Name: 一种简单快速议定书非酶离解新鲜人组织的浸润淋巴细胞的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学习一种非酶解快速分离新鲜人组织浸润淋巴细胞的方法，通过机械解离和流式细胞术对CD45+细胞进行定性与定量分析。该技术可保留细胞天然状态，适用于肿瘤及正常组织研究。

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本研究得到了比利时科学研究中心（FNRS）基金、Bordet研究所之友基金会、FNRS- Télévie行动基金、比利时癌症计划、Lambeau-Marteaux基金、J.C. Heuson基金以及Barsy基金的资助。

注意：所有标本均根据布鲁塞尔朱勒·博尔代研究所医学伦理委员会批准的方案获取，并已获得每位患者的书面知情同意。
1. 组织匀浆的制备
<ol>
	<li>解剖来自手术室的切除组织（恶性组织及正常组织）由经过培训的人员在病理实验室进行即时取材。肿瘤组织、癌旁非肿瘤组织（NANT，尽可能取距肿瘤最远的区域）以及正常组织碎片通常在手术切除后1至3小时内，在BSL2级实验室中按照人源组织的标准生物安全操作规程进行处理。本方案的流程图如下所示： 图1.</li>
	<li>称重所有组织碎片（正常组织、NANT 和肿瘤组织），并测量其长度、宽度和高度（长度 × 宽度 × 高度）。此步骤对于后续细胞亚群及提取 RNA 的标准化至关重要。 等等。 
	注意：样本尺寸范围为100至10,000 mm3 尽可能不含脂肪。</li>
	<li>将肿瘤碎片印在玻璃载玻片上进行 H&amp;#38;E 染色以确认该组织确实属于肿瘤部分。
	<ol>
		<li>通过将一块玻璃载玻片压在肿瘤碎片上，并用手指轻轻按压数秒钟来完成此操作。</li>
		<li>用异丙醇固定载玻片 2 分钟，随后用水洗涤。用 Mayer 苏木精对组织复染 30 秒。</li>
		<li>将载玻片在六缸水中清洗。用2% 氯化双苯噁嗪（Phloxine B）染色15秒。</li>
		<li>用一浴水洗涤，随后用四浴异丙醇洗涤，最后再用一浴水洗涤。</li>
		<li>在异丙醇中孵育1分钟，然后沥干。在两缸二甲苯中透明。</li>
		<li>用二甲苯基封片剂封片。观察肿瘤细胞密度（图2). 
		注意：肿瘤细胞主要黏附于印迹载玻片上，间质细胞、淋巴样细胞或脂肪细胞很少残留，从而在肿瘤细胞之间留下空隙（图2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织碎片置于含有1 ml化学成分明确的无血清造血细胞培养基（以下简称培养基）的小型培养皿中，在室温下将其切成小块（约1–2 mm）2使用无菌手术刀。</li>
	<li>将所有物质（组织碎片 + 培养基）转移至机械解离器C管中。</li>
	<li>用巴斯德移液管将2 ml培养基冲洗培养皿和手术刀，然后加入C管中（解离用培养基总体积 = 3 ml）。</li>
	<li>使用机械解离仪程序 A.01（针对 C 管的最温和程序）将组织碎片匀浆成单细胞悬液。将 C 管放入仪器中，连续运行程序两次（一个循环 = 25 秒）。 
	注意：该匀浆程序已针对人乳腺组织建立并验证，其他肿瘤或组织类型可能需要使用不同的程序，应先进行测试。</li>
	<li>从装置上取下 C 管，将匀浆液直接倾入置于 50 ml 管上的 40 μm 细胞滤器中。使用与之前相同的巴斯德吸管继续操作 步骤 1.6将C管中残留的任何液体转移至细胞滤筛中。</li>
	<li>使用1 ml移液枪头将过滤后的液体转移至15 ml离心管中。暂时保留细胞滤器及其配套的50 ml离心管。</li>
	<li>用同一支巴斯德吸管，另取 3 ml 培养基冲洗 C 管，并将冲洗液转移至 步骤 1.6，将细胞滤器仍置于50 ml离心管上。用一支洁净的巴斯德吸管或1 ml吸头轻轻搅动滤器中的未均质组织，尽可能挤出残留液体至50 ml离心管中，随后丢弃该吸管或吸头，以避免污染流出液。</li>
	<li>将细胞滤网倒置在原始的C管上，用3 ml培养基冲洗，使未均质化的组织重新落入C管中。</li>
	<li>重新匀浆，步骤同前 步骤1.7 A.01 程序循环两次。</li>
	<li>将第二次制备的匀浆液通过置于50 ml离心管上的细胞筛过滤，再用3 ml培养基冲洗C管（同前） 步骤 1.10）并用巴斯德吸管将液体转移至置于50 ml离心管上的细胞筛中，再次挤压细胞筛中残留的结缔组织，尽可能挤出最大量的液体。</li>
	<li>此时，15 ml 管中体积约为 2.5 ml，50 ml 管中体积约为 9 ml。</li>
</ol>
2. 组织上清液与细胞的分离
<ol>
	<li>将15 ml和50 ml离心管中的匀浆在室温下以600 × g离心15分钟。</li>
	<li>将15 ml管中的上清液（SN）倒入洁净的离心管中，并暂时在4 °C下保存。此上清液（最终体积为2.5 ml）为原发性肿瘤、NANT或正常组织的上清液，后续需进一步澄清并分装，然后在-80 °C下储存以备将来分析（见下文）。</li>
	<li>弃去50 ml管中的上清液。</li>
	<li>用最终体积为1 ml的培养基轻柔重悬两个细胞沉淀。简而言之，首先通过轻敲离心管（在硬质表面上）轻柔地打散两个管中的细胞沉淀。用500 µl培养基重悬50 ml管中的细胞沉淀，并将此细胞悬液转移至15 ml管中以重悬第二个沉淀。再用另500 µl培养基重复此步骤一次，以最大程度回收细胞。</li>
	<li>取10 µl细胞悬液转移至小离心管中，加入10 µl台盼蓝（1:1稀释），用血细胞计数板计数活细胞数量。 
	注意：在此阶段，也可取部分细胞悬液进行流式细胞术分析，以评估细胞大小、颗粒度，以及根据需要检测少量亚群标记物，从而在进行深入分析或实验前更精确地评估匀浆中细胞的相对分布情况。所有流式细胞术分析均包含CD45标记，用于亚群归一化。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。来自肿瘤、NANT或正常组织的细胞现可进行进一步纯化或分析。这些额外步骤最好在手术当天完成。 
	注意：对于流式细胞术分析（但不包括细胞分选），在抗体标记后应裂解残留的红细胞，方法是向细胞沉淀中加入0.4 ml红细胞裂解缓冲液，立即涡旋震荡1秒，并在室温下避光孵育至少10分钟，然后进行分析。</li>
</ol>
3. 组织上清液的澄清
<ol>
	<li>将含有组织上清液（SN）的1.5 ml离心管在4 °C条件下以15,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>小心移除上清液，避免接触或扰动沉淀。根据所需分装的数量和体积，转移至干净的离心管（或多个离心管）中。</li>
	<li>将上清液于-80 °C保存，以备后续使用。</li>
</ol>
4. 患者血液
<ol>
	<li>在手术前一天，通过静脉穿刺采集每位患者的血液样本作为对照，收集至含肝素的试管中。在20 °C下以400 × g离心10分钟（关闭刹车），以获得血浆和白细胞层（buffy coat）。</li>
	<li>移除血浆后，在20 °C下以10,000 × g离心15分钟以澄清血浆。分装后于-80 °C保存，以备后续使用。用培养基稀释白细胞层（buffy coat）。</li>
