Name: 从诱导多能干得出视网膜色素上皮（RPE）（IPS），由胚体大小不同的细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 了解利用微孔技术生成均一胚体，诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法。该方案通过调控胚体大小优化分化效率，为视网膜退行性疾病治疗提供可靠的细胞来源。

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本文所包含的观点或主张均为作者的个人观点，不应被视为官方立场，也不代表美国陆军部或美国国防部的观点。本研究是在作者 Alberto Muñiz、Ramesh R Kaini、Whitney A Greene 和 Jae-Hyek Choi 担任美国陆军研究所（USAISR）国家研究委员会博士后研究协会成员期间完成的。本工作得到了美国陆军临床康复医学研究计划（CRMRP）和军事作战医学研究计划（MOMRP）的支持。

1. 培养试剂和培养板的准备
<ol>
	<li>通过将100 ml的5倍无血清添加剂加入400 ml干细胞基础培养基中，制备无饲养层干细胞培养基。该培养基在4 °C下可稳定保存最多2周，在-20 °C下可保存6个月。</li>
	<li>将10 µM的Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rock）抑制剂（Y-27362）溶液加入市售的拟胚体（EB）形成培养基中。</li>
	<li>通过向DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12）中添加0.1 mM β-巯基乙醇、0.1 mM非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺、10%敲除血清替代物（KSR）和10 µg/ml庆大霉素，制备分化培养基。</li>
	<li>通过向最低必需培养基Eagle（MEM）中添加1倍N1添加剂、0.1 mM非必需氨基酸、250 µg/ml牛磺酸、13 ng/ml三碘甲腺原氨酸钠盐、20 ng/ml氢化可的松、5 µg/ml庆大霉素和15%胎牛血清（FBS）21，制备iPS-RPE培养基。调节pH至7.4。</li>
	<li>制备三碘甲腺原氨酸钠盐储备液。将1 mg三碘甲腺原氨酸钠盐在1 N氢氧化钠中轻轻旋转溶解。加入49 ml MEM，配制成50 ml浓度为20 µg/ml的三碘甲腺原氨酸钠盐溶液。分装后于-20 °C冷冻保存，使用时根据需要取适当体积稀释至终浓度。</li>
	<li>制备氢化可的松储备液。将1 mg氢化可的松在1 ml 100%乙醇中轻轻振荡溶解。加入19 ml MEM，配制成20 ml浓度为50 µg/ml的氢化可的松储备液。分装后于-20 °C冷冻保存，使用时根据需要取适当体积稀释至终浓度。</li>
	<li>用DMEM/F12配制浓度为1 mg/ml的分散酶工作液。</li>
	<li>基质包被板的制备
	<ol>
		<li>将从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肉瘤细胞提取的蛋白基质用DMEM/F12稀释至0.08 mg/ml。每孔加入1 ml基质溶液包被6孔板。室温孵育1小时。</li>
		<li>孵育1小时后，吸除多余DMEM/F12液体，每孔加入0.5 ml无饲养层干细胞培养基以防止孔壁干燥。基质包被板即可使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用2 ml DMEM/F12冲洗每个微孔，制备微孔板。吸除DMEM/F12后，每孔加入0.5 ml含Rock抑制剂的EB形成培养基。以2,000 × g离心5分钟，以去除气泡。</li>
	<li>通过将2% FBS和0.09%叠氮化钠溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，制备FACS染色缓冲液。调节缓冲液pH至7.4。</li>
	<li>通过向DMEM/F12中加入10% FBS，制备胰酶中和溶液。</li>
</ol>
2. iPS 细胞培养
<ol>
	<li>在接种iPS细胞之前，将无饲养层干细胞培养基预热至37 °C，并准备好已包被基质的培养板。</li>
	<li>将IMR90-1 iPS细胞在37 °C水浴中快速解冻。随后从水浴中取出冻存管，用70%乙醇擦拭管壁。使用2 ml移液器将细胞转移至15 ml锥形离心管中，以尽量减少细胞团块的破碎。</li>
	<li>逐滴加入5 ml预热的无饲养层干细胞培养基，轻柔混匀。在室温下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用2 ml无饲养层干细胞培养基小心重悬细胞团块，并将细胞团块接种至已包被基质的培养板孔中。将培养板置于37 °C、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养。</li>
	<li>每日更换iPS细胞培养基。接种后5至7天观察未分化的细胞集落。在光学显微镜下检查中心致密、适合传代的未分化集落。</li>
</ol>
3. iPS 细胞的传代
<ol>
	<li>在开始传代iPS细胞之前，将dispase溶液、DMEM/F12和无饲养层干细胞培养基在水浴中预热至37 °C。</li>
