斑马鱼化学筛选的自动化成像与分析方法开发

在本视频中，通过基于图像的高内涵筛选，评估小分子对斑马鱼胚胎中成纤维细胞生长因子Ras/MAP激酶信号通路的调节作用。将转基因雄性斑马鱼与野生型雌性斑马鱼在繁殖笼中交配，受精卵落入底部，收集后转移至培养皿中。胚胎过夜孵育后，被分配至96孔圆底板的各个孔中。

加入小分子BCI以过度激活FGF信号通路，随后将培养板孵育六小时。使用共聚焦培养板读取仪采集每孔的图像，并通过自行设计的算法进行分析，该算法可报告特定胚胎结构中的荧光强度。大家好，我是来自匹兹堡大学微生物学与分子遗传学系Michael Chang博士实验室的Hiba Kado。

大家好，我是来自匹兹堡大学药物发现研究所的Andrea Spock。今天我们将向您展示斑马鱼胚胎的繁殖、筛选和排列方法，用于化学处理。在96孔板中，我们将使用转基因斑马鱼胚胎，这些胚胎可报告成纤维细胞生长因子的活性，并用一种分子进行处理，以过度激活该通路。

我们将向您展示如何利用高内涵筛选方法，在转基因斑马鱼胚胎中自动获取、分析和定量成纤维细胞生长因子的活性。该流程将重点介绍一种平台技术，用于结合转基因斑马鱼模型与高通量化学筛选。现在，让我们开始。

处理前两天，鉴定纯合的雄性转基因斑马鱼，并将其分别放入单独的交配缸中。在缸中加入隔离板，然后向每个缸中添加一条野生型雌性斑马鱼，于28摄氏度下过夜饲养。次日早晨移除隔离板。一小时后，将鱼转移到新的缸中，并将胚胎倒入塑料筛网中。

将胚胎转移至含有 E3 溶液的 100 毫米培养皿中，在 28 摄氏度下孵育 6 至 8 小时。孵育结束后，在体视显微镜下观察胚胎。适合用于实验的胚胎将处于囊胚期。

此时，移除未受精的胚胎，这些胚胎将停留在单细胞阶段。同时，移除不具活力的胚胎，此类胚胎外观浑浊或形态异常。随后加入新鲜的E3溶液，并在28°C下孵育过夜。

第二天，将胚胎置于荧光体视显微镜下，根据发育阶段相似性和GFP表达均匀性对转基因胚胎进行筛选。24小时后（24 HPF）的胚胎可见明显的中后脑边界，GFP表达强烈，眼睛形态完整，背侧视网膜呈GFP阳性。这些胚胎具有活性，会在卵膜内活动，并可通过塑料移液管使其轻微晃动。

将受精后24小时的胚胎逐个转移至96孔板的各个孔中。使用微量移液器从孔中移除多余的E3溶液。然后使用多通道移液器向每孔加入200微升E3溶液。

接下来，向第1列和第12列的所有孔中各加入2 µL DMSO。然后按如下方法加入以DMSO配制的BCL：向第2列和第7列加入1 µmol/L的BCL 2 µL；向第3列和第8列加入5 µmol/L的BCL 2 µL；向第4列和第9列加入10 µmol/L的BCL 2 µL；向第20列加入20 µmol/L的BCL 2 µL。

将微摩尔浓度加入至第五和第十列，最后将25微摩尔浓度加入至第六和第十一列。随后用铝箔覆盖酶标板，并在28摄氏度下孵育六小时。

向每个孔中加入 10 µL 三卡溶液，以麻醉 30 小时后受精（HPF）的胚胎。然后将培养板装入 Molecular Devices ImageXpress Ultra Open MetaXpress 软件中。选择配备物镜和最大针孔直径的配置。

将激光自动对焦设置为检测板底部，并使用预先确定的最佳Z轴偏移量。为检测感兴趣区域，将扫描区域设置为单个2000 × 2000像素的位点，无重叠。选择合适的板类型，并选择488纳米氩激光器，激发波长与发射波长设置为488/525纳米。

然后选择一个含有经溶剂处理的胚胎的孔，点击“查找样本”。仪器将自动进行对焦扫描，并获取单张图像以确认图像采集正常。随机选择一个经溶剂处理的孔，并采集图像。

如果图像聚焦清晰，并显示头部存在GFP表达，则将光标置于最亮区域，确认荧光强度处于16位相机的检测范围内，即低于65,000单位。

使用另一种溶剂对照和若干化合物处理孔重复上述步骤。如有必要，调整激光功率和增益，使阳性对照图像中最亮区域不出现饱和。接下来，在平板采集和控制窗口中，选择“采集平板”以开始平板扫描。

仪器将自动为整块微孔板的每个孔采集一张图像，并将这些图像存档至 SQL 服务器数据库中。扫描完成后，通过启用 Slinger 选项打开 Developer，将图像上传至 D definition's Developer 中。

创建一个新的工作区。然后从文件菜单中选择自定义导入。接下来，导航到包含图像的文件夹并打开一个样本文件。

选择一种可识别由分子设备 ImageXpress Ultra 平台生成的图像格式和文件结构的导入滤镜。现在，为了处理图像，打开一张对照图像，并加载所需的 Cognition Network Technology（CNT）算法或规则集。此处使用的自定义算法旨在自动识别胚胎、卵黄和头部，并量化表达 GFP 的头部结构的亮度和面积，执行该规则集以实现头部和卵黄的检测阶段。

为确保卵黄囊和头部的正确识别，若卵黄过大或过小，需修改规则集以调整卵黄检测阈值。接下来，执行规则集至亮头结构检测阶段。为确保头部中GFP表达区域的正确识别，需修改规则集，将头部结构检测阈值调整为平均强度的若干倍，直至亮头结构的检测结果与视觉观察一致。

接下来，在若干张随机选择的由溶剂处理的胚胎生成的图像以及由PCI处理的胚胎生成的阳性对照图像上，手动执行整个规则集。要在所有板图像上运行该算法，需选择待分析的板，然后选择“分析”，接着导航至已优化的规则集，并分析所有孔。

利用集成的作业调度器，扫描过程中会自动将空孔或图像模糊的孔排除在分析之外。系统会实时更新保留图谱。运行期间可随时访问数据和图像，以便进行视觉检查。

数值数据和处理后的图像将自动保存。在所有图像分析完成后，数据可导出至第三方软件，如 Excel、GraphPad 或 Prism。该图显示了经溶剂处理和经 BCI 处理的孔中，有和无 CNT 分析的存档扫描图像。

在转基因胚胎的眼部、中脑与后脑交界处以及三叉神经节中可检测到表达的绿色荧光蛋白（GFP）。注意，GFP的荧光强度及其表达区域均有所扩大。在本实验中经BCI处理的胚胎显示，BCI对转基因胚胎中GFP报告基因的表达具有剂量依赖性效应。

引发半最大反应所需的浓度，即 EC 50，约为 12 微摩尔。我们刚刚向您展示了如何繁殖、收集并将转基因斑马鱼胚胎排列到 96 孔板中。我们已在信号通路的自身激活剂中添加了逐渐增加浓度的 PCI。

我们还展示了如何实现转基因胚胎成像的自动化，并使用基于认知网络技术的自定义算法对图像进行分析。通过该方法，我们能够以定量且梯度化的方式测量成纤维细胞生长因子信号通路的小分子激活剂所产生的效应。在执行该实验流程时，重要的是要仔细挑选胚胎，以尽量减少样本间的变异性。

就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。