Name: 为介观荧光体层摄影术在体内成像的发展果蝇 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 了解介观荧光体层摄影术技术，利用多投影照明和光子传输模型实现Drosophila melanogaster全身三维可视化。该方法突破了传统荧光显微镜的穿透限制，可实时观察器官发育过程。

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C. Vinegoni 承认获得美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 1-RO1-EB006432 的支持。

本实验中使用的Drosophila melanogaster品系如下：
<ul style="list-style-type:none;">
<li>elav-Gal4 (FBti0002575)</li>
<li>ap-Gal4md544 (FBal0051787)</li>
<li>UAS-srcEGFP (FBti0013990)</li>
<li>w1118 (FBal0018186)</li>
</ul>
在所有实验中，均使用 UAS-Gal4 系统在目标组织（即唾液腺或翅成虫盘）中过表达 GFP。具体而言，将携带适当 Gal4 的转基因雌蝇与携带 UAS-EGFP 的转基因雄蝇杂交。杂交后代在 25°C 的恒湿培养箱中培养。当试管中开始出现蛹（杂交后约 5–6 天）时，在白色前蛹期（蛹壳形成后 0–1 小时）根据 GFP 荧光信号筛选个体，并用于断层成像。
<ol>
 <li>设置适当的杂交组合，并在 25°C 下培养</li>
 <li>杂交开始后 5-6 天，挑选荧光后代用于成像。使用湿润的画笔轻轻将白色未成熟蛹从瓶壁上移除。</li>
 <li>将未成熟蛹置于培养皿中的水滴或 PBS 中，以去除食物残渣以及覆盖在蛹壳上导致样本自发荧光的胶状物。用画笔轻轻清洗。若需使蛹继续发育，可将选中的白色未成熟蛹置于含有湿润滤纸（湿润环境）的培养皿中，或放置在装有果蝇培养基的洁净培养瓶壁上。这将确保足够的湿度，以支持动物正常发育。</li>
</ol>
Drosophila 样品制备
<ol>
 <li>将蛹壳的底部粘贴到毛细玻璃管（800 微米直径）中，使果蝇的前后轴与管子方向平行。</li>
 <li>将毛细玻璃管垂直固定在旋转台上。</li>
 <li>调节旋转台的倾斜轴，使旋转轴与成像 CCD 的像素列平行。</li>
</ol>
正向模型的确定
<ol>
 <li>将蛹固定在毛细玻璃管中，并按先前所述方法安装</li>
 <li>用二氧化硅毛细管（100 微米，外径）装入荧光染料（Cy5.5）</li>
 <li>将毛细管以相对于前后轴 45 度的角度插入蛹体内</li>
 <li>使用低数值孔径透镜，以激发激光束照射蛹，并围绕其垂直轴旋转 360 度，采集透射荧光图像</li>
 <li>采用适当的前向模型对实验数据进行拟合</li>
</ol>
唾液腺成像
<ol>
 <li>按照先前所述方法，固定唾液腺中表达GFP的蛹</li>
 <li>用激发光束照射，并在透射照明下收集围绕蛹垂直轴旋转360度时的GFP荧光信号</li>
 <li>利用前向模型重建所获取的数据</li>
</ol>
延时成像
<ol>
 <li>将表达GFP的白色预蛹固定，使其翅成虫盘可见</li>
 <li>保持成像环境湿润并处于室温，以避免蛹体脱水</li>
 <li>设置快门以避免持续光照</li>
 <li>使用激发光束照射，并通过透射照明方式在360度范围内收集荧光信号，同时沿蛹体垂直轴旋转样本</li>
 <li>利用前向模型对所获取的数据进行重构</li>
</ol>
组织学
<ol>
 <li>在 1x PBS 中解剖唾液腺、中枢神经系统/眼原基。</li>
 <li>用 4% 多聚甲醛、1x PEM（100 mM Pipes，1 mM EGTA，1 mM MgCl2）在室温下固定组织 20 分钟。</li>
 <li>去除固定液，用含 DAPI 的 Vectashield 封片（Vector）。</li>
 <li>用荧光显微镜观察成像。</li>
</ol>
延时组织学
<ol>
 <li>收集白色预蛹，并将其置于湿润培养皿中进行发育阶段同步。</li>
 <li>收集处于不同发育阶段的蛹。</li>
 <li>在固定前，用细针（昆虫针 000，FST）在蛹壳上刺两下（0 小时蛹壳形成后，APF）。</li>
 <li>将蛹在含 8% 甲醛的 1×PEM 缓冲液中固定 6–8 小时，室温下轻轻振荡。</li>
 <li>去除固定液并用 1×PBS 洗涤后，用锋利刀片沿垂直于前后轴（A/P 轴）方向将固定后的蛹切成两部分；</li>
 <li>将两部分组织浸入含 DAPI 的 Vectashield 封片剂（Vector）中，置于载玻片（Lab-Tek）上进行封片，用于成像。</li>
 <li>使用荧光共聚焦显微镜采集图像。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1510/1510fig1thumb.jpg" alt="荧光成像，显示小鼠中蛋白质表达的示意图、时间点和光学分析。" border="0" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1510/1510fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。