	<li>传代iPS细胞前，通过刮除分化区域并吸除培养基来去除任何分化区域。用2 ml DMEM/F12小心冲洗iPS细胞。</li>
	<li>每孔加入1 ml浓度为1 mg/ml的dispase，于37 °C孵育7分钟。吸除dispase后，用2 ml DMEM/F12轻轻冲洗细胞集落两次。冲洗后，每孔加入2 ml无饲养层干细胞培养基。</li>
	<li>使用5 ml移液管轻轻刮取培养板上的细胞集落，形成细胞团块。将脱落的细胞团块转移至15 ml锥形管中。加入足量的无饲养层干细胞培养基，用于接种下一次传代的细胞。</li>
</ol>
4. 使用微孔板生成拟胚体
<ol>
	<li>诱导多能干细胞单细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>移除诱导多能干细胞的培养基，并用 2 ml DMEM/F12 洗涤细胞。在 6 孔板的每孔中加入 750 µl accutase。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育，使细胞从培养板表面脱落（约 5–10 分钟）。</li>
		<li>使用移液器轻轻吹打，使残留的细胞解离并脱离培养板表面。将细胞转移至 50 ml 锥形管中。用 5 ml DMEM/F12 洗涤培养板，并将洗涤液与细胞悬液合并至锥形管中。将细胞悬液通过 40 µm 细胞滤网，以去除可能存在的细胞团块。</li>
		<li>在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，去除 accutase。将细胞沉淀重悬于拟胚体形成培养基中，使细胞浓度约为 0.5–1.0 × 107 个细胞/ml。</li>
		<li>使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数，确定活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整微孔板中细胞密度以形成尺寸可控的拟胚体
	<ol>
		<li>根据所需拟胚体大小，调整每个微孔中的细胞数量。将细胞加入第 1.9 步准备好的微孔板中，通过轻柔反复吹打使细胞均匀分布。 
		注意：每孔所需细胞数 = 每个拟胚体所需细胞数 × 每孔微孔数量。</li>
		<li>向微孔中补充含 Rock 抑制剂的拟胚体形成培养基，调整终体积为 2.0 ml。通过轻柔吹打重新混匀各孔中的细胞。将微孔板以 100 × g 离心 3 分钟。将板置于 37 °C、5% CO2、95% 湿度的培养箱中培养 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从微孔板中收集拟胚体
	<ol>
		<li>使用 1 ml 移液器反复吹打微孔中的培养基，将大部分拟胚体吹下并收集。将拟胚体悬液通过倒置的 40 µm 细胞滤网，滤入 50 ml 锥形管中，以去除单个细胞。</li>
		<li>用 1 ml DMEM/F12 洗涤微孔板 5 次，以回收所有残留的拟胚体。收集每次洗涤液并经倒置的细胞滤网过滤。将细胞滤网翻转至新的 50 ml 锥形管上，用拟胚体形成培养基冲洗以收集滤网上的拟胚体。计数拟胚体以确定收获量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 胚状体铺板与分化诱导
<ol>
	<li>将拟胚体接种于包被有蛋白基质的六孔板中（同1.8.1步骤），密度为 &#60; 每孔1,000个EB，置于EB形成培养基中，并添加10 µM Rock抑制剂。将EB在37 °C、5% CO₂条件下培养2 和95%湿度下培养24小时。</li>
	<li>EB 接种后 24 小时，更换为分化培养基以启动分化。每隔一天更换一半分化培养基，直至细胞收集用于进一步分析。</li>
	<li>在第6、17、29和60天收集样本，进行RT-PCR、免疫细胞化学和FACS分析，以验证特征性RPE基因和蛋白的表达。</li>
</ol>
6. RNA 提取与 PCR
<ol>
	<li>根据市售试剂盒提供的说明，从EB样本中提取RNA。使用分光光度计测定RNA浓度。</li>
	<li>对100 ng总RNA，按照市售RNA反转录为cDNA试剂盒的说明进行反转录反应。</li>
	<li>使用以下引物（表1），取10 ng cDNA进行PCR扩增，引物终浓度为10 µmol / 10 ng cDNA。PCR程序设置如下：95 °C 变性5 min，随后进行35个循环（95 °C 15 sec，60 °C 30 sec，72 °C 1 min），最后在72 °C 延伸10 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。</li>
</ol>
7. 免疫细胞化学
<ol>
	<li>在室温下用 PBS 洗涤 EBs 两次。在室温下用 4% 多聚甲醛固定 EBs 10 分钟。在室温下用 PBS 冲洗一次。将样品保存在 4 °C 的 PBS 中，待染色时使用。</li>
	<li>染色当天，用固定和通透试剂处理固定后的细胞。在室温下用封闭液（含 10% 山羊血清的通透溶液）孵育样品 1 小时。</li>
	<li>在含 10% 山羊血清的通透溶液中进行免疫化学染色，使用以下一抗及其指定稀释比例：anti-Pax6 (1:10)、anti-RX (1:200)、anti-MITF (1:30) 和 anti-ZO1 (1:100)。在 4 °C 下与相应一抗孵育过夜。</li>
