Name: 定量细菌中蛋白质-RNA结合的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学习在活细菌细胞中使用报告基因抑制法定量测定RNA结合蛋白与RNA的结合亲和力。该方法通过质粒设计和活细胞检测揭示蛋白质-RNA相互作用的动态机制。

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该项目获得了规划与预算委员会和以色列科学基金会I-CORE项目的资助（资助号：152/11）、玛丽·居里回归赠款（编号：PCIG11-GA-2012-321675），以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划在资助协议编号664918 - MRG-Grammar下的资助。

1. 系统准备
<ol>
	<li>结合位点质粒的设计
	<ol>
		<li>按照图1所示设计结合位点盒。每个微型基因包含以下部分（5'至3'）：Eagl限制性酶切位点、约40个碱基的卡那霉素（Kan）抗性基因5'端序列、pLac-Ara启动子、核糖体结合位点（RBS）、mCherry基因的AUG起始密码子、一段间隔序列（δ）、一个RBP结合位点、80个碱基的mCherry基因5'端序列，以及一个ApaLI限制性酶切位点。 
		注意：为提高实验成功率，针对每个结合位点设计三个结合位点盒，其间隔序列分别包含至少一个、两个和三个碱基。更多指导请参见代表性结果部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结合位点质粒的克隆
	<ol>
		<li>将结合位点盒作为双链DNA（dsDNA）微型基因进行合成订购。每个微型基因长约500 bp，在5'和3'末端分别含有Eagl和ApaLI限制性酶切位点（见步骤1.1.1）。 
		注意：本实验中，订购的微型基因包含一半的卡那霉素抗性基因，以便于阳性克隆的筛选。然而，Gibson组装17也适用于此情况，此时结合位点可作为两条较短的互补单链DNA寡核苷酸进行订购。</li>
		<li>根据限制性酶切方案18，使用Eagl-HF和ApaLI对微型基因和目标载体进行双酶切，并通过柱纯化19回收产物。</li>
		<li>将酶切后的微型基因与含有mCherry报告基因其余部分、终止子及卡那霉素抗性基因的结合位点骨架质粒进行连接20。</li>
		<li>将连接产物转化至Escherichia coli TOP10细胞中21。</li>
		<li>通过Sanger测序鉴定阳性转化子。
		<ol>
			<li>设计一条位于目标区域上游约100个碱基处的引物（引物序列见表1）。</li>
			<li>提取少量细菌菌落进行质粒小提22。</li>
			<li>准备5 µL浓度为5 mM的引物溶液和10 µL浓度为80 ng/µL的DNA溶液。</li>
			<li>将上述两种溶液送至合适的测序服务机构进行Sanger测序23。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将纯化的质粒以96孔板格式储存于-20 °C，菌株则以甘油保存液形式储存于-80 °C24。所得DNA将用于转化含有四种融合RBP质粒之一的E. coli TOP10细胞（见步骤1.3.5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RBP质粒的设计与构建 
	注意：本研究中所用衣壳蛋白的氨基酸和核苷酸序列列于表2。
	<ol>
		<li>将所需的RBP序列（不含终止密码子）作为定制合成的双链DNA微型基因进行订购，其两端带有适当的限制性酶切位点（图1）。</li>
		<li>将测试用的RBP序列（不含终止密码子）克隆至一个可诱导启动子的下游，并位于一个缺少起始密码子的荧光蛋白基因的上游（图1），操作步骤类似于1.2.2–1.2.4。确保RBP质粒携带与结合位点质粒不同的抗生素抗性基因。</li>
		<li>通过Sanger测序鉴定阳性转化子，方法同步骤1.2.5（引物序列见表1）。</li>
		<li>选取一个阳性转化子制备成化学感受态细胞25。将纯化的质粒以96孔板格式储存于-20 °C，菌株甘油保存液储存于-80 °C24。</li>
		<li>将步骤1.2.6中保存于96孔板中的结合位点质粒转化至已含有RBP-mCerulean质粒的化学感受态细菌细胞中21。为节省时间，无需将细胞涂布于培养皿上，而是使用8通道移液器将其接种至含有Luria-Bertani（LB）26琼脂及相应抗生素（Kan和Amp）的8道板上。菌落应在16小时内出现。</li>
		<li>为每个双转化子挑选单个菌落，在含相应抗生素（Kan和Amp）的LB培养基中过夜培养，并以甘油保存液形式在96孔板中于-80 °C保存24。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验设置
注意： 此处展示的实验方案使用了液体处理机器人系统，并结合培养箱和酶标仪进行操作。每次测量包含24种诱导剂浓度，每种菌株与诱导剂的组合均设置两个重复。利用该机器人系统，每天可完成16个菌株、每个菌株24种诱导剂浓度的数据采集。然而，若缺乏此类设备，或实验规模较小，则可使用八通道多道移液器手动操作，并相应调整实验方案。例如，初步实验即采用此手动方法，每天检测4个菌株，每个菌株设置12种诱导剂浓度，并在四个时间点进行测量。
<ol>
	<li>提前配制1 L生物测定缓冲液（BA）：将0.5 g胰蛋白胨、0.3 mL甘油、5.8 g NaCl、50 mL 1 M MgSO4、1 mL 10×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和950 mL双蒸水（DDW）混合。对BA缓冲液进行高压灭菌或无菌过滤。</li>
	<li>在48孔板中，于37 °C、250 rpm振荡条件下，在1.5 mL LB培养基中培养双转化菌株，加入适当抗生素（卡那霉素终浓度为25 μg/mL，氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL），培养18小时（过夜）。</li>
	<li>早晨进行以下准备工作。
	<ol>
		<li>诱导剂板。在洁净的96孔板中，于37 °C培养箱中准备含半贫培养基（SPM）的孔，SPM由95% BA和5% LB26组成。孔的数量应与所需诱导剂浓度数量一致。向诱导剂板中将含有最高诱导剂浓度（218 nM）的孔中加入C4-HSL。</li>
