Name: 斑马鱼化工屏幕自动成像和分析的发展。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 了解利用自动化共聚焦成像和定制算法对斑马鱼转基因胚胎进行高通量化学筛选的方法。该技术可定量分析小分子BCI对成纤维细胞生长因子信号通路的剂量依赖性影响，为发育生物学研究提供高效平台。

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本工作由美国国立儿童健康与人类发展研究所/国立卫生研究院（NICHD/NIH，项目编号1R01HD053287）资助Hukriede，美国国家癌症研究所/国立卫生研究院（NCI/NIH，项目编号P01 CA78039）资助Vogt，以及美国国家心肺血液研究所/国立卫生研究院（NHLBI/NIH，项目编号1R01HL088016）资助Tsang。

1) 建立斑马鱼交配并进行BCI处理。
<ol>
<li> 治疗前两天，鉴定纯合子雄性 Tg(dusp6:d2eGFP)pt6 斑马鱼并分别放入交配缸中1加入隔离装置和一条野生型 AB* 雌性鱼，置于交配笼中过夜。</li>
<li> 第二天早上移除分隔器，1小时后收集胚胎。将胚胎转移至含有E3溶液（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4）的100 mm培养皿中，并在 28°C 孵育6小时。移除死亡和未受精的胚胎，加入新鲜E3溶液，过夜孵育。</li>
<li> 挑选发育阶段相近（24 hpf）且GFP表达均匀的转基因胚胎。将胚胎逐个排列至96孔板的各个孔中。</li>
<li> 用移液器吸除多余的 E3 溶液。加入 200μl 用多通道移液器将E3溶液加入每个孔中。</li>
<li> 按所列顺序加入以下化合物： 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>1</td>
 <td>2</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>6</td>
 <td>7</td>
 <td>8</td>
 <td>9</td>
 <td>10</td>
 <td>11</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>A</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>F</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>G</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (0.5 mM)</td>
 <td>2μl BCl (1 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2 mM)</td>
 <td>2μl BCl (2.5 mM)</td>
 <td>2μl DMSO</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
最终浓度为 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI 溶于 1% DMSO 中。用铝箔覆盖培养板，于 37°C 孵育 6 小时 28°C.</li></ol>
2）96孔板的自动化成像与分析。
<ol>
<li> 向每个孔中加入 10μl 三卡因（0.61 mM），以麻醉 30 小时受精龄（30 hpf）的胚胎。</li>
<li> 将培养板装入 Molecular Devices Imagexpress Ultra 仪器中。</li>
<li> 打开 Metaxpress 软件。选择使用 4 倍物镜和最大针孔直径的配置，设置激光自动对焦以检测培养板底部，并确定用于检测感兴趣区域的最佳 Z 平面。在 488/525 nm（GFP）的激发/发射波长下采集图像。将扫描区域设置为单个位点，大小为 2000×2000 像素（4×4 mm），无像素合并。调节激光功率和增益，使阳性对照图像中最亮区域不发生信号饱和。在多个阳性和阴性对照孔中确认图像采集正常。</li>
<li> 开始培养板扫描。仪器将自动采集所有孔的图像，并将其归档至 SQL 服务器数据库中。</li>
<li> 使用 Definiens Developer 中的 Cellenger 应用模块，以及能够识别 Molecular Devices Imagexpress Ultra 平台生成的图像格式和文件结构的导入滤镜，将图像上传至 Definiens Developer。</li>
<li> 使用定制设计的认知网络技术算法（亦称规则集）处理图像。该算法基于近期发表的规则集2进行自主开发，旨在自动识别胚胎、卵黄和头部，并量化表达 GFP 的头部结构的亮度和面积。对于未检测到胚胎或无法明确识别头部的孔（例如因化合物毒性过高或图像失焦），将从分析中排除。使用若干阴性对照图像（溶剂处理）和阳性对照图像（BCI 处理）对算法进行配置，确保在两种情况下均能正确识别头部和卵黄。将“头部结构”检测阈值设为卵黄平均强度的倍数，直至亮部头部结构的检测结果与肉眼观察一致。定义需导出的参数。在本示例中，最具信息量的参数是头部内 GFP 阳性区域的总积分亮度，下文简称“头部结构总亮度”（图 1）。 
<img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="剂量-反应曲线，EC50 分析；亮度 vs. log μM BCI，比较 1-1 和 1-2 培养板的结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="figure 1"> 
图 1 显示 BCI 对转基因胚胎中 GFP 表达剂量依赖性效应的图表。</li>
<li> 使用集成的作业调度器对所有培养板图像运行该算法。Definiens 软件采用多处理器（“引擎”）的分布式计算，可同时分析多幅图像。算法根据图像分析结果计算数值指标，并将这些数据连同已应用分析的处理后图像副本一同保存至数据库中。</li>
</ol>