	<li>次日，从细胞中移除一抗，并用 PBS 冲洗样品三次。在室温下用荧光标记的二抗孵育样品 1 小时。</li>
	<li>从细胞中移除二抗，并用 PBS 冲洗样品三次。将盖玻片用含 DAPI 的封片剂封固于载玻片上，置于避光环境中过夜固化。使用荧光显微镜观察染色结果。</li>
</ol>
8. FACS 分析染色
<ol>
	<li>用 PBS 清洗培养的拟胚体两次。加入 0.5 ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育 5–10 分钟，以获得单细胞悬液。用胰蛋白酶中和液（1 ml/孔）中和胰蛋白酶。</li>
	<li>将单细胞悬液转移至 15 ml 圆底离心管中，在 600 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，在离心管中的细胞中加入 10 ml DMEM/F12 培养基。轻轻颠倒混匀细胞。在 600 × g 条件下离心。离心后弃去上清液，将细胞重悬于 FACS 染色缓冲液中。</li>
	<li>计数总细胞数。在 600 × g 条件下离心 10 分钟。离心后弃去上清液。立即加入 0.5 ml 4% 多聚甲醛固定细胞。轻轻涡旋充分混匀。将细胞在 4 °C 下孵育 20 分钟。</li>
	<li>在 600 × g 条件下离心 10 分钟，去除上清液。轻轻涡旋以打散细胞沉淀。加入 1 ml 冰冷的通透化溶液进行细胞通透化处理。轻轻涡旋混匀，并在冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 600 × g 条件下离心 10 分钟，去除上清液。加入 3 ml FACS 染色缓冲液并重悬细胞。重复此步骤一次。将细胞重悬于 FACS 染色缓冲液中，最终浓度为 5 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>将 100 μl 细胞悬液（含 0.5 × 106 个细胞）转移至各微量离心管中，并加入推荐体积的一抗。对于 Pax6 染色，在 100 μl 细胞悬液中加入 5 µl PE 标记的抗-Pax6 抗体。对于 MITF 染色，在 100 μl 细胞悬液中加入 5 µl 抗-MITF 抗体。</li>
	<li>混匀后在室温下孵育 60 分钟。加入 3 ml FACS 染色缓冲液。混匀后在 600 × g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并重复本步骤两次。</li>
	<li>对于 MITF 染色，将细胞与二抗（山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488）在 4 °C 下孵育 1 小时，稀释比例为 1:2,000。对于 Pax6 染色，跳过此步骤。</li>
	<li>用 5 ml FACS 染色缓冲液洗涤细胞，在 600 × g 条件下离心 10 分钟。重复该过程两次。</li>
	<li>将细胞重悬于 500 μl FACS 染色缓冲液中，轻轻涡旋以打散细胞沉淀。样品即可用于流式细胞术分析。</li>
</ol>
9. iPS-RPE 的分离与培养
<ol>
	<li>在第29天，使用200 µl移液器吸头小心地在培养板上围绕选定的色素化菌落进行切割。将漂浮的菌落转移至15 ml锥形管中。在室温下以600 × g离心10分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用10 ml DMEM/F12重悬细胞菌落，并以600 × g离心10分钟。弃去上清液。</li>
	<li>加入2 ml 0.25%胰蛋白酶，在37 °C孵育7–10分钟，使菌落解离成单细胞悬液。轻轻涡旋细胞悬液以充分分散菌落。</li>
	<li>加入2 ml iPS-RPE培养基以中和胰蛋白酶。以600 × g离心10分钟，并弃去上清液。将单细胞重悬于2 ml iPS-RPE培养基中，转移至包被有蛋白基质的6孔板中，置于37 °C、5% CO2和95%湿度的培养箱中培养。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了充分实现多能干细胞在细胞治疗中的潜力，必须以一致且可重复的方式调控其分化。本报告介绍了利用微孔板技术形成尺寸可控的拟胚体（EBs）、启动向视网膜色素上皮（RPE）分化的步骤，以及鉴定RPE蛋白和基因标志物的方法。为同步 体外 通过强制聚集法，在微孔板中将已知数量的iPS细胞离心，形成大小均一的拟胚体（EBs）。采用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测视网膜色素上皮（RPE）蛋白和基因的表达情况。最后，通过流式细胞术（FACS）分析不同大小EBs的分化效率。这些技术可促进iPS细胞向RPE的分化，为其未来的应用提供支持。
该方法中有几个关键步骤必须仔细执行，以确保本实验方案的成功以及获得准确的数据。第一个关键步骤出现在iPS细胞培养过程中。iPS细胞必须维持在多能状态，以保持其干性。为维持适当水平的bFGF，培养基必须每天更换，并且每天需仔细检查细胞是否出现分化迹象。未分化的iPS细胞以紧密的多细胞集落形式生长，细胞具有较高的核质比和明显的核仁。iPS细胞集落具有清晰的边界，中心区域由多层细胞构成。分化迹象包括集落边界模糊、细胞形态不均一，以及...