		<li>编程机器人将每个最高浓度孔中的培养基依次稀释至23个较低浓度，浓度范围为0至218 nM。每种诱导剂稀释液的体积应足以满足所有菌株（包括重复样本）的需要。</li>
		<li>在进行诱导剂稀释的同时，将96孔板中的180 μL SPM于37 °C培养箱中预热。</li>
		<li>将步骤2.2中过夜培养的菌液按100倍稀释：首先在48孔板中将100 μL菌液与900 μL SPM混合，进行10倍稀释；然后在适合荧光检测的96孔板中，取20 μL上述稀释液加入180 μL预热的SPM中，再次稀释10倍。</li>
		<li>根据最终浓度要求，将诱导剂板中的稀释诱导剂加入含有稀释菌液的96孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将96孔板在37 °C下振荡培养6小时，每隔30分钟使用酶标仪测定光密度（OD595）、mCherry（560 nm/612 nm）和mCerulean（460 nm/510 nm）的荧光值。为归一化目的，同时测定未接种细胞的SPM生长背景值。</li>
</ol>
3. 初步结果分析
<ol>
	<li>针对实验的每一天，根据测得的生长曲线，在线性生长期与稳定期之间选择一个对数生长期的时间区间（T0，Tfinal）。选取大约6−8个时间点，同时舍弃第一个和最后一个测量值，以避免因指数生长检测不准确而引入误差（见图2A，上图）。 
	注意：若菌株表现出异常的生长曲线，或无法检测到对数生长期，则应舍弃该菌株并重复实验。</li>
	<li>根据每种诱导剂浓度下mCerulean和mCherry荧光的原始数据，计算mCerulean的平均归一化荧光值以及mCherry的生成速率（图2A）。
	<ol>
		<li>按以下公式计算归一化的mCerulean： 
		<img alt="归一化mCerulean公式，光谱数据归一化过程示意图。" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq1.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="方程1"> 
		其中，blank(mCerulean) 表示仅含培养基时的mCerulean水平 [a.u.]，blank(OD) 表示仅含培养基时的光密度值，mCerulean 和 OD 分别表示mCerulean荧光值和光密度值。</li>
		<li>对不同时间点的mCerulean进行平均（图2B，上两个图），公式如下： 
		<img alt="平均mCerulean公式，ΣTfinalT0 归一化值/时间点数，生化数据分析。" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq2.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="方程2"> 
		其中，#Time points 表示所纳入的时间点数量，T0 表示指数生长期开始的时间，Tfinal 表示指数生长期结束的时间。</li>
		<li>按以下方式计算mCherry的生成速率（图2B，下两个图）： 
		<img alt="用于生物学研究分析的mCherry生成速率方程；蛋白质产量计算公式。" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq3.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="方程3"> 
		其中，mCherry(t) 表示时间 t 时的mCherry水平 [a.u.]，OD 表示光密度值，T0 表示指数生长期开始的时间，Tfinal 表示指数生长期结束的时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后，以mCerulean为横坐标，绘制mCherry生成速率的函数图，从而得到作为RBP-mCerulean融合蛋白荧光函数的剂量-响应曲线（图2C）。此类图示表示报告基因的生成速率随细胞内RBP存在量的变化关系。</li>
</ol>
4. 剂量反应函数拟合流程及KRBP提取
<ol>
	<li>假设核糖体在结合RBP后的翻译速率保持恒定，将mCherry的产生速率建模如下（参见 图 2D，绿色线条）： 
	<img alt="mCherry production rate equation; gene expression analysis; formula; Eq. 4 kanbound formula." src="/files/ftp_upload/59611/59611eq4.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 4"> 
	其中 [x] 是根据公式 2 计算得到的归一化平均 mCerulean 荧光值，mCherry 生成速率为根据公式 3 计算得到的数值，KRBP 是相对结合亲和力 [a.u.]，K未结合 是RBP未结合时核糖体的翻译速率，n是协同因子，C是基础荧光强度［a.u.］。C，n，K未结合的，以及 KRBP 通过将 mCherry 产生速率数据拟合到模型（公式 4）中得出。</li>
	<li>使用数据分析软件，对描述 mCherry 产生速率随平均 mCerulean 变化的关系图（步骤 3.3）进行拟合分析，并根据公式（方程 4）提取拟合参数。 
	注意： 仅包含 R 值的拟合结果2 &gt; 0.6 被纳入考虑。对于这些拟合，KRBP 误差主要在 K 的 0.5% 到 20% 范围内RBP 值，对应于0.67置信区间，而那些具有较高K的RBP 错误也可以通过肉眼进行验证。</li>
	<li>标准化 KRBP 将每个剂量-反应函数的平均mCerulean值除以其各自的最大值。 
	<img alt="Normalized rate constant equation for molecular analysis; Eq. 5 formula." src="/files/ftp_upload/59611/59611eq5.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Equation 5"> 
	其中 KRBP 在[a.u.]中为从公式4的拟合过程提取的值，max（平均mCerulean）为当前菌株观察到的最大平均mCerulean信号[a.u]。 
	注意： 归一化通过消除对特定RBP最大表达水平的依赖，从而促进在不同菌株间对调控效应进行正确比较。</li>
</ol>

