一种用于定量细菌中蛋白质-RNA 结合的检测方法

由于RNA结构的复杂性及其与蛋白质相互作用受多种因素影响，对体内蛋白质与RNA结合的表征仍是一个主要挑战。RNA结合蛋白（RBP）与RNA的亲和力在活的细菌细胞内进行测定。由于细胞环境会影响RNA的结构以及RBP与RNA的结合结果，因此在体内测量亲和力对于理解天然系统中此类相互作用至关重要。

成功的关键在于质粒的设计。设计时应采用多轮 delta，并避免引入终止密码子和移码突变。本实验方案开始时需设计结合位点盒。

每个微型基因包含一个EagI限制性酶切位点、位于卡那霉素抗性基因5'端上游40个碱基处的序列、pLac/Ara启动子、核糖体结合位点、mCherry基因的AUG起始密码子、一段间隔序列、RBP结合位点、mCherry基因5'端上游80个碱基的序列，以及一个ApaLI限制性酶切位点。为了提高实验的成功率，针对每个结合位点设计三个含有不同间隔序列的结合位点盒式结构，其间隔序列长度分别至少为1个、2个和3个碱基。在进行柱纯化之前，使用EagI HF和ApaLI对微型基因和目标载体进行双酶切消化。

将消化后的迷你基因连接至含有mCherry报告基因其余部分、终止子以及卡那霉素抗性基因的载体骨架上。随后将连接产物转化至大肠杆菌Top 10感受态细胞中。通过Sanger测序鉴定阳性转化子后，将纯化的质粒以96孔板格式保存于-20摄氏度。

同时将菌株以96孔板格式保存于含有甘油的储存液中，并置于负80摄氏度保存。定制合成所需的RBP序列，该序列不含终止密码子，作为两端带有限制性酶切位点的双链DNA微型基因。将已构建好的质粒转化至已含有RBP mCerulean质粒的化学感受态细菌细胞中。

为节省时间，使用八通道移液器将细胞接种至含有相应抗生素的LB（Luria-Bertani）琼脂八通道培养板上。在37°C条件下培养16小时后应可见菌落。针对每个双转化子挑选单个菌落，并转移至含有1.5 mL LB培养基（含适当抗生素）的48孔板中。

在37摄氏度、250 RPM振荡条件下培养细胞18小时。将过夜培养的菌液以96孔板形式加入甘油，于-80摄氏度保存。次日早晨，编程机器人将96孔板中的180微升半固体培养基（SPM）预热。

编程机器人以制备诱导剂板。在洁净的96孔板中，使用SPM（含95% BA和5% LB）准备孔。孔的数量应与所需的诱导剂浓度数量相对应。

将C4-HSL加入诱导剂板中将含有最高诱导剂浓度的孔中。接下来，编程机器人将每个最高浓度孔中的培养基依次稀释至23个较低浓度，浓度范围从零到218纳摩尔。每种诱导剂稀释液的体积应足以用于所有菌株。

为了稀释过夜培养的菌株，将机器人程序设置为10倍稀释，即在48孔板中将20 µL细菌与180 µL SPM混合。然后再次进行10倍稀释，取20 µL稀释后的溶液加入适合荧光测定的预置菌株板中。现在将机器人程序设置为根据最终浓度，将诱导剂板中的稀释诱导剂加入含有稀释菌株的96孔板中。

将96孔板在37摄氏度下振荡6小时。在此期间，每30分钟使用酶标仪测量一次在595纳米处的光密度（OD）以及mCherry和mCerulean的荧光。为进行归一化处理，同时测量未添加细胞的SPM的生长情况。

此处展示的是阳性菌株的三维图。这些图显示了原始光密度（OD）值、mCerulean 荧光和 mCherry 荧光随时间及诱导剂浓度变化的情况。针对阳性和阴性菌株，均计算了每个诱导剂浓度下的 mCerulean 稳态表达水平。

对于阳性和阴性菌株，还计算了每种诱导剂浓度下的 mCherry 产生速率。将 mCherry 产生速率绘制为两种菌株在两个生物学重复样本中平均 mCerulean 荧光强度的函数。对于表现出特异性结合反应的阳性菌株，显示了使用拟合公式对 KRBP 进行的拟合曲线。

对于阴性菌株，未获得KRBP值。基于两个RBP上位于不同位置的10个结合位点，针对30种不同菌株确定了标准化剂量反应曲线。观察到三种类型的反应：高亲和力、低亲和力和无亲和力。

此处展示的是两种 RNA 结合蛋白（RBP）——MS2 外壳蛋白和 PP7 外壳蛋白——与 10 种不同结合位点盒式序列的定量 KRBP 实验结果。此处还展示了 MS2 外壳蛋白在四个不同位置含有突变结合位点时的剂量反应曲线，以演示突变间距对 mCherry 蛋白表达的影响。所测试的突变结合位点序列已显示。

使用结构技术（例如形状探测）对蛋白质-RNA复合物的结构进行化学探针分析，并可视化受RNA结合影响的mRNA区域，这一点非常重要。最近，我们以高通量方式应用了该技术，同时测量了RNA结合蛋白（RBP）对10,000个结合位点的亲和力。