孔中填充半毫升 0.1 摩尔 PP，以将冷冻的大脑安装在冷冻台上。

将少量 OCT 应用于舞台。一旦 OCT 开始冻结，就将大脑放入其中。将被切割的大脑一侧应朝上。

接下来，用非常细碎的干冰覆盖大脑和 OCT。将干冰留在大脑上约 30 秒。然后用大画笔去除干冰。

开始以 40 微米的厚度切片。然后用小的湿画笔从刀片上去除包含感兴趣区域的切片，并将它们转移到含有 0.1 摩尔 pb 的 24 孔板中。收集切片后，在荧光解剖显微镜下观察前级标记，并选择包含感兴趣区域的切片以将切片安装在载玻片上。

首先，将一小池 0.1 摩尔 PB 施加到带电显微镜上。接下来滑动，将组织切片转移到 pb 池中。然后使用画笔定位和展开组织。

使用 Kim 湿巾吸走 XSPB，并注意避免从该部分上吸走。让它们完全风干。然后将一小滴封固剂滴在每个部分上，并在最后的顶部安装盖玻片。

用指甲油密封载玻片的边缘。将载玻片存放在零下 20 摄氏度，直到显示成像会话。这是前级追踪策略的示意图。

左眼和右眼 RGC 输入分别用 CTB 6 47 和 CTB 5 94 进行跟踪。随后评估小胶质细胞介导的输入吞噬。这是左眼和右眼输入分级追踪后出生后第 5 天小鼠 DLGN 的代表性低放大倍率图像。

这是从左眼和右眼输入的边界区域采样的小胶质细胞。减去小胶质细胞体积之外的所有 CTB 荧光，揭示了已被吞噬的 RGC 输入以及被吞噬的小胶质细胞的表面渲染。RGC 输入如下所示。

这是 P 5、P 9 和 P 30 小鼠渲染的小胶质细胞的代表性表面。DLGN 与年龄较大的相比，在 DLGN 的峰值修剪期间，RGC 输入的吞噬显着增加。与野生型窝交配相比，来自缺乏补体受体 3 的小鼠的小胶质细胞吞噬的 RGC 输入明显较少一旦掌握。

如果执行得当，这项技术可以在 72 小时内完成。观看此视频后，您应该对如何对标记神经元进行交叉排序和评估小胶质细胞突触相互作用有很好的了解。