<ol><li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li>
<li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li>
<li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141(2015).</li>
<li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology%3A+new+mechanisms%2C+applications+and+tools+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li>
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<li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li>
<li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li>
<li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li>
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<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486(2015).</li>
<li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12(2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li>
<li>Bernardi, A., Spahr, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法可实现对大肠杆菌（E. coli）细胞内RNA结合蛋白与RNA结合亲和力的定量体内测量。该实验方案相对简便，无需使用复杂仪器，且数据分析过程直接。此外，结果可立即获得，无需等待下一代测序（NGS）通常所需的较长时间。
该方法的一个局限性在于其仅适用于细菌细胞。然而，先前一项研究12已证明，在哺乳动物细胞中使用类似方法对L7AE RNA结合蛋白（RBP）同样可实现抑制效应。该方法的另一局限性在于，将结合位点插入mCherry起始区域可能会抑制mCherry的基础表达水平。结合位点的结构复杂性或高稳定性可能干扰核糖体的起始过程，即使在不存在RBP的情况下也会导致mCherry基础水平降低。若基础表达水平过低，则随着RBP浓度增加所带来的额外抑制效应将无法被观察到。在此情况下，建议设计结合位点盒时仍将结合位点置于起始区域，但靠近起始区域向延伸区域过渡的边界处（δ值在12−15 bp范围内10,29</sup...

