一种简单快速议定书非酶离解新鲜人组织的浸润淋巴细胞的分析
2014年12月6日
该方案描述了新鲜人体组织片段的快速非酶解离，用于定性和定量评估存在于各种正常和恶性人体组织中的 CD45 + 细胞（淋巴细胞/白细胞）。此外，可以收集和储存从原代组织匀浆中获得的上清液，以用于进一步分析或实验。
该程序的总体目标是将人体组织片段快速匀浆成单细胞悬液，无需酶消化，用于定性和定量分析以及特异性淋巴细胞亚群的分离。这是通过首先使用无菌手术刀将组织碎片切成小块来实现的。接下来，将组织浆液转移到机械解离管中，在那里，片段进一步匀浆成单细胞悬液。
然后通过离心收集细胞用于下游分析。最终，流式细胞术可用于分析浸润淋巴细胞，即亚洲亚群。我的实验室开发了这项技术，因为我们正在寻找一种方法，可以在不显著影响其天然状态的情况下对肿瘤浸润淋巴细胞进行成像。
我们想要一种可以快速分离细胞并像手术时一样分析它们的方法。该技术已用于我们实验室的 300 多种乳腺肿瘤和正常组织，易于使用，可以每天使用。它可用于检查预后标志物、对治疗的反应和长期临床结果。
今天演示这项技术的将是 John Nicola Loic。我实验室的一名技术人员首先称量组织样本，然后测量组织的长度、宽度和高度。然后将组织碎片转移到一个小培养皿中，该培养皿中含有 1 毫升适当的、化学成分明确的无血清造血细胞培养基，并使用无菌手术刀将样品切成 1 至 2 平方毫米的小块。
接下来，将培养皿内容物转移到机械解离 C 管中，并用 2 毫升培养基冲洗培养皿和手术刀。将洗涤液加入 C 管中，然后连续运行 a 0.01 机械解离程序两次，以轻轻地将组织片段匀浆成单细胞悬液。第二个循环后，通过 40 微米的细胞过滤器将匀浆倒入 50 毫升锥形管中。
然后使用移液器清洗培养皿时产生的相同害虫将 C 管中残留的任何液体转移到细胞过滤器中。接下来，使用 1 毫升微量移液器将过滤后的液体转移到 15 毫升锥形管中，然后用另外 3 毫升培养基冲洗 C 管。通过细胞过滤器将洗涤液转移到 50 mL 试管中。
然后用干净的 1 毫升尖端轻轻地将未匀浆的组织围绕过滤器移动，以将组织中捕获的最大残留液体挤入 50 毫升试管中。现在，将细胞过滤器倒置在原始 C 管的顶部，再用 3 毫升培养基冲洗过滤器，使未均质的组织落回 C 管中。如前所述，将组织再匀浆两个循环，然后将第二种匀浆倒入细胞过滤器中。
再次用另外 3 毫升培养基冲洗 C 管。然后通过过滤器过滤上清液，并像刚才所示将残留液体从组织中挤出。此时，15 毫升试管中应存在约 2.5 毫升体积的单细胞悬液，在 50 毫升试管中应观察到约 9 毫升的单细胞悬液。
为了将组织上清液与细胞分离，首先离心，将两管匀浆在 600 Gs 和室温下倒出 15 分钟，将上清液从 15 mL试管倒入 1.5 mL试管中，置于 4°C 下，弃去 50 mL试管中的上清液。然后在坚硬的表面上轻轻敲击每根试管，以打碎每个细胞沉淀。用 500 μL 培养基将松散的细胞沉淀重悬于 50 mL 试管中，并将细胞转移到 15 mL 试管中以重悬第二个沉淀。
然后用另外 500 μL 培养基冲洗 50 mL 试管，并将洗液转移到 15 mL 试管中，以实现最大的细胞回收率。通过 trian blue exclusion 计数活细胞的数量后，沉淀细胞悬液。最后，旋转保留的组织上清液。
然后小心地将上清液转移到至少一个干净的试管中，不要接触或干扰沉淀，并将其储存在零下 80 摄氏度以备将来的下游分析。在这些图表中，解离的肿瘤细胞匀浆的代表性流式细胞术点图，然后用针对白细胞和上皮细胞标志物的特异性抗体标记，如图所示。该方案不会显着改变 CD 45 阳性细胞的活力。
然而，活的 EPAM 阳性细胞存在相当大的损失。尽管如此，EPAM 阳性和 CD 45 阳性亚群可以根据它们的大小和结构分离成大的上皮肿瘤细胞、小的上皮细胞或大的和小的 CD 45 阳性细胞。此处显示了主要肿瘤浸润亚群的代表性流式细胞术点图，其中淋巴细胞对 CD 45 阳性细胞的活力进行了门控。
最后，可以将乳腺癌上清液中存在的细胞因子表达或总免疫球蛋白与正常乳腺组织的上清液进行比较，如本代表性实验所示，与肿瘤组织相关的两种蛋白质的增加在参加程序时，重要的是要记住快速清洁工作，并在程序的每个步骤中回收最大量的材料，以获得足够数量的细胞您的终端节点分析。
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概述
本协议概述了一种用于快速非酶解离新鲜人体组织碎片的方法，可实现对CD45+细胞（包括淋巴细胞和白细胞）的定性和定量评估。该技术保留了细胞的原始状态，便于进一步分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 了解人体组织中的免疫细胞组成对各种研究应用至关重要。
- 传统的酶解方法可能会改变细胞的原始状态。
- 本协议旨在为组织解离提供一种非侵入性的替代方法。
- 流式细胞术被用于分析特定的淋巴细胞亚群。
研究目的
- 开发一种快速方法将人体组织均质化为单细胞悬液。
- 实现对淋巴细胞群体的定性和定量分析。
- 保留肿瘤浸润淋巴细胞的原始状态以便于成像。
使用的方法
- 使用无菌手术刀将新鲜人体组织碎片切成小块。
- 将组织浆液转移到机械解离管中进行进一步均质化。
- 通过离心收集细胞以进行下游分析。
- 使用流式细胞术分析浸润淋巴细胞及其亚群。
主要结果
- 该方法成功地从人体组织碎片中生成单细胞悬液。
- 可以有效地进行CD45+细胞的定性和定量评估。
- 该技术允许保留淋巴细胞的原始状态。
- 流式细胞术结果表明分析特定淋巴细胞亚群是可行的。
结论
- 这种非酶解离方法适用于分析人体组织淋巴细胞。
- 该协议可应用于各种正常和恶性组织。