<ol><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+listening+to+light%3A+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

体内重建表达GFP的蛹壳及唾液腺 D. melanogaster 预蛹期（比例尺：500 微米）及其相应的组织学图像（蓝色：DAPI 染色；绿色：GFP 荧光）如图 1(a) 所示。延时序列成像的 D. melanogaster 翅成虫盘的图像如图1(b)所示。图像来自同一个活体样本，在四个不同时间点（0、3.0、3.5 和 6.5 小时）采集。第一列显示相对于蛹背侧视角0度的一个投影图像。第二列的重建图像对应于红线条指示的切面。最后，第三列展示了与组织学切片的对比。显然，组织学样本与断层重建结果高度吻合。(c) 为一个平面图像 果蝇的 蛹壳和表达GFP的唾液腺。

介观荧光断层成像技术 体内 发育过程成像 果蝇

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

观察器官发育形成过程以及疾病的发生与治疗，通常高度依赖于在完整活体生物体内对分子和功能变化进行光学检测的能力。大多数现有的光学成像方法在成像尺度上存在局限，无法覆盖现代光学显微镜的穿透深度极限（0.5–1 mm）与光学宏观成像受扩散限制的尺度（&gt;1 cm）之间的范围[1]。因此，许多重要的模式生物，例如昆虫、动物胚胎或小型动物的四肢，仍难以进行活体光学成像。
尽管人们对开发纳米级分辨率的光学成像方法的兴趣日益增加，但在提高成像穿透深度方面却鲜有成功进展。事实上，实现超越显微镜限制的活体成像面临着组织中光子散射所带来的困难。例如，近期对整个胚胎进行成像的研究[2,3]需要对样本进行特殊的化学处理以清除散射成分，这一过程使其仅适用于死后成像。然而这些方法表明，在发育生物学和药物发现等领域，迫切需要对大于双光子显微镜或共聚焦显微镜通常可容纳的样本进行成像。
我们开发了一种名为介观荧光断层成像（Mesoscopic Fluorescence Tomography）[4] 的新型光学成像技术，适用于尺寸范围为1 mm至5 mm的无创活体成像。该方法以分辨率换取穿透深度，但提供了前所未有的断层成像性能，并旨在通过实现对荧光标记响应随时间演变的成像能力，将“时间”作为发育生物学观察（以及其他可能的生物研究领域）中的一个新维度引入。因此，该技术可加速研究基因突变或外界刺激对形态或功能的影响，更重要的是，通过允许对同一发育中的生物体进行长期延时可视化，能够完整捕捉发育过程或组织功能的全貌。
该技术利用改进的实验室显微镜和多角度投影照明，从360度的投影方向采集数据。它采用费米简化法求解福克-普朗克光子输运方程，并结合几何光学原理，构建适用于介观尺度的精确反演方案。该方法可实现对尺寸达数毫米的样品中不透明三维结构进行活体全身可视化成像。
我们通过在体内成像发育中的Drosophila组织的三维结构，以及连续六小时实时观察不透明的果蝇蛹翅膀形态发生过程，验证了该技术的体内性能。