	<li>采用标准的Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离单个核细胞，随后立即进行分析、亚群分离、DNA/RNA/蛋白质提取或冷冻保存。</li>
</ol>
5. 流式细胞术
<ol>
	<li>根据制造商说明书，在 4 °C 避光条件下对细胞进行标记。在抗体标记后，向组织碎片细胞悬液的细胞沉淀中加入 0.4 ml 细胞裂解缓冲液，以裂解红细胞。</li>
	<li>立即涡旋震荡 1 秒，并在室温下避光孵育至少 10 分钟。将标记后的细胞直接上机流式细胞仪进行数据采集，无需洗涤。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%27elite+hacker%27%3A+breast+tumors+exploit+the+normal+microenvironment+program+to+instruct+their+progression+and+biological+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity.</a> Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Quezada, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+tumor+infiltration+by+activated+T+effector+cells+restricts+the+therapeutic+activity+of+regulatory+T+cell+depletion+against+established+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma.</a> J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>McCauley, H. A., Guasch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+orthotopic+transplantation+of+epithelial+tumors+in+single-cell+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension.</a> Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+cells+obtained+from+the+blood+but+not+from+the+tumor+can+suppress+T-cell+proliferation+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma.</a> Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).</li>
<li>Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+B+cell+characterization+in+blood%2C+lymph+nodes%2C+and+tumors+from+patients+with+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies.</a> J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li>
<li>Buisseret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+Infiltrating+Breast+Cancer+%3A+Density%2C+Composition+And+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Garaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+B+Cells+Infiltrating+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cxcl13-Producing+Follicular+Helper+T+Cells+In+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Yee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+endogenous+T+cells+for+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of endogenous T cells for adoptive transfer.</a> Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).</li>
<li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+human+CD8%2B+T+cells+using+autologous+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help.</a> PLoS One. 7 (1), 30229(2012).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+artificial+antigen+presenting+cells+facilitate+direct+and+efficient+expansion+of+tumor+infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes.</a> J Transl Med. 9, 131(2011).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本研究描述了一种优化方法，可快速制备正常及恶性乳腺组织匀浆，无需酶消化步骤，适用于后续的细胞分选、提取、冷冻保存和/或CD45的表型分析+ 亚群。该实验方法的目标是获得能够真实反映肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）的图像 体内 状态，并与来自手术室且经过最少处理的正常组织进行比较。迄今为止，本实验室已采用该方案分析 &#62;250 例新鲜乳腺癌组织（肿瘤组织和癌旁正常组织）， &#62;35 例来自乳房缩小术的正常乳腺组织。原则上，本方案应可直接适用于其他肿瘤或组织类型；然而，可能需要进行一些优化（即， 机械解离程序、循环次数、培养基体积 等等。）。对于淋巴细胞浸润较少的组织，可能需要使用较大的组织片段，这正是我们在淋巴细胞数量较低的正常组织中所采用的方法。或者，可增加密度梯度离心步骤以富集白细胞悬液。本项针对乳腺肿瘤中浸润的T细胞和B细胞亚群的分析包括对 &#62;通过流式细胞术检测100种标志物（Gu-Trantien补充数据中提供了74种标志物的流式细胞术数据） 等.9以及特定淋巴细胞亚群的纯化，用于后续的免疫学和分子分...