基于RNA结合蛋白（RBP）的转录后调控，特别是RBP与RNA之间相互作用的表征，在近几十年来已被广泛研究。在细菌中，存在多个由RBP抑制或直接与核糖体结合竞争而导致翻译下调的例子1,2,3。在合成生物学领域，RBP-RNA相互作用正逐渐成为设计基于转录的遗传回路的重要工具4,5。因此，对这类RBP-RNA相互作用在细胞环境中的表征需求日益增加。
研究蛋白质-RNA 相互作用的最常用方法是电泳迁移率变动分析（EMSA）6，但该方法仅限于体外实验环境，以及多种下拉分析方法7，包括 CLIP 方法8,9。尽管这些方法能够用于发现新的 RNA 结合位点，但仍存在诸多缺点，例如实验流程繁琐、深度测序反应成本高昂，并且可能需要针对 RNA 结合蛋白（RBP）的特异性抗体才能进行下拉操作。由于 RNA 对其周围环境高度敏感，多种因素均可能影响 RBP-RNA 相互作用，因此在细胞环境中研究 RBP-RNA 结合显得尤为重要。例如，我们及其他研究团队已证明 RNA 在体内与体外的结构存在显著差异10,11。
基于先前研究的方法12我们最近证明10 当放置来自噬菌体GA的衣壳RBP的预先设计的结合位点时13，MS214，PP715和 Qβ16 在报告基因mRNA的翻译起始区，报告基因的表达受到强烈抑制。我们提出一种基于该抑制现象的相对简单且定量的方法，用于测量RNA结合蛋白（RBPs）与其相应RNA结合位点之间的亲和力。s 体内

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>SIGMA</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>ALFA AESAR</td><td>33337</td><td></td></tr><tr><td>48孔板</td><td>Axygen</td><td>P-5ML-48-C-S</td><td></td></tr><tr><td>8通道板</td><td>Axygen</td><td>RESMW8I</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>用于酶标仪的96孔板</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005029</td><td></td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>NEB</td><td>R0507</td><td></td></tr><tr><td>结合位点序列</td><td>Gen9 Inc. 和 Twist Bioscience</td><td></td><td>见表1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; TOP10细胞</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Eagl-HF</td><td>NEB</td><td>R3505</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>BIO LAB</td><td>071205</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>TECAN</td><td>liconic incubator</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>SIGMA</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>NEB</td><td>R0142</td><td></td></tr><tr><td>连接酶</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>液体处理机器人系统</td><td>TECAN</td><td>EVO 100, MCA 96通道</td><td></td></tr><tr><td>Matlab分析软件</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8通道多通道移液器</td><td>Axygen</td><td>BR703710</td><td></td></tr><tr><td>N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯（C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-HSL）</td><td>cayman</td><td>K40982552 019</td><td></td></tr><tr><td>PBS缓冲液</td><td>Biological Industries</td><td>020235A</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>TECAN</td><td>Infinite F200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Q5 HotStart聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0493</td><td></td></tr><tr><td>RBP序列</td><td>Addgene</td><td>27121 &amp; 40650</td><td>见表2</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>BIO LAB</td><td>190305</td><td></td></tr><tr><td>SV凝胶和PCR纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于定量细菌中蛋白质-rna 结合的检测方法