代表性结果：
所有图像分析完成后，数据可在 Cellenger 软件内进行可视化，或导出至第三方软件（如 Excel、GraphPad Prism）进行进一步分析和图形呈现。图2展示了经溶剂对照处理和BCI处理的孔中存档的扫描图像，分别在应用与不应用CNT分析条件下的结果。图1记录了BCI对Tg(dusp6:d2EGFP)pt6胚胎中GFP报告基因表达的剂量依赖性效应。引发半数最大反应（EC50）所需的浓度约为12 μM。 
<img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="DMSO和20μM BCI处理下的斑马鱼胚胎形态，荧光显微镜，基因表达研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2 转基因斑马鱼胚胎的自动图像采集与分析。（A）30小时受精后（30hpf）经DMSO溶剂对照处理的Tg(dusp6:d2eGFP)pt6胚胎。（B）经20μM BCI处理的转基因胚胎，显示GFP表达增强。（C）对（A）中胚胎运行Definiens规则集以检测头部GFP表达后的图像。橙色斑点表示软件测量GFP荧光强度的位置。（D）对（B）中胚胎运行Definiens规则集以检测头部GFP表达后的图像。橙色斑点表示软件测量GFP荧光强度的位置。注意：规则集能够识别出经处理胚胎中GFP表达区域的扩大。

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

限制斑马鱼化学筛选通量的一个主要因素是缺乏系统处理96孔板以进行成像和分析的方法。由于多细胞生物体的图像本身具有复杂性、低对比度和异质性，现有的图像分析算法无法有效识别和量化生物体内的特定结构。因此，大多数已发表的斑马鱼化学筛选都需要专门人员在整个实验过程中对每个孔进行目视检查。这种方法通常导致无法生成数值型读数，也无法完整归档筛选图像和数据。此外，人工评估排除了基于图像筛选的若干关键优势，包括能够对筛选结果进行回顾性分析、能够考察在筛选过程中并非主要关注的表型变化（例如毒性或发育缺陷），以及能够使用相同的化合物库将筛选数据与过去或未来的筛选结果进行交叉比对。
 
本报告中，我们重点介绍了一种无需人工干预即可对多孔板中的斑马鱼胚胎进行自动成像与分析的方法。我们利用 ImageXpress Ultra 激光扫描共聚焦读板仪（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）实现了对 96 孔板中 Tg(dusp6:d2EGFP)pt6 胚胎的自动图像采集，并基于 Definiens 的认知网络技术开发了一种图像分析算法，用于定量分析转基因胚胎头部的 GFP 表达。该方法能够提供梯度响应结果，并量化小分子 FGF 信号通路激活剂在体内的活性。类似结果也通过基于落射荧光的 ArrayScan II（Cellomics Inc.，Pittsburgh，PA）获得，表明可在多种市售的读板仪上实现对斑马鱼胚胎的自动图像采集2。自动分析多细胞生物图像的方法的建立，消除了对人工视觉评分的依赖，实现了数值数据与图像的生成及归档，便于后续回顾性分析以及与未来筛选结果的比较。

<table><tbody><tr><td>三卡因（MS222）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 # A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼化学筛选的自动化成像与分析方法开发