肿瘤微环境由多种细胞类型组成，大量研究表明，这些细胞在肿瘤发生过程中各自发挥着独特而重要的作用1,2。其中包括但不限于浸润性免疫细胞、间质细胞、内皮细胞和肿瘤细胞3。由于浸润性淋巴细胞（TIL；CD45+ 细胞或白细胞，在乳腺肿瘤中主要为淋巴细胞）在新鲜人体组织样本中的频率较低、可用于研究的样本量通常较小，以及提取过程中细胞活力可能丧失，使得对这些细胞进行离体（ex vivo）研究较为困难。由于浸润肿瘤的免疫细胞通常以“过客”形式存在，而非组织中的常驻细胞，因此它们通常更容易从组织基质中释放出来。
在维持细胞完整性的前提下解离肿瘤组织在技术上具有挑战性，传统方法通常结合机械处理与酶解步骤来制备单细胞悬液4-8。该方法需要长时间孵育，常导致细胞活力显著下降，并因酶切作用造成细胞表面受体丢失。使用经酶消化的肿瘤组织更难实现高质量的流式细胞术分析，以表征肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），也难以通过流式细胞术或抗体包被的磁珠对CD45+亚群进行高效纯化。此外，由于酶解过程中可能存在蛋白质降解，所得肿瘤匀浆的上清液（SN）无法用于进一步分析，例如分泌蛋白（细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白或肿瘤抗原）的定量检测，或对正常细胞进行实验性处理。
在寻找一种无需酶消化即可制备乳腺组织（包括肿瘤组织、非邻近非肿瘤组织（NANT）以及来自乳房缩小术的正常乳腺组织）单细胞匀浆的方法过程中，我们测试了多种机械匀浆技术。使用机械解离仪制备的匀浆显示出更高的细胞活力（提高2倍）和总细胞回收率（提高2倍），同时保留了表面受体的表达。对剩余不溶性物质进行酶消化并未回收到更多的CD45+细胞，表明这些细胞已在初始匀浆过程中全部释放。因此，这种快速而简单的方法可实现对存在于各种正常及恶性人类组织中的CD45+亚群进行定性和定量评估。该方法的另一优势在于，初始匀浆所得的上清液（原始组织上清液）可被收集并保存，用于后续分析或实验。