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

在蛋白质翻译的起始阶段，核糖体结合到mRNA的起始区域。当RNA结合蛋白（RBP）结合到mRNA的起始区域时，会阻碍核糖体的结合，从而阻断翻译起始。在本方法中，我们利用这种阻断现象来定量测定RBP与其特异性及非特异性结合位点之间的结合亲和力。为此，我们将一个待测结合位点插入报告基因mRNA的起始区域，并诱导待测RBP的表达。当RBP与RNA发生结合时，报告基因的表达随RBP浓度呈现S形抑制曲线；而当结合位点与RBP之间无亲和力或亲和力极低时，则未观察到显著的抑制效应。该方法在活的细菌细胞中进行，无需昂贵或复杂的仪器设备。它适用于定量和比较在细菌中具有功能的不同RBP对一组设计好的结合位点的结合亲和力。对于具有高度结构复杂性的结合位点，本方法可能不适用，因为在缺乏RBP的情况下，复杂的mRNA结构本身可能抑制核糖体的起始，导致基础报告基因表达水平降低，从而使得RBP结合后引起的报告基因抑制效应难以观测。

本方法利用RNA结合蛋白（RBP）与核糖体在mRNA分子上的结合竞争（图1）。随着诱导剂浓度增加，RBP-mCerulean的表达量上升，导致mCherry水平相应下降，反映出上述竞争关系。若mCerulean荧光增强，而mCherry无显著变化，则推断RBP未发生结合。图中展示了阳性菌株与阴性菌株的代表性实验结果（图2）。在图2A中，OD、mCherry和mCerulean信号随时间及诱导剂浓度的变化在4小时范围内呈现，其中T0 = 1 h，Tfinal = 3.5 h。在图2B中，展示了两个示例菌株的平均mCerulean荧光强度（上图）和mCherry生成速率（下图）随诱导剂浓度的变化。如图所示，阳性菌株的mCherry生成速率表现出明显的下调效应（<strong class="xfig...