介观荧光断层成像技术突破了组织切片荧光显微镜的穿透深度限制。该技术基于多角度投影照明和光子传输模型描述。我们展示了在活体中对表达GFP的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）翅成虫盘形态发生过程进行全身体积三维可视化。

可视化器官发育形成过程以及疾病进展与治疗，通常在很大程度上依赖于光学探测能力……

为了重建黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）发育器官的结构，我们需要确定最能描述光在蛹体内传播的正向模型。该操作步骤首先选择一个白色的未成熟蛹，将其粘附在毛细管末端，使蛹的前后轴与毛细管方向平行。随后，将一根细小的毛细管填充荧光染料，并插入蛹壳内。经过仔细调整轴向后，将蛹旋转360度，在不同角度下采集图像。所获得的荧光透射照明数据用于确定前向模型，该模型将用于成像器官发育过程。大家好，我叫Claudia，来自哈佛医学院麻省总医院的辅助生殖生物学中心。我是Ula Petou，来自哈佛医学院的Paramount实验室。我是Daniel Rozanski，来自慕尼黑工业大学和慕尼黑亥姆霍兹中心的生物与医学影像研究所。今天我们将向您展示一种对奥氏黑斑鳉（Oph Melano Casta）进行全身体三维重建的技术流程。我们在实验室中采用此方法对瞳孔状态期间发育中的器官进行活体可视化观察。现在开始吧。在开始之前，请注意有一段相关的视频应在此前观看，其中对光学投影断层扫描的一些技术细节进行了比本文更详细的说明。此外，另一段视频介绍了对较大动物的已制备组织或器官进行成像的方法。本视频涵盖的所有实验均将使用果蝇转基因品系，包括在唾液腺中表达的 EL A gal4、在成体翅和胸部的幼虫前体组织中表达的 apteris gal4，以及表达荧光蛋白的转基因品系。为了响应携带GAL4（UAS-GFP）和white 1118的果蝇，将不具荧光的对照雄性（携带UAS转基因）与携带GAL4转基因的处女雌性进行杂交，以实现组织特异性GFP表达。杂交实验使用8至10只处女雌蝇和雄蝇，在标准果蝇培养基上进行，培养基表面撒有少量酿酒酵母。杂交管置于25°C、湿度可控的培养箱中，保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件。在开始杂交后的两天，将亲本转移至新的培养管中，再过五到六天，未孵化幼虫（PUI）将开始在管内出现，此时幼虫呈白色（PrepU）。在荧光解剖显微镜下根据GFP表达情况挑选白色未孵化幼虫。选择白色前期PUI可确保动物发育阶段的准确性，因为它们保持白色的时间约为一小时。瞳孔形成后，它们会逐渐出现色素，呈现棕褐色。用湿润的画笔从小瓶中轻轻收集表达GFP的幼体，放入培养皿中的水滴或PBS中，但必须擦去自体荧光物质。此时，可用画笔将它们转移，准备进行断层成像。如果需要继续培养以达到正确的发育阶段，可将 PrepU 置于带有湿润滤纸的培养皿中，或置于干净的食物小瓶内。这将确保成像所需的足够湿度和正常发育。PrepU 必须附着在直径为 800 微米的玻璃毛细管内壁上。用超级胶水涂抹幼虫后端的复眼部位，将预蛹粘合面朝向毛细管，使果蝇的前后轴与毛细管平行。动物体的前部将悬于毛细管之外。此时，毛细管已固定在显微镜的旋转台上。在垂直位置，调节旋转台的倾斜轴，使管的旋转轴与成像 CCD 的像素列平行。调整果蝇的位置后，开始成像。