<table><tbody><tr><td>GentleMacs 组织解离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine 在某种程度上是等效的</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>或其他标准台式离心机</td></tr><tr><td>Centrifuge 5417 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>或其他标准微量离心机</td></tr><tr><td>Esco 二类 A2 型生物安全柜</td><td>ESCO 全球</td><td></td><td>或其他标准的BSL2生物安全柜</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>或适用于血细胞计数板的其他显微镜</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker 室</td><td>Marienfield&amp;nbsp;</td><td>640210</td><td>或其他标准血细胞计数板</td></tr><tr><td>Navios 流式细胞仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td>或其它流式细胞仪（推荐 8-10 色）</td></tr><tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine 使用 Filcon</td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>72,710</td><td>或其他非致热原性塑料器皿</td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>或标准一次性无菌手术刀</td></tr><tr><td>BD 细胞滤网 40 &amp;micro;m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>或其他非致热原性塑料器皿</td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml 离心管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>或其他非致热性塑料器皿</td></tr><tr><td>BD Falcon 15 ml 离心管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>或其他非热原性塑料器皿</td></tr><tr><td>BD FACS 管 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>或其他非致热性塑料器皿</td></tr><tr><td>无菌巴斯德吸管 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>或其他无热原塑料制品</td></tr><tr><td>1.5 ml 微型离心管</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>或其他无热原塑料制品</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>推荐的无血清培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>标准生理磷酸盐缓冲液（PBS）</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>或其他活体染料</td></tr><tr><td>VersaLyse</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A09777</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>可固定的活率染料 eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>抗CD3 FITC</td><td>BD 生物科学</td><td>345763</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>抗CD3 Vio蓝</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-363</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>抗CD4 PE</td><td>BD生物科学</td><td>345769</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>抗CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>抗CD8 ECD</td><td>贝克曼库尔特</td><td>737659</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>抗-CD8 PerCP</td><td>BD 生物科学</td><td>345774</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>抗CD19 APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-643</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr><tr><td>抗CD45 VioGreen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-906</td><td>用于流式细胞术实验</td></tr></tbody></table>

