差示扫描量热 - 用于评估蛋白质抗原的热稳定性和构象的方法

该程序的总体目标是使用差示扫描量热法评估工业环境中蛋白质的热稳定性和结构构象。差示扫描量热法测量样品的摩尔热容与温度的关系，并已成功用于评估蛋白质的热稳定性和结构构象。这个相对简单的程序不像其他生物物理方法那样依赖于结构螺旋度或内在荧光团。

该技术的另一个优点是，它直接测量热转变温度和破坏相互作用所需的能量，从而稳定蛋白质的三级结构。当与展开的结合结合使用时，热转变温度可以作为监测生物制剂制造过程的批次间一致性的有用参数。此方法的可视化演示可以作为一种交互式媒体，有效地帮助新用户完成关键步骤。

首先，打开差示扫描量热仪。然后向系统供应氮气。这将增加样品池中的压力，以抑制样品的沸腾，并防止在高温下形成气泡。

根据电池的构成材料，根据制造商推荐的压力调整氮气供应的压力，以避免损坏电池。确保所有清洁剂储液罐都已填充到所需的体积。所需的清洁剂包括用于清洗池的清洁剂和每次样品运行后用于清洁池的水。

在实验前将样品保持室的温度设置为合适的值，最好是 5 摄氏度，以保持样品的完整性。重要的是平衡样品与缓冲液，以确保溶液之间的唯一区别是蛋白质。因此，观察到的热容差异可以正确归因于蛋白质。

使用合适的蛋白质浓度测定方法（如 Lowry 方法）测定蛋白质样品的浓度。对于本协议中使用的仪器，优选的工作范围为每毫升 0.5 至 1 毫克蛋白质。对照将用作实验参考的缓冲液对样品进行透析。

在真空中对样品和参比缓冲液进行脱气，以去除可能导致体积不准确的微气泡。在层流生物安全柜中工作，使用微量移液器和无菌吸头将样品成对加载到各自的缓冲液中，放入 96 孔板中。用缓冲液填充前两对孔，以执行缓冲液-缓冲液扫描，以在样品测量之前验证仪器的适用性。

在最后两对井中注满水，以便进行水扫描以清洁细胞。然后用密封膜盖住 96 孔板。在将板从生物安全柜中取出之前，请确保孔正确密封，以避免样品污染。

最后，将板以正确的方向放入样品储存室中。使用采集软件，按照板的加载顺序输入样品信息。输入蛋白质浓度（如果可用）。

否则，请在数据分析前将浓度输入分析软件。选择确保在每次样品扫描前用洗涤剂清洁池的选项。清洁后应进行多个水冲洗步骤，以确保细胞中没有洗涤剂残留物。

将实验的起始温度设置为 20 摄氏度，该温度可能因样品而异。对于已知蛋白质，可以使用预定的起始温度，而对于未知样品，可以使用较低的起始温度。然后设置实验的最终温度。

最终温度也可能根据样品的先验知识而变化。接下来，设置实验的扫描速率。建议以不同的扫描速率扫描未知样品，以评估去折叠的动力学。

设置采集软件以重新扫描样品以检查热转变的可逆性。如果第二次扫描获得的焓至少是第一次扫描焓值的 80%，则认为蛋白质的去折叠是可逆的。将实验后恒温器设置为 10 摄氏度，以保持量热计单元的完整性。

在执行实验之前，请验证实验设置参数是否正确。如果一切就绪，请开始实验。实验结束后，按照文本协议中的说明进行数据分析。

对于分析，基线扣除是手动执行的。此步骤的一致性对于获得可比较的结果至关重要。此处显示了实验运行的代表性原始数据，包括缓冲液和水扫描。

被分析的样本是处于天然和解毒状态的毒素。样品扫描经过单独处理，以得出每个样品的熔解温度和焓值。对于原生状态，融化温度为 55.55 摄氏度，毒素的焓为每摩尔 3.157 乘以 10 到五分之一卡路里。

相反，毒素在解毒状态下的融化温度为 81.21 摄氏度，焓为每摩尔 3.656 乘以 10 到五分之一卡路里。毒素在其天然和解毒状态下的处理数据的叠加表明，根据熔化温度值，解毒样品比其天然状态更具热稳定性。它还表明排毒过程会给毒素的三级结构带来结构性变化。

在尝试此过程时，请务必记住提供足够的清洁剂和水，以防止细胞和注射器的交叉污染，因为它们的透明度对于准确结果至关重要。观看本视频后，您将对差示扫描量热法作为评估蛋白质热稳定性和构象的方法有很好的了解。您还可以从生成的热运行中进行有意义的扣除。

按照这个程序，可以执行其他方法，如圆二色性，以回答有关展开过程中二级结构变化的其他问题。为一系列相同产品批次收集的数据已用于创建经验基线，以检查工艺变化、配方和储存条件对疫苗生产蛋白质抗原结构构象的影响。