本示例中，将对唾液腺具有荧光标记的动物进行成像，可在唾液腺中表达 GFP 的果蝇可通过 EAG four 与 U-A-S-G-F-P 品系杂交获得。首先，将一只已固定的未成熟蛹置于载物台上，用激发光束照射该未成熟蛹，并采集其GFP荧光信号。在透射照明过程中，围绕其垂直轴将PrepU旋转360度，并采集透射照明图像。每幅图像对应10度的旋转角度。总采集时间取决于荧光强度以及激发光束的强度。典型时间约为一分钟。在此示例中，将对表达绿色荧光蛋白（GFP）的果蝇（DSO品系）蛹的翅成虫盘进行成像。该蛹可从 Aus GAL four 与 U-A-S-G-F-P 品系杂交的试管中收集获得。前期蛹的制备方法如前所述。然而，由于本实验的成像时间约为八小时，因此必须保持环境湿润且处于室温，以避免样本脱水或死亡。为防止目标组织中 floral fours 的荧光淬灭，并确保动物不会被激光灼伤，需在激发光束路径上放置快门。同前，使用激发光束照射样本，并通过透射照明法采集 GFP 荧光信号。蛹前期个体沿其垂直轴完成完全旋转。在数据采集过程中，旋转仅需一分钟，并在不同的时间间隔重复进行。为了获得发育过程中翅膀的延时成像序列，可至少持续采集六小时数据，采集速率为每小时100张图像。必须通过此快门控制总光照暴露，以防止造成损伤或光漂白。本视频展示了从 PrepU 阶段到瞳孔头部回避期间获取的图像。在重建三维图像时，存在强烈的前向散射，必须予以考虑，而这种散射无法用扩散近似来描述。因此，为了进行重建，必须确定光传播的前向散射模型。为简化起见，我们忽略吸收效应。散射程度通过实验测定。具体操作如下：将带有标准荧光标记的异物插入无荧光的白色1118期前蛹体内，然后对其进行扫描以生成前向模型数据。首先，用PS 5.5荧光染料填充一根100微米的石英毛细管。利用毛细作用，将毛细管以与前轴呈45度角的方向插入蛹体内，将PrepU固定在毛细管中，并如前所述将其适当放置在旋转台上。现在使用低数值孔径透镜的激发激光束照射前蛹，并采集前蛹的荧光透射图像。如前所述，采用MATLAB软件将数据拟合到明确的理论前向模型中。为了简化重建过程，选择输运方程的扩散近似（diffusion approximation）作为前向模型，因其可描述前向散射 regime 并且与实验数据吻合良好。在确定了正确的前向模型后，我们可以重建唾液腺并获得时间序列的断层重建图像。如果您计划使用自由空间断层成像，也可设置用于折射率匹配的配置算法。首先，我们展示发育早期唾液腺的三维重建结果。作为对照，唾液腺的组织学染色显示，重建结果与组织学图像具有良好的相关性。该延时电影记录了翅成虫盘的发育过程，数据来自单个活体样本。在相同时间点对翅成虫盘进行组织学染色作为对照，结果显示重建图像与组织学图像高度吻合。我们刚刚向您展示了如何构建一个系统，用于在活体果蝇（Drosophila）中随时间成像其内部的三维结构。该系统使我们能够追踪果蝇的形态发生过程，并连续六小时观察翅膀的发育过程。在进行该操作时，至关重要的是为光在果蝇体内的传播选择正确的前向模型。该方法可与组织学技术结合使用，以揭示在蛇类瞳孔发育阶段的器官发育过程，并且可以进行调整，用于研究其他大小相似的生物。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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