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

我们展示了基于图像的高内涵筛选（HCS）方法在斑马鱼胚胎中用于鉴定可调控 FGF/RAS/MAPK 信号通路的小分子化合物。斑马鱼胚胎是体内高内涵化学筛选的理想体系。出生后1天的胚胎直径约为1毫米，可轻松排列至96孔板中，这是高通量筛选的标准格式。在发育的最初一天内，胚胎呈透明状态，大多数主要器官均已形成，因而能够直观观察胚胎发育过程中的组织形成。然而，斑马鱼化学筛选的完全自动化仍面临挑战，尤其是在自动图像采集与分析方面。我们此前构建了一种转基因报告品系，该品系在FGF活性调控下表达绿色荧光蛋白（GFP），并已证实其在化学筛选中的应用价值。1为了建立高通量全生物体筛选的方法学，我们开发了一套系统，可对受精后24-48小时（hpf）的斑马鱼胚胎在96孔板中进行自动成像与分析。2在本视频中，我们重点介绍在受精后24小时将转基因胚胎排列至多孔板中的操作步骤，以及添加一种可增强FGF信号通路活性的小分子化合物（BCI）的方法。3. 将培养皿孵育6小时，随后加入三卡因以麻醉幼鱼，然后在Molecular Devices ImageXpress Ultra激光扫描共聚焦HCS读取仪上进行自动成像。使用我们开发的基于Definiens Developer软件的认知网络技术算法对图像进行处理，以检测和量化转基因胚胎头部中GFP的表达。在本示例中，我们重点展示了该算法测量BCI处理胚胎中GFP报告基因表达剂量依赖性效应的能力。

我们报道了一种用于多孔板中转基因斑马鱼胚胎自动成像与分析系统的开发。该系统展示了测量小分子BCI对成纤维细胞生长因子报告基因表达的剂量依赖性效应的能力，并为建立高通量斑马鱼化学筛选技术提供了支持。

