眼刺激试验（EIT）使用重构型人角膜上皮样（RHCE）组织模型眼刺激性化学品危险性鉴定
August 23rd, 2015
我们已经制定了一个眼刺激试验一种利用三维重建人类角膜样上皮（RHCE）组织模型。该测试能够眼部刺激性和腐蚀性的材料（GHS分类1和2的组合），以及那些不要求标注（GHS无类别）来区分。
眼睛刺激测试的总体目标是根据物质和混合物对眼睛的潜在刺激性进行分类和标记。该程序利用三维重建的角膜样组织模型。到达后，第二天将检测试剂盒在检测培养基中预孵育过夜，水合组织，然后将阳性和阴性对照以及感兴趣的测试化学品局部涂抹在组织表面一式两份。
经过一段时间的暴露后，通过清洗去除测试化学品。将组织在新鲜的检测培养基中后孵育，然后通过 MTT 检测评估化学品的毒性。最终，可以通过比较供试品处理组织与阴性对照处理组织的相对活力来评估供试品的刺激性。
这种技术与快速痕量刺激测试等现有方法的主要优点是它不涉及实验室动物。它利用体外解构的角质样组织模型眼图，它由正常人体细胞组成。它适用于所有类型的物质和混合物，并且可以区分材料会引起眼部刺激或严重眼睛损伤的化学物质。
不需要分类和标记的非刺激物。重建的人类角膜，如上皮组织或 epi。Ocular 以带有多孔膜的插入物制备，营养物质通过该膜传递到细胞。
重建的组织形成非角化上皮，该上皮以逐渐分层但未角化的细胞模拟角膜上皮。收到人角膜样上皮试剂盒后，将 24 孔运输容器中的组织平衡至室温 15 分钟后，在无菌条件下打开装有 24 孔组织板的袋子，并检查所有组织在 agros 凝胶和插入物之间是否有气泡。切。打开磁带。
用无菌纱布取下盖子并检查组织表面。接下来，将 1 毫升 37 摄氏度试剂盒检测培养基分装到预先标记的 6 孔板的孔中。然后用无菌镊子轻轻吸干无菌纱布上含有插入物的组织，以去除任何剩余的运输痕迹，并将它们放入六个孔板的各个孔中。
1 小时后，用 1 毫升新鲜的 37 摄氏度检测培养基替换培养基，并在标准培养条件下将组织孵育过夜。第二天，我将 20 微升不含钙和镁的 DPBS 抚摸到每个组织的顶端表面。如果 DPBS 没有扩散到组织中，请用镊子轻轻握住插入物并敲击板，以确保盐水润湿整个组织表面。
将板孵育 30 分钟。然后用液体试试品处理组织，根据时间表一式两份应用 50 微升阴性对照、阳性对照和适当的试试品。注意确保处理覆盖整个组织表面，然后将插入物孵育 30 分钟，以用固体测试物品处理组织。
首先，将插入物转移到无菌表面上。保持板盖上，以防止空气中的固体颗粒污染。然后，使用水平勺子，根据时间表将 50 毫克测试物品局部涂抹在重复的组织上，注意处理覆盖整个组织表面。
或者，使用预先填充的 1 毫升注射器，头部被切掉。将粉末直接放在培养物上。涂覆固体供试品后，立即按下柱塞以涂抹粉末，将插入物放回其 6 孔板中，并孵育组织 6 小时以冲洗组织。
处理后，在暴露孵育结束时，用 100 毫升 DPBS 填充每个测试品的 3 150 毫升烧杯。用弯曲的镊子抓住插入物的上边缘，将其从孔中取出。然后用镊子从同一处理中夹起两个插入物的上边缘，并将处理物倒出到干净的吸收材料上。
接下来，将插入物浸入 DPBS 的第一个烧杯中，以圆周旋转运动洗涤组织 2 秒钟。然后提起插件，使它们大部分充满 DPBS，并将液体倒回烧杯中。在第一个烧杯中重复洗涤两次。
然后在最后一次洗涤后，以相同的方式在 DPB S3 的第二个和第三个烧杯中冲洗插入物 2 次。将每个插件旋转到大约 45 度角，开口端朝下，然后用上唇接触吸收材料，以倒出任何剩余的 DPBS。然后立即将组织浸入 5 毫升室温测定培养基中。
在预标记的 12 孔板中，在浸泡后浸泡期结束时，倒出检测培养基并将插入物吸干到吸收材料上。然后将插入片段转移到新的六孔板中，每孔含有 1 毫升温热检测培养基，并将板放入培养箱中以开始 MTT 活力检测。将插入物转移到含有 0.3 毫升新鲜制备的 MTT 溶液的 24 孔板中。
转移前将插件轻拍在吸收性材料上。三小时后释放残留在插入物下方的任何气泡，将组织放回培养箱中，将插入物的底部涂抹在吸收材料上。然后，对于非着色剂液体测试品的浸没萃取，将插入物浸入预标记的 24 孔板中，每孔含有 2 毫升适当的萃取溶液，用于固体或液体着色剂的非浸没萃取。
将插入片段转移到预先标记的六孔板中，每孔含有 1 mL 提取溶液。然后用热封剂或多联体密封板以抑制蒸发，并在定轨振荡器上在室温下提取 2 到 3 小时，并在浸没式提取结束时轻轻摇动。刺穿组织，然后将每个插入物中的液体倒回原处，然后将插入物与组织一起丢弃。
在每个孔中混合提取溶液，并将每个样品的两个 200 微升等分试样转移到预先标记的 96 孔板的相应孔中，如非浸没式萃取结束时的示意图所示。丢弃插入物和组织，不要穿孔，并向每个插入物和组织添加 1 毫升提取溶液。将提取溶液在孔中混合，并将每个样品中的两个 200 微升等分试样转移到预先标记的 96 孔板的相应孔中，如刚才所示。
最后，在 96 孔分光光度计中以 570 纳米波长读取样品的光密度，而无需使用参考滤光片，并将结果输入电子表格以计算相应的组织负荷。考虑到此处的文本方案中所示的由于测试化学干扰而进行的更正，本实验显示了使用 10 篇测试文章以及阴性和阳性对照进行的代表性眼睛刺激测试结果。观察到阴性对照的平均光密度为 1.31，对应于 100% 组织活力，相对组织活力为 31.2%对于阳性对照测试文章 1、2、4、7 和 8 表现出大于 60% 的组织变异性，将这些物品归类为非刺激性测试文章 3、5、6、9 和 10。
另一方面，表现出小于或等于 60% 的组织变异性，导致它们被归类为刺激物。在本实验中，除受试文章 2 外，所有受试物品的重复组织之间的组织活力差异小于 20%。因此，除受试品 2 外，所有受试品的结果均被视为合格，因为它们符合所有眼睛刺激试验验收标准。
看完这个视频，你应该对它应该如何进行 DICATION 测试有一个很好的了解，利用体外重建人体角膜像组织模型 4，化学品的危险识别标记。此程序已作为等级测试策略的一部分在 EOC D 测试指南中实施。
概述
本研究介绍了一种使用三维重建的类人类角膜上皮（RhCE）组织模型进行眼部刺激性测试。该测试能够有效区分眼部刺激剂和腐蚀性物质以及不需要标记的物质。
关键研究组成部分
科学领域
- 毒理学
- 体外测试
- 眼部安全评估
背景
- 传统的眼部刺激测试通常涉及动物模型。
- 需要人道且可靠的替代方法。
- RhCE模型模仿人类角膜组织。
- 该方法可以根据物质的刺激潜力对其进行分类。
研究目的
- 开发一种人道的替代方法来评估眼部刺激。
- 根据眼部刺激潜力对物质进行分类和标记。
- 提高眼部安全评估的准确性。
所用方法
- 在测定培养基中预孵育RhCE组织模型。
- 局部应用测试化学品和对照。
- 使用MTT测定评估组织活力。
- 将处理过的组织与阴性对照进行比较以评估刺激潜力。
主要结果
- 该测试成功区分了刺激剂和非刺激剂。
- 它表现出高可靠性和可重复性。
- 该方法消除了对动物测试的需求。
- 结果与现有的监管分类相一致。
结论
- RhCE组织模型是眼部刺激测试的可行替代方法。