本方法通过一种简单的活体报告基因检测法，在细菌细胞中定量分析RNA结合蛋白（RBPs）与其同源及非同源结合位点的结合亲和力。该检测基于报告基因的表达抑制作用。

一种用于定量细菌中蛋白质-RNA 结合的检测方法

在蛋白质翻译的起始阶段，核糖体结合到mRNA的起始区域。翻译起始可通过结合……来阻断

由于RNA结构的复杂性及其与蛋白质相互作用受多种因素影响，对体内蛋白质与RNA结合的表征仍是一个主要挑战。RNA结合蛋白（RBP）与RNA的亲和力在活的细菌细胞内进行测定。由于细胞环境会影响RNA的结构以及RBP与RNA的结合结果，因此在体内测量亲和力对于理解天然系统中此类相互作用至关重要。成功的关键在于质粒的设计。设计时应采用多轮 delta，并避免引入终止密码子和移码突变。本实验方案开始时需设计结合位点盒。每个微型基因包含一个EagI限制性酶切位点、位于卡那霉素抗性基因5'端上游40个碱基处的序列、pLac/Ara启动子、核糖体结合位点、mCherry基因的AUG起始密码子、一段间隔序列、RBP结合位点、mCherry基因5'端上游80个碱基的序列，以及一个ApaLI限制性酶切位点。为了提高实验的成功率，针对每个结合位点设计三个含有不同间隔序列的结合位点盒式结构，其间隔序列长度分别至少为1个、2个和3个碱基。在进行柱纯化之前，使用EagI HF和ApaLI对微型基因和目标载体进行双酶切消化。将消化后的迷你基因连接至含有mCherry报告基因其余部分、终止子以及卡那霉素抗性基因的载体骨架上。随后将连接产物转化至大肠杆菌Top 10感受态细胞中。通过Sanger测序鉴定阳性转化子后，将纯化的质粒以96孔板格式保存于-20摄氏度。同时将菌株以96孔板格式保存于含有甘油的储存液中，并置于负80摄氏度保存。定制合成所需的RBP序列，该序列不含终止密码子，作为两端带有限制性酶切位点的双链DNA微型基因。将已构建好的质粒转化至已含有RBP mCerulean质粒的化学感受态细菌细胞中。为节省时间，使用八通道移液器将细胞接种至含有相应抗生素的LB（Luria-Bertani）琼脂八通道培养板上。在37°C条件下培养16小时后应可见菌落。针对每个双转化子挑选单个菌落，并转移至含有1.5 mL LB培养基（含适当抗生素）的48孔板中。在37摄氏度、250 RPM振荡条件下培养细胞18小时。将过夜培养的菌液以96孔板形式加入甘油，于-80摄氏度保存。次日早晨，编程机器人将96孔板中的180微升半固体培养基（SPM）预热。编程机器人以制备诱导剂板。在洁净的96孔板中，使用SPM（含95% BA和5% LB）准备孔。孔的数量应与所需的诱导剂浓度数量相对应。将C4-HSL加入诱导剂板中将含有最高诱导剂浓度的孔中。接下来，编程机器人将每个最高浓度孔中的培养基依次稀释至23个较低浓度，浓度范围从零到218纳摩尔。每种诱导剂稀释液的体积应足以用于所有菌株。为了稀释过夜培养的菌株，将机器人程序设置为10倍稀释，即在48孔板中将20 µL细菌与180 µL SPM混合。然后再次进行10倍稀释，取20 µL稀释后的溶液加入适合荧光测定的预置菌株板中。现在将机器人程序设置为根据最终浓度，将诱导剂板中的稀释诱导剂加入含有稀释菌株的96孔板中。将96孔板在37摄氏度下振荡6小时。在此期间，每30分钟使用酶标仪测量一次在595纳米处的光密度（OD）以及mCherry和mCerulean的荧光。为进行归一化处理，同时测量未添加细胞的SPM的生长情况。此处展示的是阳性菌株的三维图。这些图显示了原始光密度（OD）值、mCerulean 荧光和 mCherry 荧光随时间及诱导剂浓度变化的情况。针对阳性和阴性菌株，均计算了每个诱导剂浓度下的 mCerulean 稳态表达水平。对于阳性和阴性菌株，还计算了每种诱导剂浓度下的 mCherry 产生速率。将 mCherry 产生速率绘制为两种菌株在两个生物学重复样本中平均 mCerulean 荧光强度的函数。对于表现出特异性结合反应的阳性菌株，显示了使用拟合公式对 KRBP 进行的拟合曲线。对于阴性菌株，未获得KRBP值。基于两个RBP上位于不同位置的10个结合位点，针对30种不同菌株确定了标准化剂量反应曲线。观察到三种类型的反应：高亲和力、低亲和力和无亲和力。此处展示的是两种 RNA 结合蛋白（RBP）——MS2 外壳蛋白和 PP7 外壳蛋白——与 10 种不同结合位点盒式序列的定量 KRBP 实验结果。此处还展示了 MS2 外壳蛋白在四个不同位置含有突变结合位点时的剂量反应曲线，以演示突变间距对 mCherry 蛋白表达的影响。所测试的突变结合位点序列已显示。使用结构技术（例如形状探测）对蛋白质-RNA复合物的结构进行化学探针分析，并可视化受RNA结合影响的mRNA区域，这一点非常重要。最近，我们以高通量方式应用了该技术，同时测量了RNA结合蛋白（RBP）对10,000个结合位点的亲和力。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

定量细菌中蛋白质-RNA结合的测定

本视频展示了配体检测的差分径向毛细管作用——一种用于系统性高通量筛选细胞内核苷酸第二信使结合蛋白的技术。该技术可实现第二信使直接与细胞裂解液中过表达的目标蛋白结合，从而无需进行蛋白质纯化。...