我们展示了基于图像的高内涵筛选（HCS）方法的应用，以鉴定能够调控FGF/RAS/MAPK信号通路的小分子……

本视频中，采用基于图像的高内涵筛选方法，评估小分子对斑马鱼胚胎中成纤维细胞生长因子Ras/MAP激酶信号通路的调节作用。将转基因雄性斑马鱼与野生型雌性斑马鱼在繁殖笼中交配，受精卵落入底部，收集后转移至培养皿中。胚胎在过夜孵育后，被分配至96孔圆底板的各个独立孔中。加入小分子BCI以过度激活FGF信号通路，随后将培养板孵育六小时。使用共聚焦培养板读取仪采集每孔的图像，并通过自行设计的算法进行分析，该算法可报告特定胚胎结构中的荧光强度。大家好，我是来自匹兹堡大学微生物学与分子遗传学系Michael Chang博士实验室的Hiba Kado。大家好，我是来自匹兹堡大学药物发现研究所的Andrea Spock。今天我们将向您展示斑马鱼胚胎的繁殖、筛选和排列方法，用于化学处理。在96孔板中，我们将使用转基因斑马鱼胚胎，这些胚胎可报告成纤维细胞生长因子的活性，并用一种能够过度激活该通路的小分子进行处理。我们将向您展示如何利用高内涵筛选方法，在转基因斑马鱼胚胎中自动获取、分析和定量成纤维细胞生长因子的活性。该流程将重点介绍如何运用转基因斑马鱼和高通量化学筛选的平台技术。现在，让我们开始吧。处理前两天，鉴定纯合的雄性转基因斑马鱼，并将其放入各自的交配缸中。在鱼缸中加入隔离板，然后向每个鱼缸中加入一条野生型雌性斑马鱼，于28摄氏度下过夜饲养。次日早晨移除隔离板，一小时后将鱼转移到新的鱼缸中，并将胚胎倒入塑料筛网中。将胚胎转移至含有 E3 溶液的 100 毫米培养皿中，在 28 摄氏度下孵育 6 至 8 小时。孵育结束后，在体视显微镜下观察胚胎。适合用于实验的胚胎将处于出膜阶段。此时，移除未受精的胚胎，这些胚胎将停留在单细胞阶段。同时，移除不具活力的胚胎，这些胚胎外观浑浊或形态异常。然后加入新鲜的E3溶液，在28°C下过夜培养。第二天，将胚胎置于荧光体视显微镜下，根据发育阶段相似性和GFP表达均匀性对转基因胚胎进行分选。24小时后（HPF）的胚胎可见明显的中脑-后脑边界，GFP表达强烈，眼睛形态完整，背侧视网膜呈GFP阳性。这些胚胎活动活跃，会在卵膜内通过塑料移液管轻微移动和扭动。将受精后24小时的胚胎逐个转移至96孔板的各个孔中。使用微量移液器从孔中移除多余的E3溶液。然后使用多通道移液器向每孔加入200微升E3溶液。接下来，向第1列和第12列的所有孔中各加入2 µL DMSO。然后按如下方法加入以DMSO配制的BCL：向第2列和第7列加入1 µmol/L的BCL 2 µL；向第3列和第8列加入5 µmol/L的BCL 2 µL；向第4列和第9列加入10 µmol/L的BCL 2 µL；向第20列加入20 µmol/L的BCL 2 µL。将微摩尔浓度加入第五列和第十列，最后将25微摩尔浓度加入第六列和第十一列。然后用铝箔包裹酶标板，在28°C下孵育六小时。向每个孔中加入 10 µL 三卡，以麻醉 30 HPF 胚胎。然后将培养板放入分子装置 ImageXpress Ultra Open MetaXpress 软件中。选择带有 Forex 物镜和最大针孔直径的配置。将激光自动对焦设置为检测板底部，并使用预设的最佳Z轴偏移量。为检测感兴趣区域，将扫描区域设置为单个2000 × 2000像素的位点，无重叠。选择合适的板类型，并使用488纳米氩激光器，激发波长为488纳米，发射波长为525纳米。然后选择一个经溶剂处理的胚胎所在的孔，并点击“查找样本”。仪器将自动进行对焦扫描，并获取单幅图像以确认图像采集正常。随机选择一个经溶剂处理的孔，并采集图像。如果图像聚焦清晰，并且头部显示出 GFP 表达，将光标置于最亮区域，确认荧光强度处于 16 位相机的检测范围内，即低于 65,000 单位。使用另一种溶剂对照和若干个化合物处理孔重复上述步骤。如有必要，调整激光功率和增益，使阳性对照图像中最亮区域不出现饱和。接下来，在平板采集和控制窗口中，选择“采集平板”以开始平板扫描。仪器将自动为整块微孔板的每个孔采集一张图像，并将其存档至SQL服务器数据库中。扫描完成后，通过启用slinger选项打开Developer，将图像上传至D definition的Developer中。创建一个新的工作区。然后从文件菜单中选择自定义导入。接下来，导航到包含图像的文件夹并打开一个样本文件。选择一种可识别由Molecular Devices ImageXpress Ultra平台生成的图像格式和文件结构的导入滤镜。现在，为了处理图像，打开一张对照图像，并加载所需的认知网络技术（CNT）算法或规则集。此处使用的自定义算法旨在自动识别胚胎、卵黄和头部，并量化表达GFP的头部结构的亮度和面积，执行规则集以完成头部和卵黄的检测步骤。为确保卵黄囊和头部的正确识别，若卵黄过大或过小，需修改规则集以调整卵黄检测阈值。接着，运行规则集至亮色头部结构检测阶段。为确保头部中GFP表达区域的正确识别，需修改规则集，将头部结构检测阈值调整为背景平均强度的若干倍，直至亮色头部结构的检测结果与视觉观察一致。接下来，在若干张随机选择的经溶剂处理胚胎生成的图像以及经PCI处理胚胎的阳性对照图像上手动执行整个规则集。要对所有板图像运行该算法，请选择要分析的板，然后选择“分析”，再导航至已优化的规则集，分析所有孔。利用集成的作业调度器，扫描过程中会自动将空孔或模糊图像排除在分析之外。系统会显示一张持续更新的保留图。运行期间可随时访问数据和图像，以便进行视觉检查。数值数据和处理后的图像将自动保存。在所有图像分析完成后，数据可导出至第三方软件，如 Excel、GraphPad 或 Prism。该图显示了经溶剂处理和经 BCI 处理的孔中存档的扫描图像，包括有和无 CNT 分析的结果。在转基因胚胎的眼部、中后脑边界以及三叉神经节中可检测到表达的绿色荧光蛋白（GFP）。注意，GFP的荧光强度和表达区域均有所扩大。在本实验中经BCI处理的胚胎显示出BCI对转基因胚胎中GFP报告基因表达具有剂量依赖性的影响。引发半数最大反应所需的浓度（即 EC 50）约为 12 微摩尔。我们刚刚向您展示了如何繁殖、收集并将转基因斑马鱼胚胎排列至 96 孔板中。我们已向信号通路的自身激活剂中添加了逐渐增加浓度的 PCI。我们还展示了如何实现转基因胚胎成像的自动化，并使用基于认知网络技术的自定义算法对图像进行分析。通过这种方法，我们能够以定量且梯度化的方式测量成纤维细胞生长因子信号通路的小分子激活剂所产生的效应。在执行该实验流程时，重要的是要仔细挑选胚胎，以尽量减少样本间的变异性。就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利。

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