- 未来的研究可以利用这种技术获得对免疫细胞动力学的更深入的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, non-enzymatic dissociation of fresh human tissues enables high-fidelity analysis of tumor-infiltrating lymphocytes, supporting immune-oncology discovery and translational research. This protocol preserves cell surface markers and viability, providing reliable quantitative and qualitative data for target validation and mechanistic de-risking. The approach enhances predictive confidence at the interface of early discovery and translational biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of immune cell populations within tumor microenvironments.
- Preserves native cell states for accurate phenotypic and functional analysis.
- Supports mechanistic de-risking by maintaining surface receptor expression.
- Facilitates robust target validation through quantitative lymphocyte profiling.
Screening & Assay Development
- Generates high-viability single-cell suspensions suitable for flow cytometry and molecular assays.
- Standardizes sample preparation, improving reproducibility across experiments.
- Provides quantitative outputs for downstream immunological and molecular screening.
- Enables reliable evaluation of immune cell subpopulations for assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by analyzing cells proximate to their in vivo state.
- Supports translational biomarker discovery through comparative analysis of normal and malignant tissues.
- Facilitates continuity from tissue acquisition to preclinical immune profiling.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on immune contexture data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of tissue acquisition, immune profiling, and translational biomarker workflows, supporting early discovery through preclinical research.
- Discovery Biology: Provides high-integrity immune cell suspensions for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell preparations for immunophenotyping and molecular assays.
- Analytics: Enables robust measurement of lymphocyte subpopulations and soluble immune mediators.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by comparing immune profiles across tissue types.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol applicable to diverse tissue sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-oncology research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tissue processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing reliable immune profiling data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunological assays.
- Needs access to mechanical dissociation instruments and flow cytometry platforms.
- Demands cross-team standardization for consistent sample processing.
- Adaptable to various tissue types with attention to tissue-specific characteristics.
- Cell yield and viability may vary depending on tissue composition and handling speed.