诱导性多能干细胞（iPS细胞）是一类通过外源因子重编程体细胞而获得的多能干细胞1相比之下，胚胎干细胞（ESCs）是另一种多能干细胞，来源于囊胚的内细胞团2-3尽管来源不同，诱导多能干细胞（iPS细胞）与胚胎干细胞（ESCs）在无限自我复制能力方面具有可比性 体外 以及它们分化为任何细胞类型的能力4-5这些iPS细胞的特性使其成为个性化再生医学应用的理想候选者。近期的研究工作集中于开发高效的分化方案，以生成包括视网膜色素上皮（RPE）在内的特化成体细胞6-11.
对于iPS细胞在临床应用中的潜力，针对特定细胞类型的定向分化至关重要。目前已发表多种将ESC和iPS细胞定向分化为视网膜色素上皮（RPE）的方法，这些方法在分化效率上存在显著差异6-7, 12-16我们对发育或分化过程中调控细胞/组织命运的许多分子事件仍不清楚。近年来，研究人员致力于开发尽可能模拟胚胎发育过程的分化方案。在囊胚阶段，未定向分化的干细胞群体共同存在于一个三维微环境中。因此，人们采用了多种策略促使胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPS细胞）聚集并以三维形式生长。这些干细胞聚集体被称为类胚体（embryoid bodies, EBs）。研究表明，干细胞的类胚体分化可模拟胚胎发育的早期阶段，并能自发在其外表面形成原始内胚层。随着类胚体进一步发育，三个胚层谱系的分化细胞表型相继出现。17-18因此，基于EBs的分化方案已受到广泛关注 体外 ESC/iPS细胞的分化，是利用多能干细胞生成视网膜色素上皮（RPE）的良好候选方法13.
可以通过多种方法利用胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPS细胞）制备拟胚体（EBs）。最初，拟胚体是通过刮取贴壁生长的细胞集落，并将其维持在非贴壁悬浮培养中来制备的。然而，这种方法产生的拟胚体群体具有异质性，导致可重复性较低。悬滴培养法和基于微孔的拟胚体制备技术是另外两种常用的拟胚体制备方法，能够产生大小均一、高度可重复的拟胚体。此外，微孔技术能够以较少的操作获得大量细胞聚集体。
EBs 中细胞的分化受到来自细胞外和细胞内微环境的多种形态发生信号的调控。与单层培养条件下的分化相比，EBs 为细胞的复杂组装以及细胞间信号传递提供了平台17。有趣的是，用于形成单个 EBs 的多能干细胞数量被发现会影响细胞的命运。例如，在一项关于人胚胎干细胞造血分化的研究中，观察到由 500 个细胞形成的 EB 更倾向于向髓系分化，而由 1,000 个细胞形成的 EB 则更倾向于向红系分化20。在另一项研究中，较小的 EBs 更有利于内胚层分化，而较大的 EBs 则促进神经外胚层分化11, 17。
既往研究强烈表明，用于形成单个胚胎小体（EB）的胚胎干细胞（ESC）/诱导多能干细胞（iPS细胞）数量会影响EB向各类细胞分化的程度。然而，据我们所知，目前尚无研究阐明EB大小对其向视网膜色素上皮细胞（RPE）分化倾向的影响。本研究旨在表征EB大小对诱导多能干细胞（iPS细胞）向视网膜色素上皮（iPS-RPE）分化的影响，并确定用于定向诱导RPE谱系分化的最佳EB形成细胞数量。