一种简单快速的非酶法解离新鲜人体组织以分析浸润性淋巴细胞的方案

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

恶性细胞逃避免疫系统的能力，即肿瘤逃逸先天性和适应性免疫应答的现象，现已被公认为癌症的重要特征之一。我们对乳腺癌的研究聚焦于肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤进展和患者预后中的主动作用。为实现这一目标，我们建立了一种快速分离正常与异常组织中完整淋巴样细胞的方法，以评估其接近天然状态下的特性。使用机械解离器制备的组织匀浆相比酶消化组织，细胞活力和回收率均更高，同时保留了表面受体的表达。此外，对剩余不溶性物质进行酶消化并未回收到额外的CD45+细胞。+ 细胞，表明在原代匀浆液中进行的定性和定量检测很可能真实反映了组织碎片中浸润的亚群。这些匀浆液中的淋巴细胞可通过免疫学方法（表型、增殖）轻松表征。 等等。）或分子（DNA、RNA 和/或蛋白质）方法。CD45+ 细胞也可用于亚群纯化， 体外 扩增或冷冻保存。该方法的另一优势在于，组织匀浆后的上清液可用于表征和比较正常及恶性组织中存在的细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白和抗原。本方案在人乳腺组织中效果极佳，且应适用于多种正常与异常组织。

使用市售的组织解离溶液或含有胶原酶、DNase 和/或透明质酸酶抑制剂的各种实验室混合物对组织碎片进行酶消化时，会切割细胞表面多种受体。我们最初的研究集中于浸润乳腺肿瘤的 CD4+ T 细胞，但很快遇到了一个重大的技术问题：采用标准的酶消化方案会导致细胞表面 CD4 受体被切割4-8。我们测试了多种含有或不含 DNase 和透明质酸酶抑制剂的胶原酶，发现胶原酶 I 和 II 会完全去除细胞表面的 CD4，尽管此时淋巴细胞的存活率很高（图 3A）。在较短的孵育时间（1–2 小时）下使用胶原酶 IV 时，对 CD4 的影响较为温和，与同一位患者未消化的血液和骨髓相比，消化后的淋巴结和肿瘤组织中检测到的 CD4 抗体标记水平较低（图 3B；需注意，由于我们所获得组织样本的限制，无法直接比较同一组织来源的消化与未消化的淋巴结和肿瘤组织）。通过比较来自健康供体血液中未经消化和经消化处理的 CD4+ T 细胞，证实 CD4 的丢失是胶原酶 IV 消化过程的技术副产物（数据未显示）。尽管可通过磁珠从经胶原酶 IV 消化...

本方案描述了对新鲜人体组织碎片进行快速非酶解离的方法，用于定性和定量评估存在于多种正常及恶性人体组织中的CD45+细胞（淋巴细胞/白细胞）。此外，可收集并保存来源于原代组织匀浆的上清液，用于后续分析或实验。

