从诱导多能干得出视网膜色素上皮（RPE）（IPS），由胚体大小不同的细胞
February 4th, 2015
此报告的目的是描述协议来导出从诱导的多能干（iPS细胞）使用不同尺寸的胚状体的视网膜色素上皮细胞（RPE）。
该程序的总体目标是表征胚胎体大小对 RPE 从 IPS 细胞分化的影响，以将胚胎体分化引导到 RPE 谱系。这是通过首先使用微孔技术生成确定大小的均匀胚胎体来实现的。在第二步中，IPS 细胞的定向分化开始向视网膜谱系发展，然后鉴定和分离 I-P-S-R-P-E 细胞。
在最后一步中，I-P-S-R-P-E 细胞被富集和扩增。最终，可以分析 I-P-S-R-P-E 细胞的 I-P-S-R-P-E 特异性标志物的表达。与自发分化等现有方法相比，该技术的主要优点是我们的技术导致更高的 RP。这个问题可以帮助优化 IPS 细胞向 RP 谱系的定向分化。
该技术的意义延伸到视网膜退行性疾病的治疗，例如黄斑变性、虚构视网膜炎或 Stargardt 病。由于用来自 IPS 细胞的健康 RPE 替代患病的 RPE 可能是防止视力丧失的最佳选择，因此通常刚接触这种方法的个体会很困难，因为干细胞非常脆弱，其手柄的细微变化会影响分化过程。这种方法的视觉演示至关重要，因为从微波位置采集胚胎体的步骤很困难。
接种前，将无饲养层干细胞培养基加热至 37 摄氏度，然后在 37 摄氏度的水浴中快速加热 IMR 90 冲刺一个 IPS 细胞。当细胞解冻后，向细胞中加入 5 毫升温热的无饲养层干细胞培养物、培养基，逐滴并轻轻混合。接下来，旋转细胞，然后小心地将细胞团块重悬于 2 毫升无饲养层干细胞培养物中。
培养基将团块接种在基质包被板的各个孔中，然后将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 95% 湿度的细胞培养箱中，每日更换培养基。5 到 7 天后，观察具有致密中心的未分化菌落，这些菌落准备在光学显微镜下通过。细胞准备好后，向每个孔中每毫升添加 1 毫克 37 摄氏度的温空间，并在 37 摄氏度下孵育板 7 分钟。
然后吸出 DYS 空间，用 2 毫升预热的 DM MF 12 轻轻冲洗细胞集落。两次。冲洗后，向每个孔中加入 2 毫升无饲养层干细胞培养基，并使用 5 毫升移液器轻轻刮擦集落，释放细胞团块。
然后将分离的团块转移到 15 毫升锥形管中，并添加足够的无饲养层干细胞培养基，以接种下一次细胞传代以生成胚胎体。首先，用 2 mL DMMF 12 冲洗 IPS 细胞，然后向 6 孔板的每个孔中加入 750 μL Accutane，持续 5 至 10 分钟。在细胞培养箱中，当细胞开始分离时，使用移液器轻轻将细胞解离成单个细胞悬液，然后将它们转移到 50 mL 锥形管中。
用 5 ml DM MF 12 冲洗板，将洗涤液与锥形管中的细胞混合。然后将细胞悬液通过 40 微米的细胞过滤器，以去除任何残留的细胞团块。现在旋转细胞以去除 Accutane 和 resus。
将沉淀悬浮于胚胎体形成培养基中，浓度为每毫升细胞的 0.5 至 1 倍 10 至 7 个细胞。通过 trian blue 排除法确定活细胞的数量后，向微孔板的每个孔中加入适当数量的细胞以产生所需的胚胎。体型。
轻轻移液培养物以促进细胞均匀分布，然后将补充有岩石抑制剂的胚胎体形成培养基调节至最终体积为 2.0 毫升。更温和的移液后，离心微孔细胞培养物，并在细胞培养箱中孵育板 24 小时。第二天，用 1 毫升微量移液器将培养基上下移液到每个微孔中，以收获大部分胚胎体，然后将胚胎体悬液通过倒置的 40 微米细胞过滤器以去除任何单个细胞。