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 培养基 + 5x 补充剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632（ROCK 抑制剂）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 胎牛血清替代物</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 补充剂</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸钠&amp;nbsp;盐</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 培养板</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell 培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 固定/通透试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 PAX6 抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗 RX 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>小鼠&amp;nbsp;抗 MITF 抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 ZO-1 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>高容量 RNA 反转录 cDNA 试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

通过不同大小的拟胚体从诱导性多能干细胞（ips细胞）中分化视网膜色素上皮细胞（rpe）

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

多能干细胞具有无限增殖的能力，并可分化为几乎任何类型的细胞。此外，将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）的技术发展，激发了人们对定制化个体再生医学可能性的浓厚兴趣。然而，干细胞向特定谱系分化的效率仍然较低。本研究旨在描述一种通过组织工程方法从iPS细胞（iPS-RPE）分化获得视网膜色素上皮细胞（RPE）的实验方案，该方法通过生成均一的胚状体（EB）群体——一种常见的中间阶段——来实现 体外 分化。该方案采用微孔板技术生成特定大小的拟胚体（EBs）。文中还阐述了通过免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）鉴定视网膜色素上皮（RPE）蛋白及基因标志物的方法。最后，描述了通过荧光激活细胞分选（FACS）分析RPE标志物，监测不同大小EBs中分化效率的过程。这些技术将有助于推动iPS细胞向RPE的分化，用于未来应用。

