为介观荧光体层摄影术在体内成像的发展果蝇

为了重建黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）发育器官的结构，我们需要确定最能描述光在蛹体内传播的正向模型。该操作步骤首先选择一个白色的未成熟蛹，将其粘附在毛细管末端，使蛹的前后轴与毛细管方向平行。随后，将一根细小的毛细管填充荧光染料，并插入蛹壳内。

经过仔细调整轴向后，将蛹旋转360度，在不同角度下采集图像。所获得的荧光透射照明数据用于确定前向模型，该模型将用于成像器官发育过程。

大家好，我叫Claudia，来自哈佛医学院麻省总医院的辅助生殖生物学中心。我是Ula Petou，来自哈佛医学院的Paramount实验室。我是Daniel Rozanski，来自慕尼黑工业大学和慕尼黑亥姆霍兹中心的生物与医学影像研究所。今天我们将向您展示一种对Oph Melano Casta进行全身三维重建的实验方法。

我们在实验室中采用此方法对瞳孔状态期间发育中的器官进行活体可视化观察。现在开始操作。在开始之前，请注意有一段配套视频应在观看本视频之前先行学习，其中对光学投影断层扫描的一些技术细节进行了比此处更为详细的说明。

此外，另一段视频介绍了对较大动物的已制备组织或器官进行成像的方法。本视频涵盖的所有实验均将使用果蝇转基因品系，包括在唾液腺中表达的 EL A gal4、在成体翅和胸部的幼虫前体组织中表达的 apteris gal4，以及表达荧光蛋白的转基因品系。

为了响应表达GAL4的UAS-GFP和白色1118品系，将携带UAS转基因的非荧光对照雄蝇与携带GAL4转基因的处女雌蝇杂交，以实现组织特异性GFP表达。杂交实验使用8至10只处女雌蝇和雄蝇，在标准果蝇培养基中加入少量酿酒酵母进行交配。杂交管瓶置于25°C、湿度可控的培养箱中，保持12小时光照与12小时黑暗的循环条件。

在开始杂交后的两天，将亲本转移至新的培养管中，再过五到六天，未孵化幼虫（PUI）将开始在培养管中出现，此时幼虫呈白色（PrepU）。在荧光解剖显微镜下根据GFP表达情况筛选白色未孵化幼虫。选择白色前期PUI可确保动物发育阶段的准确性，因为它们保持白色的时间约为一小时。

瞳孔形成后，它们会逐渐出现色素，呈现棕褐色。用湿润的画笔从样品瓶中轻轻收集表达GFP的幼体，放入培养皿中的水滴或PBS缓冲液中，但必须擦去自体荧光物质。此时，用画笔轻柔操作，幼体即可准备进行断层成像。

如果需要继续培养以达到正确的发育阶段，可将 PrepU 置于带有湿润滤纸的培养皿中，或置于干净的食物小瓶内。这将确保成像所需的足够湿度和正常发育。PrepU 必须附着在直径为 800 微米的玻璃毛细管内壁上。

用超级胶水涂抹蛹的后端，将预蛹粘胶面朝向毛细管，使果蝇的前后轴与毛细管平行。动物的前部将悬于毛细管之外。此时，毛细管已固定在显微镜的旋转台上。

将旋转平台的倾斜轴调整至垂直位置，使管的旋转轴与成像 CCD 的像素列平行。微调果蝇的位置后，开始成像。本示例中，需对具有荧光唾液腺的动物进行成像，可通过 EAG four 与 U-A-S-G-F-P 品系杂交获得在唾液腺中表达 GFP 的果蝇。

首先，将一只已固定的未成熟蛹置于载物台上，用激发光束照射该未成熟蛹，并采集其GFP荧光信号。在透射成像过程中，围绕其垂直轴将PrepU旋转360度，并采集透射照明图像。每幅图像对应10度的旋转角度。

总采集时间取决于荧光强度以及激发光束的强度。典型时间约为一分钟。在本示例中，将对表达绿色荧光蛋白（GFP）的果蝇（DSO品系）蛹的翅成虫盘进行成像。

该蛹可从 Aus GAL 四号品系与 U-A-S-G-F-P 品系杂交的试管中收集获得。前期蛹的制备方法如前所述。然而，由于本实验的成像时间约为八小时，必须保持环境湿润且处于室温，以避免动物脱水或死亡。为防止目标组织中荧光四号分子的淬灭，以及避免激光束灼伤动物，需在激发光路中放置快门。如前法，以激发光束照射样本，并通过透射照明法采集 GFP 荧光信号。

蛹前期个体沿其垂直轴完成完全旋转。在数据采集过程中，旋转仅需一分钟，并在不同的时间间隔重复进行。为了获得翅膀发育过程中的延时图像序列，可至少持续采集六小时数据，采集速率为每小时100张图像。

必须通过该快门控制总光照暴露，以防止造成损伤或光漂白。本视频展示了从 PrepU 阶段到瞳孔头部回避期间获取的图像。在重建三维图像时，存在强烈的前向散射，必须予以考虑，而这种散射无法用扩散近似来描述。

因此，为了进行重建，必须确定光传播的前向散射模型。为简化起见，我们忽略吸收效应。散射程度通过实验测定。为此，将一个带有标准荧光标记的异物插入无荧光的白色1118期三龄幼虫中，然后对其进行扫描以生成前向模型数据。首先，用PS 5.5荧光染料填充一根100微米的石英毛细管。

利用毛细作用，将毛细管以与前轴呈45度角的方向插入蛹体内，将PrepU固定在毛细管中，并如前所述将其适当放置在旋转台上。现在使用低数值孔径透镜的激发激光束照射前蛹，并采集前蛹的荧光透射图像。如前所述，采用MATLAB软件将数据拟合到明确的理论前向模型中。为了简化重建过程，选择输运方程的扩散近似（diffusion approximation）作为前向散射模型，因其能够描述前向散射状态并较好地拟合实验数据。

在确定了正确的前向模型后，我们可以重建唾液腺并获得时间序列的断层重建图像。如果您计划使用自由空间断层成像，也可设置用于折射率匹配的配置算法。首先，我们展示发育早期唾液腺的三维重建结果。

作为对照，唾液腺的组织学染色显示，重建结果与组织学图像具有良好的相关性。该延时电影记录了翅成虫盘的发育过程，数据来自单个活体样本。在相同时间点对翅成虫盘进行组织学染色作为对照，结果显示重建图像与组织学图像高度吻合。

我们刚刚向您展示了如何构建一个系统，用于对活体果蝇（Drosophila）体内三维结构进行成像，并实现时间序列观测。该系统使我们能够追踪果蝇的形态发生过程，并连续六小时观察其翅膀的发育。在执行该操作时，至关重要的是为光在果蝇体内的传播选择正确的前向传播模型。

该方法可与组织学技术结合使用，以揭示在蛇类瞳孔阶段器官发育的过程，并且可以针对体型相似的不同生物的研究进行适当修改。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。