接下来，用 1 毫升 DMMF 12 冲洗微孔板 5 次，以去除其余的胚胎体，这些胚胎体通过过滤器进行洗涤。然后在培养皿中将细胞过滤器倒置，并用更多的胚胎体形成培养基过滤收集的胚胎体。计数收集的细胞后，将胚胎体在蛋白质基质包被的六孔板上以每孔少于 1000 个胚胎体在胚胎体形成培养基中孵育，并在细胞培养箱中补充 10 微摩尔岩石抑制剂 24 小时。
最后，用分化培养基替换胚胎体形成培养基以启动分化。在第 6 天、第 17 天、第 29 天和第 60 天收集样品以进行适当的下游分析。培养 12 周后，200 个细胞胚胎体形成星形胶质细胞和成纤维细胞形态，没有可见的色素沉着，而较大的胚胎体形成单层经典 RPE 形态和色素沉着，如这些图像所示免疫化学检测 RPE 标志物，MITF 和 ZO one 揭示了这些蛋白质的共表达来源于 500 个细胞和 3000 个细胞胚胎体。
在该图中，通过流式细胞术在不同时间点测量不同大小的胚胎体中的神经外胚层标志物 PAC six。例如，在 3000 个细胞胚胎体中，大约 50% 的分析细胞在培养第 6 天对 PAC 6 呈阳性。此外，对各种大小的胚胎体上的 RPE 标志物 MITF 的传真分析显示，20% 的细胞在分化第 60 天表达 MITF。
培养的 RPE 的另一个特征是它们能够失去其色素和多边形形态，并在包装时获得成纤维细胞表型。例如，这里显示了失去色素并获得成纤维细胞形态的新传代细胞。然后这些细胞增殖，在汇合时恢复其经典的多边形形态，并在几周内恢复其色素沉着。
在尝试此过程时，重要的是要记住在开发后正确识别和分离 IPS RP 集落。这项技术为干细胞生物学领域的研究人员铺平了道路，通过模拟正常的胚胎发育来探索向许多成体细胞类型的定向分化。不要忘记，在组织中工作、虚拟实验室可能非常危险，并且在执行这些程序时应始终注意影响，例如穿着腿套、手套和眼镜。
看完这个视频后，你应该对如何产生所需大小的同质胚胎体有一个很好的了解，以将森林砍伐引导到 I-P-S-R-P-E 并分离和丰富 RPE 细胞。
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概述
本报告描述了从诱导多能干细胞（iPS）细胞中衍生视网膜色素上皮（RPE）的协议，重点关注胚体大小的影响。该方法提高了RPE分化的效率，为干细胞在视网膜研究中的应用提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 视网膜研究
- 细胞分化
背景
- 视网膜色素上皮（RPE）对视网膜健康至关重要。
- 诱导多能干细胞（iPS）可以分化为各种细胞类型。
- 胚体是可以模仿早期胚胎发育的干细胞聚集体。
- 理解分化途径可以改进再生医学策略。
研究目的
- 调查胚体大小如何影响iPS细胞向RPE分化。
- 优化定向分化为RPE谱系的协议。
- 提高RPE细胞产量，以用于潜在的治疗应用。
所用方法
- 微孔技术用于生成均匀的胚体。
- iPS细胞向视网膜谱系的定向分化。
- iPS衍生RPE细胞的鉴定和分离。
- iPS衍生RPE细胞的富集和扩展以进行分析。
主要结果
- 胚体大小显著影响RPE分化效率。
- 优化的协议比自发分化产生更多RPE细胞。
- iPS衍生RPE细胞表达特定标记，表明其谱系。
- 该方法为研究RPE生物学提供了可靠的方法。
结论
- 该研究成功地展示了胚体大小对RPE分化的影响。
- 优化的分化协议可以增强视网膜疾病的再生策略。
- 未来的研究可能探索iPS衍生RPE细胞在治疗中的进一步应用。
