定量细菌中蛋白质-RNA结合的测定

由于RNA的复杂性质以及影响其与蛋白质相互作用的许多因素，体内蛋白质与RNA结合的特征仍然是一个重大挑战。RNA结合蛋白或RBP-RNA亲和力在活细菌细胞内测量。由于细胞环境同时影响RNA的结构以及由此产生的RBP-RNA结合，测量体内的亲和力对于理解自然系统中的这种相互作用至关重要。

成功的秘诀是质粒的设计。该设计应使用几波增量，避免插入停止编子和帧移位突变。通过设计绑定站点盒式磁带来开始此协议。

每个迷你基因包含一个EagI限制位点，40个碱基从五个基端的卡纳霉素抗性基因，pLac/Ara启动子，核糖体结合位点，AUG的mCherry基因，一个空间，一个RB结合位点，80个碱基从5个黄金端的mCherry基因，和一个阿帕利限制位点。为了提高测定的成功率，请为每个绑定站点设计三个绑定站点盒，并配有至少一个、两个和三个碱基的分空间。在执行消化的列纯化之前，使用EagI HF和PAPALI双消化迷你基因和目标载体。

将消化的迷你基因装订到结合位骨干，其中包含其余mCherry报告基因、终止剂和卡那霉素抗性基因。然后将结扎溶液转化为大肠杆菌前10个细胞。通过桑格测序识别阳性转化剂后，在零下20摄氏度的96井格式中储存纯化质粒。

还要将细菌菌株储存为甘油，在零下80摄氏度的96井格式中储存甘油。自定义顺序所需的 RBP 序列， 缺乏停止 codon 作为双链 DNA 迷你基因与限制位点在末端。将准备好的质粒转化为化学上称职的细菌细胞，这些细菌细胞已经含有RBP mCerulean质粒。

为了节省时间，在含有相关抗生素的Luria-Bertani agar的8个通道板上使用8通道移液器对细胞进行镀盘。殖民地应在16小时内出现在37摄氏度。为每个双转化剂选择一个菌落，并转移至48个含有1.5毫升LB的井板，并服用适当的抗生素。

在 37 摄氏度的温度下在 250 RPM 下生长 18 小时。将隔夜储存为零下80摄氏度的甘油库存，在96个井板中。早晨，程序机器人温暖180微升的半孔介质或SPM在96孔板。

编程机器人准备诱导板。在干净的 96 孔板中，使用 SPM 准备由 95%BA 和 5%LB 组成的油井。井数对应于所需的诱导剂浓度数。

将 C4-HSL 添加到诱导板中含有最高诱导剂浓度的孔中。接下来，对机器人进行编程，将每个最高浓度井中的介质连续稀释为 23 个浓度较低的介质，范围从零到 218 纳米摩尔。每种诱导剂稀释的体积应足以满足所有菌株。

为了稀释隔夜菌株，将20微升细菌与180微升SPM混合在48个孔板中，使机器人稀释10倍。然后再次稀释10倍，将稀释溶液中的20微升放入适合荧光测量的预制应变板中。现在，程序机器人添加稀释诱导剂从诱导板到96井板与稀释应变根据最终浓度。

在37摄氏度下摇动96个井板6小时。在此期间，每 30 分钟通过板读卡器测量 595 纳米的光密度或 OD 以及 mCherry 和 mCerulean 荧光。出于规范化目的，测量不添加单元格的 SPM 生长。

此处显示为正应变的三维图。这些图描绘了原始OD水平、mCerulean荧光和mCherry荧光作为时间和诱导剂浓度的函数。mCerulean稳定状态表达水平计算为正应变和负应变的每个诱导剂浓度。

还对正菌株和负菌株的每个诱导剂浓度计算了 mCherry 的生产成本。mCherry 的生产成本被绘制为平均 mCerulean 荧光平均超过两个菌株的两个生物重复的函数。对于表现出特定结合响应的正应变，将显示使用拟合公式的拟合 KRBP。

对于负应变，未提取 KRBP 值。根据两个 10 个结合点在不同位置确定 30 种不同菌株的规范化剂量响应曲线。观察到三种类型的响应，高亲和力，低亲和力，没有亲和力。

此处显示的两个 RBP 的定量 KRBP 结果，MS2 涂层蛋白和 PP7 涂层蛋白，以及 10 个不同的结合点盒。此处显示了 MS2 涂层蛋白的剂量响应曲线，该蛋白具有四个不同位置的突变结合位点，以演示突变间距对 mCherry 生产的影响。将显示测试的突变绑定站点的顺序。

使用结构技术（如形状寻求）对蛋白质-RNA复合物的结构进行化学探测，并可视化哪些mRNA区域受RNA结合影响，这一点很重要。最近，我们以高吞吐量的方式使用此技术，同时测量 10，000 个绑定站点的亲和力。