为介观荧光体层摄影术在体内成像的发展果蝇

为了重建黑腹果蝇体内发育中的器官，我们需要确定最能描述光在蛹本身内传播的正向模型。该过程首先选择一个白色的蛹并将其粘在毛细管的末端，使 poppa 的前后轴平行于管子。一个小毛细管装满了一些荧光染料并插入瞳孔盒中。

仔细调整轴后，将蛹旋转 360 度。图像以不同的角度采集。获取的荧光透射照明数据用于确定将用于对器官发育进行成像的正向模型。

大家好，我叫 Claudia，在哈佛医学院麻省总医院辅助生物学中心工作。我是来自哈佛医学院派拉蒙实验室的 Ula Petou，我是来自慕尼黑工业大学生物与医学成像研究所和慕尼黑赫利曼中心的 Daniel Rozanski。今天，我们将向您展示在 Oph Melano Casta 中进行全身三维重建的程序。

我们在实验室中使用该程序对瞳孔状态期间器官发育的体内进行可视化。所以让我们开始吧 在开始之前。请注意，在此之前没有应观看的随附视频，其中对光学投影断层扫描的一些技术方面进行了比此处更详细的解释。

此外，另一个视频解释了大型动物的准备好的组织或器官的成像。对于本视频中涵盖的所有实验，将使用锻造果蝇转基因。它们是在唾液腺中表达的 EL A gal four，在成体翅膀和胸部的幼虫前体组织中表达的 apteris gal four，这是制造荧光蛋白的转基因。

响应称为 U-A-S-G-F-P 的 gal 4 和白色 1118，携带 UAS 转基因的非荧光对照雄性与携带 GAL 4 转基因的处女雌性杂交以获得组织。在标准果蝇培养基上建立 8 至 10 个原始雌性和雄性 GFP 杂交的特异性表达，并撒上面包酵母。在表面，将样品瓶置于 25 摄氏度的加湿培养箱中，在 12 小时的光暗循环下。

杂交开始两天后，父母被转移到新的小瓶中，五到六天后，PUI 将开始填充小瓶中的白色 PrepU。I 被选择在荧光解剖镜下进行 GFP 表达。选择白色的 pre pui 可以确保动物的正确分期，因为它们会保持白色约一小时。

瞳孔化后，它们会变成色素沉着或呈褐色。使用湿画笔从小瓶中轻轻收集表达 pui 的 GFP，并置于培养皿中的一滴水或 PBS 中，购买时必须擦去自发荧光材料。使用画笔，他们现在应该准备好进行断层扫描成像了。

如果 PrepU I 需要继续老化以达到正确的发育阶段，可以将它们放在带有湿纸巾的培养皿中或干净的食品瓶中。这将确保足够的湿度和成像的适当显影。PrepU 必须粘附在直径为 800 微米的玻璃毛细管内部。

用强力胶涂在瞳孔的后端，将前蛹的胶合表面定向到管中，使果蝇的前后部通道与管平行。动物的前部将悬垂在毛细管上。毛细管现在固定在显微镜的旋转台上。

在垂直位置，调整旋转台的倾斜轴，使管的旋转轴与成像 CCD 的像素柱平行。调整苍蝇的位置后，继续进行成像。在这个例子中，具有荧光唾液腺的动物将被成像为在其唾液腺中表达 GFP 的 oph，可以从 EAG 4 和 U-A-S-G-F-P 股票之间的杂交中产生。

我们从安装的前蛹开始，用激发光束照射前蛹并收集 GFP 荧光信号。在透射照明中，将 PrepU 沿其垂直轴旋转 360 度并获取透射照明图像。每个图像对应于 10 度的旋转。

总采集时间取决于荧光量和激发光束的强度。典型的时间大约是一分钟。在这个例子中，将对在翅膀假想盘中表达 GFP 的 DSO 蛹进行成像。

这种蛹可以从 Aus GAL four 和 U-A-S-G-F-P 库存之间的小瓶中收集。pre 蛹如前所述安装。然而，由于本实验的成像时间约为 8 小时，因此环境保持潮湿和室温至关重要为避免动物脱水和死亡，在激发光束上放置了一个快门，以防止感兴趣组织中花四叶猝灭，并确保动物不会像以前那样被激光束灼伤， 用激发光束照射并通过透射照明收集 GFP 荧光信号。

前蛹完全沿其垂直轴旋转。在数据收集期间，轮换只需 1 分钟，并且以不同的时间间隔重复。为了在发育过程中创建机翼的延时图像系列，可以以每小时 100 张图像的速度采集至少 6 小时的数据。

使用此快门控制总曝光量以防止伤害或照片漂白至关重要。这部电影显示了在 PrepU 阶段和瞳孔头厌恶之间获得的图像。在重建 3D 图像时，需要考虑强烈的前向散射，这不能通过扩散来近似。

因此，要进行重建，必须确定光传播的前向散射模型 为了简单起见，我们忽略了吸收。散射量通过实验测试。为此，将具有标准化荧光的异物插入非荧光白色 1118 pre 蛹中，然后扫描以生成正向模型数据，首先用 PS 5.5 荧光染料填充 100 微米二氧化硅毛细管。

使用毛细管作用，将毛细管与前轴成 45 度角推入蛹，将 PrepU 安装在毛细管中，并如前所述将其适当放置在旋转台上。现在用带有低数值孔径透镜的激发激光束照亮前蛹，并收集前蛹的荧光透射图像。如前所述，使用 MATLAB 软件将数据拟合到显式理论前向模型中为了简化重建过程，选择了输运方程的牢固 e 近似值，因为它描述了前向散射机制并且也拟合了实验数据。

确定了正确的正向模型后，我们可以重建唾液腺并获得延时断层重建。如果您计划使用可用空间层析，还可以设置索引匹配的配置算法。首先，我们展示了发育早期唾液腺的 3D 重建。

相比之下，唾液腺的组织学染色显示重建与组织学密切相关。这部关于机翼假想盘发育的延时电影是从单个活体标本中获得的。为了进行比较，在同一时间点对翼盘进行组织学染色表明重建与组织学密切相关。

我们刚刚向您展示了如何构建一个系统，以便在体内和随着时间的推移对 oph 内的三维结构进行成像。这允许跟踪我们，果蝇的形态发生，并在连续六个小时内跟踪翅膀的发育。在执行此程序时，为果蝇内的光传播选择正确的正向模型至关重要。

该方法可与组织学技术结合使用，以阐明 oph 瞳孔阶段的器官发育，并且可以对其进行修改以研究相似大小的不同生物体。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。