在本实验中，将诱导性多能干细胞（iPS细胞）进行培养，并通过胚胎样体（EB）诱导其分化为视网膜色素上皮（RPE）谱系。利用微孔板技术形成尺寸可控的EB。如图1所示，微孔板中EB的形成具有良好的均一性。随后收集这些EB并接种于6孔板中（图2）。
RPE 可通过其典型的六边形形态、色素沉着以及 RPE 标志物的表达来鉴定。培养 12 周后，由 200 个细胞形成的 EB 出现了星形胶质细胞和成纤维细胞的形态，这些细胞中未观察到色素沉着（图 3A）。较大的 EB 则发育出具有典型 RPE 形态和色素沉着的单层细胞（图 3B 和 图 3C）。通过免疫细胞化学检测 RPE 标志物 MITF 和 ZO1，结果显示来源于 500 个细胞和 3,000 个细胞的 EB 均共表达这两种蛋白（图 4）。
通过PCR监测眼区和视网膜色素上皮（RPE...

本报告的目的是描述利用不同大小的拟胚体从诱导多能干细胞（iPS细胞）分化获得视网膜色素上皮（RPE）的实验方案。

通过不同大小的拟胚体从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中分化视网膜色素上皮细胞（RPE）

多能干细胞具有无限增殖的能力，并可分化为几乎任何类型的细胞。此外，……的开发

本实验的总体目标是表征胚胎体大小对诱导性多能干细胞（iPS细胞）分化为视网膜色素上皮（RPE）的影响，以指导胚胎体向RPE谱系的分化。该目标首先通过微孔技术生成大小均一、定义明确的胚胎体来实现；在第二步中，启动iPS细胞向视网膜谱系的定向分化，随后对iPS-RPE细胞进行鉴定与分离。在最后一步中，对 I-P-S-R-P-E 细胞进行富集和扩增。最终，可分析 I-P-S-R-P-E 细胞是否表达 I-P-S-R-P-E 特异性标志物。与自发分化等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够获得更高比例的视网膜前体细胞（RP）。这一发现有助于优化诱导性多能干细胞（IPS 细胞）向视网膜前体细胞谱系的定向分化过程。该技术的应用前景涉及黄斑变性、视网膜色素变性或斯塔加特病等视网膜退行性疾病的治疗。由于用源自诱导多能干细胞（IPS细胞）的健康视网膜色素上皮（RPE）替代病变的RPE可能是防止视力丧失的最佳策略，因此该方法具有重要意义。然而，通常初次接触该技术的研究人员会面临困难，因为干细胞极为脆弱，操作过程中的细微变化都可能影响其分化过程。本方法的可视化演示至关重要，其中从微孔板中收获类胚体的步骤尤为困难。接种前，将无饲养层干细胞培养基预热至 37 摄氏度，然后迅速将 IMR 90 dash one IPS 细胞在 37 摄氏度水浴中解冻。细胞解冻后，以滴加方式向细胞中加入 5 毫升预热的无饲养层干细胞培养基，并轻轻混匀。接着，离心细胞，然后在 2 毫升无饲养层干细胞培养基中轻柔重悬细胞团块。将细胞团块接种到基质包被的培养板的各个孔中，随后将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳和95%湿度的细胞培养孵育箱中，并每天更换培养基。5至7天后，在光学显微镜下观察具有致密中心且未分化的克隆集落，此时细胞已准备传代。当细胞准备就绪时，向每孔加入1毫克/毫升、37摄氏度预热的DispaSe酶溶液，将培养板在37摄氏度孵育7分钟。然后吸除DYS空间中的液体，并用2毫升预热的DMEM/F12培养基轻轻冲洗细胞克隆，重复两次。冲洗后，向每孔加入2毫升无饲养层干细胞培养基，使用5毫升移液器轻轻刮取克隆，使细胞团块脱落。然后将分离的细胞团块转移至15毫升锥形管中，并加入足量的无饲养层干细胞培养基，用于接种下一次传代的细胞以生成拟胚体。首先，用2毫升DMEM/F12培养基洗涤iPS细胞，然后向六孔板的每孔中加入750微升Accutase，作用5到10分钟。在细胞培养孵箱中，当细胞开始脱离时，使用移液器将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，随后转移至50毫升锥形管中。用 5 毫升 DM MF 12 冲洗培养板，将洗涤液与锥形管中的细胞合并。然后将细胞悬液通过 40 微米细胞筛，以去除任何残留的细胞团块。现在离心细胞以去除 Accutane 和 resus。将沉淀重悬于胚胎体形成培养基中，调整细胞浓度至每毫升0.5至1×10⁷个细胞。