配体差异径向毛细管作用分析：一种高通量筛选细菌核苷酸第二信使结合蛋白的细胞内靶标蛋白技术

本视频演示了一种 体内 在细菌中进行的用于研究RNA结合蛋白（RBPs）与RNA相互作用的检测。将两种质粒构建体转化至细菌细胞中——一种为结合位点质粒，编码在RBP结合位点下游含有荧光报告基因的mRNA；另一种为RBP质粒，在诱导剂调控下表达RBP蛋白。当通过诱导剂增加RBP的表达时，RBP结合到mRNA上，导致报告基因的翻译受到抑制 通过...

研究目的基因翻译调控的报告基因抑制实验

本视频演示了一种 体外 RNA下拉实验用于鉴定与mRNA中腺苷酸-尿苷酸富集元件（ARE）序列相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）。将细胞裂解液中的目标RBPs与RNA探针混合，形成RNA-蛋白质复合物，随后分离这些复合物 通过...

RNA-蛋白质下拉实验通过亲和提取分离RNA结合蛋白

在本视频中，我们介绍了通过指数富集配体系统进化（SELEX）方法，筛选针对目标蛋白的特异性RNA结合序列。该方法将目标蛋白与大量随机序列的RNA文库共同孵育，分离出与蛋白结合的RNA序列，再通过PCR扩增和测序，以确定其与蛋白结合的位点。...

基于SELEX的体外结合实验鉴定RNA-蛋白质相互作用

本文描述了一系列比色分析方法，用于快速区分潜在异质性生物分子样品中的蛋白质、RNA、DNA和还原糖。...

快速比色法定性区分生物分子样品中的RNA与DNA

我们开发了一种基于ELISA的定量DNA结合检测方法，用于测量转录因子与DNA的相互作用。通过使用共识DNA识别寡核苷酸和特异性单克隆抗体，实现了对RUNX2蛋白的高特异性检测。采用酶偶联抗体底物反应进行比色检测，并实时监测信号变化。...

一种用于研究蛋白质与DNA相互作用、发现基因表达转录调控因子及鉴定新型抗肿瘤药物的定量检测方法

本文介绍了快速筛选和表征具有抗菌活性酶的实验方案。微载玻片扩散法和染料释放法利用目标细菌作为底物，分别对酶活性进行定性和定量评估。...

定性与定量检测及表征蛋白质类抗菌物质的实验方法

结合特定RNA序列的蛋白质在基因表达中发挥关键作用。对这些结合位点进行详细表征，对于我们理解基因调控机制至关重要。本文描述了一种针对RNA中蛋白质结合位点的单步饱和突变方法。该方法适用于RNA中所有蛋白质结合位点的研究。...

一种新型饱和突变方法：利用硫代磷酸酯一步法表征RNA中调控蛋白结合位点

利用ORFeome文库，差异径向毛细管配体结合分析法（DRaCALA）可用于鉴定生物体中的小分子配体结合蛋白。...

利用配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）鉴定小分子配体的结合蛋白

本文介绍一种利用一组相容性载体共表达不同标签蛋白的细菌共表达方法，随后结合常规的下拉技术，用于研究无法自行组装的蛋白复合物 体外.

细菌细胞中共表达偶联下拉实验作为高效检测困难蛋白质-蛋白质相互作用的工具

此处，我们介绍一种经过优化的 体外 利用人源细胞总蛋白提取物、包被生物素化RNA的链霉亲和素磁珠及质谱分析，鉴定、定量和验证特定RNA序列的蛋白互作分子的方法。...

一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

学习在活细菌细胞中使用报告基因抑制法定量测定RNA结合蛋白与RNA的结合亲和力。该方法通过质粒设计和活细胞检测揭示蛋白质-RNA相互作用的动态机制。

一种用于定量细菌中蛋白质-RNA 结合的检测方法

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