斑马鱼化工屏幕自动成像和分析的发展。

在本视频中，进行了基于图像的高内涵筛选，以评估基于小分子的成纤维细胞生长因子 Rasm 映射激酶通路的调节 在斑马鱼胚胎中，转基因雄性和野生型雌性斑马鱼在繁殖笼中交配。受精卵落在底部，被收集并转移到培养皿中。将胚胎孵育过夜，然后放入 96 孔圆底板的各个孔中。

添加小分子 BCI 以超激活 FGF 信号传导，并将板孵育 6 小时。使用共聚焦读板器捕获来自每个遗嘱的图像，并使用自行设计的算法进行分析，该算法报告特定胚胎结构中的荧光强度。大家好，我是来自匹兹堡大学微生物学和分子遗传学系 Michael Chang 博士实验室的 Hiba Kado。

大家好，我是来自匹兹堡大学药物研发研究所的 Andrea Spock。今天，我们将向您展示用于化学处理的斑马鱼胚胎的繁殖、选择和排列程序。在 96 孔板中，我们将使用报告玻璃纤维生长因子活性的转基因胚胎，并用超激活过去白色的分子处理。

我们将向您展示我们如何使用高内涵筛选方法自动采集、分析和定量转基因斑马鱼胚胎中的成纤维细胞生长因子活性。该程序将重点介绍利用转基因斑马鱼和高通量化学筛选的平台技术。那么让我们开始吧。

治疗前两天，识别纯合雄性转基因斑马鱼并将它们放入单独的交配池中。在水箱中添加分离器，然后向每个水箱中添加一条野生型雌鱼，并将鱼在 28 摄氏度的交配笼中过夜。第二天早上，取下分离器一小时后，将鱼移到新水箱中，将胚胎倒入塑料筛中。

将胚胎转移到装有 E 3 溶液的 100 毫米培养皿中，并在 28 摄氏度下孵育 6 到 8 小时。孵化后，在立体显微镜下检查胚胎。适合实验的胚胎将接受气体测试。

此时，去除任何未受精的胚胎，这些胚胎将保持在单细胞阶段。此外，去除看起来不透明或畸形的无活力胚胎。然后加入新鲜的 E 3 溶液，并在 28 摄氏度下孵育过夜。

第二天，将胚胎置于荧光立体显微镜下，以对转基因胚胎进行相似阶段和均匀的分类。GFP 表达 24 个 HPF 胚胎显示可见的中后脑边界，具有强烈的 GFP 表达和形状良好的眼睛，具有 GFP 阳性背视网膜。这些胚胎很活跃，会使用塑料牧场移液器在它们的冠状物中移动和摆动。

一次将 24 个 HPF 胚胎转移到 96 孔板的各个孔中。使用微量移液器，从孔中去除任何多余的 E 3 溶液。然后使用多通道移液器，向每个孔中加入 200 微升 E 3 溶液。

接下来，向第 1 列和第 12 列的所有孔中加入 2 微升 DMSO。然后按如下方式加入 2 微升在 DMSO 中制备的 BCL，1，微摩尔到 2 列和 7 列中。5 微摩尔至 3 和 8,10 微摩尔至 4 和 9 20。

微摩尔至第 5 列和第 10 列。最后 25 微摩尔到第 6 列和第 11 列。现在用铝箔盖住板，并在 28 摄氏度下孵育 6 小时。

向每个孔中加入 10 微升 trica 以麻醉 30 个 HPF 胚胎。然后将板加载到 Molecular Devices Image Express ultra Open Meta Express 软件中。选择具有外汇物镜和最大针孔直径的配置。

配置激光自动对焦以检测板底部并使用预定的最佳 Z 偏移。要检测感兴趣的区域，请将扫描区域设置为 2000 x 2000 像素的单个站点，无偏移。选择合适的板类型和 488 纳米氩激光器，激发波长为 488 纳米，发射波长为 525 纳米。

然后选择一个包含载体处理胚胎的孔，然后单击查找样品。仪器将执行自动对焦扫描并采集单个图像，以确认图像采集正确。随机选择一辆经过良好处理的车辆并获取图像。

如果图像清晰并在头部显示 GFP 表达。将光标放在最亮的区域上，并验证荧光强度是否在 16 位相机的范围内。少于 65， 000 个单位。

对另一个载体控制和一些化合物处理的孔重复这些步骤。如有必要，调整激光功率和增益，使阳性对照图像中最亮的区域不会饱和。接下来，在板采集和控制窗口中，选择 acquire plate 以开始板扫描。

该仪器将自动为整个微孔板的每个孔采集一张图像，并将其存档在 SQL Server 数据库中。扫描完成后，将图像上传到 D 定义中。Developer 通过打开 developer 并启用 slinger 选项。

创建新工作区。然后从文件菜单中选择 自定义导入。接下来，导航到包含图像的文件夹并打开一个示例文件。

选择可识别 Molecular Devices Image Express ultra 平台生成的图像格式和文件结构的导入过滤器。现在要处理图像，打开一个控制图像并加载所需的认知网络技术或 CNT 算法或规则集。此处使用的自定义算法旨在自动识别胚胎、蛋黄和头部，并量化表达头部结构的 GFP 的亮度和面积，执行头部和蛋黄检测阶段的规则集。

为确保正确分配蛋黄袋和蛋头，请修改规则集，以便在蛋黄过大或过小时调整蛋黄检测阈值。接下来，将规则集执行到亮头结构检测阶段。为确保在头部中正确分配 GFP 表达区域，请修改规则集以将头部结构检测阈值调整为微弱强度的倍数，直到明亮头部结构的检测与视觉观察相匹配。

接下来，在从载体处理的胚胎生成的几个随机选择的图像和来自 PCI 处理的胚胎的阳性对照图像上手动执行整个规则集。要对所有板图像运行算法，请选择要分析的板，然后选择。Analyze（分析），然后导航到优化的规则集并分析所有井。

使用集成的作业调度程序，在扫描期间，空井或模糊图像将自动从分析中排除。将显示不断更新的 Keep Map。在运行期间，可以访问数据和图像以进行目视检查。

数值数据和处理后的图像会自动保存。分析完所有图像后，可以将数据导出到第三方软件，例如 Excel、GraphPad 或 prism。该图显示了经过处理和 A BCI 处理良好的车辆的存档扫描图像，有和没有 CNT 分析。

在转基因胚胎的眼睛、中后脑边界和三叉神经节中检测到应用的绿色荧光蛋白或 GFP。请注意，GFP 强度和表达域都已扩展。在这里的 BCI 处理胚胎中，可以看到 BCI 对转基因胚胎中 GFP 报告基因表达的剂量依赖性作用。

引发半数最大反应或 EC 50 所需的浓度约为 12 微摩尔。我们刚刚向您展示了如何将转基因斑马鱼胚胎培育、收集和排列到 96 孔板中。我们在信号通路的自身激活剂中添加了浓度增加的 PCI。

我们还展示了如何自动对转基因胚胎进行成像，并使用基于认知网络技术的定制设计算法分析图像。通过这种方法，我们能够以分级方式定量测量成纤维细胞生长因子信号传导的小分子激活剂的影响。进行此程序时，请务必记住仔细选择胚胎，以尽量减少样本之间的差异。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。