恶性细胞逃避免疫系统的能力，其特征是肿瘤逃逸先天性和适应性免疫应答，现已被广泛认可……

本实验的总体目标是通过机械方法快速将人体组织碎片匀浆化为单细胞悬液，无需酶消化，以便进行定性和定量分析以及特定淋巴细胞亚群的分离。该过程首先使用无菌手术刀将组织碎片切割成小块，随后将组织匀浆转移至机械解离管中，在该管中进一步将组织碎片彻底匀浆化为单细胞悬液。然后通过离心收集细胞，用于后续分析。最终，可采用流式细胞术分析浸润性淋巴细胞及其亚群，包括亚洲人群。我们实验室开发该技术是因为我们希望找到一种方法，能够在不显著影响肿瘤浸润淋巴细胞天然状态的情况下对其进行成像。我们希望有一种方法能够快速分离细胞，并在手术过程中即时分析其状态。该技术已在我们实验室用于300多个乳腺肿瘤及正常组织样本，操作简便，可日常使用。该技术可用于检测预后标志物、治疗反应以及长期临床转归。今天由我实验室的技术员 John Nicola Loic 演示该技术。首先称量组织样本，然后测量组织的长度、宽度和高度。接着将组织碎片转移至含有 1 mL 适当化学成分明确的无血清造血细胞培养基的小培养皿中，使用无菌手术刀将样本切成 1 至 2 平方毫米的小块。接下来，将培养皿中的内容物转移至机械解离C管中，并用2毫升培养基冲洗培养皿和手术刀。将洗涤液加入C管中，随后连续运行0.01机械解离程序两次，以轻柔地将组织碎片均质化为单细胞悬液。第二次运行结束后，将匀浆液通过40 µm细胞滤网转移至50 mL锥形管中。然后使用同一支移液枪头，从冲洗培养皿后吸取C管中剩余的液体，并将其转移至细胞滤筛中。接着，使用一支1毫升的微量移液器将滤过的液体转移至15毫升锥形管中，并用额外的3毫升培养基冲洗C管。将此冲洗液通过细胞滤筛转移至50毫升离心管中。然后使用干净的1毫升枪头轻轻搅动过滤器上的未均质化组织，将组织中残留的尽可能多的液体挤入50毫升离心管中。接着，将细胞过滤器倒置在原始的C管上方，用3毫升培养基冲洗过滤器，使未均质化的组织重新落入C管中。按照上述方法再次进行两个均质化循环，然后将第二次的均浆液通过细胞过滤器过滤。再次用三毫升培养基冲洗C管。然后将上清液通过滤网过滤，并像之前演示的那样将残余液体从组织中挤出。此时，15毫升离心管中应含有约2.5毫升的单细胞悬液，50毫升离心管中应观察到约九毫升液体。为将组织上清液与细胞分离，首先将两管匀浆液在室温下以600 ×g离心15分钟，然后将15毫升管中的上清液倾入1.5毫升管中，并置于4摄氏度保存，弃去50毫升管中的上清液。随后轻轻敲击每管底部于硬质表面，以充分分散细胞沉淀。用500 µL培养基重悬50毫升管中的松散细胞沉淀，并将细胞转移至15毫升管中以重悬第二个细胞沉淀。然后用另外500微升培养基冲洗50毫升离心管，并将洗涤液转移至15毫升离心管中，以最大程度回收细胞。通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量后，离心收集细胞悬液。最后，离心保留的组织上清液。然后小心地将上清液转移至至少一个干净的离心管中，注意不要接触或扰动沉淀物，并将其在-80°C下保存，用于后续分析。在这些图中，展示了分离的肿瘤细胞匀浆液经特异性抗体标记白细胞和上皮细胞标志物后的代表性流式细胞术点图。该方案不会显著影响CD45阳性细胞的活力。然而，EPAM阳性细胞的存活率有显著下降。尽管如此，仍可根据细胞大小和结构特征，将存活的EPAM阳性细胞和CD45阳性亚群区分为大上皮样肿瘤细胞、小上皮细胞，以及大或小的CD45阳性细胞。此处展示了主要肿瘤浸润亚群的代表性流式细胞术散点图，其中淋巴细胞门控基于CD45阳性细胞的存活率进行设定。最后，可以将乳腺癌上清液中的细胞因子表达或总免疫球蛋白水平与正常乳腺组织的上清液进行比较，如本代表性实验所示，肿瘤组织相关的这两类蛋白质均有所增加。尽管该操作流程较为繁琐，但重要的是要牢记操作过程中需迅速、洁净，并在每一步骤中尽可能回收最多量的材料，以获得足够数量的细胞用于最终的分析。

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免疫学与感染

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离体跨膜迁移系统中淋巴细胞迁移能力的评估

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子宫固有淋巴细胞的分离及其流式细胞术分析

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一种简单快速的非酶法解离新鲜人体组织以分析浸润性淋巴细胞的方案

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