通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量后，向微孔板的每个孔中加入适量细胞，以生成所需大小的胚胎体。轻轻吹打培养物以促进细胞均匀分布，然后加入含有ROCK抑制剂的胚胎体形成培养基，调整体积至终体积2.0毫升。再次轻柔吹打后，离心微孔中的细胞培养物，并将培养板置于细胞培养箱中孵育24小时。次日，使用1毫升微量移液器将培养基在每个微孔中上下吹打，以收集大部分胚胎体，随后将胚胎体悬液通过倒置的40微米细胞筛网，去除任何单细胞。接着，用一毫升 DMMF 12 对微孔板冲洗五次，以去除残留的类胚体，并使洗涤液通过滤网。然后将细胞滤网倒置放入培养皿中，用更多的类胚体形成培养基过滤收集到的类胚体。计数收集的细胞后，将类胚体接种于包被有蛋白基质的六孔板中，在类胚体形成培养基中培养，每孔不超过 1000 个类胚体，并添加 10 微摩尔的 ROCK 抑制剂，在细胞培养箱中培养 24 小时。最后，将胚胎体形成培养基更换为分化培养基以启动分化过程。在培养第6、17、29和60天收集样品，进行相应的下游分析。经过12周的培养后，由200个细胞形成的胚胎体呈现出星形胶质细胞和成纤维细胞的形态，且无可见色素沉着；而较大的胚胎体则形成具有典型视网膜色素上皮（RPE）形态和色素沉着的单层细胞，如免疫荧光图像所示，通过检测RPE标志物MITF和ZO-1，可观察到这些蛋白在500个细胞和3000个细胞来源的胚胎体中共同表达。在此图中，通过流式细胞术在不同时间点检测了不同大小的胚胎体中神经外胚层标志物PAC six的表达水平。例如，在由3000个细胞形成的胚胎体中，培养第6天时约有50%的检测细胞PAC six呈阳性。此外，对不同大小胚胎体中视网膜色素上皮标志物MITF进行fax分析显示，分化第60天时约有20%的细胞表达MITF。培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞还具有在传代过程中失去其色素和多边形形态，并获得成纤维细胞表型的特性。例如，此处展示了新传代后已失去色素并呈现成纤维细胞形态的细胞。这些细胞随后增殖，在达到汇合时重新获得典型的多边形形态，并在数周内恢复其色素沉着。在进行该操作时，重要的是要记住在菌落形成后正确识别并分离IPS RP菌落。该技术为干细胞生物学领域的研究人员探索通过模拟正常胚胎发育过程实现向多种成体细胞类型的定向分化铺平了道路。切勿忘记，在组织中操作时，虚拟实验室可能具有极高危险性，进行这些操作时必须始终采取防护措施，例如穿戴防护服、手套和护目镜。观看本视频后，您应充分了解如何生成大小均一的拟胚体，以定向诱导其向视网膜色素上皮细胞（I-P-S-R-P-E）分化，并掌握分离与富集RPE细胞的方法。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从诱导多能干得出视网膜色素上皮（RPE）（IPS），由胚体大小不同的细胞

对人类诱导多能干细胞（iPS细胞）、由人类诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿视网膜色素上皮细胞（fetal...

人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。...

高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

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人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

本文介绍了一种从携带患者来源突变的人多能干细胞分化获得视网膜色素上皮（RPE）细胞的实验方案。这些突变细胞系可用于包括免疫印迹、免疫荧光和膜片钳在内的功能分析。这种“在培养皿中建模疾病”的方法克服了获取天然人源RPE细胞的困难。...

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本方案描述了一种优化的三维神经视网膜诱导系统，可减少视网膜类器官的黏附与融合，具有高重复性和高效率。...

由人多能干细胞生成神经视网膜

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