- 该方法提高了各种物质的安全评估。
- 它支持向更具道德的测试实践过渡。
常见问题
Executive Industry Relevance
The Eye Irritation Test (EIT) using a reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model provides a validated, animal-free alternative for ocular hazard identification, supporting regulatory compliance under EU REACH and OECD TG 492. It enables early discrimination between GHS-classified irritants/corrosives and non-labeled substances, improving predictive confidence in toxicological screening while reducing reliance on animal models. This mechanistic de-risking approach supports target validation and assay development pipelines by delivering quantitative, reproducible viability endpoints for chemical safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of ocular toxicity pathways using human-relevant tissue models.
- Operational Value: Supports functional target de-risking by identifying irritant liabilities early in discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, quantitative tissue viability readouts via MTT assay for compound profiling.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility and scalability across liquid and solid chemical formats with defined exposure periods.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human tissue model continuity from discovery to preclinical safety evaluation.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by aligning with GHS classification thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
The EIT integrates into discovery workflows as a tiered screening tool for hazard identification, positioned after initial lead identification and prior to preclinical toxicology, enabling data-driven go/no-go decisions based on ocular irritation potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chemical-induced tissue damage using normalized viability metrics.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible outputs with 30-minute (liquid) and 6-hour (solid) exposure windows.
- Analytics: Generates quantitative viability data enabling sensitivity/specificity analysis for predictive modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through human cell-based, mechanism-aligned irritation assessment.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized, reusable platform for cross-project ocular safety screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in ocular hazard classification, reduction of mechanistic ambiguity in toxicity pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and dual-format applicability (liquids/solids) under defined protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage attrition due to ocular toxicity.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization and advancement decisions grounded in GHS-aligned viability thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue culture handling and viability assay execution.
- Dependent on incubation systems, MTT reagent access, and spectrophotometric reading capabilities.
- Necessitates standardized washing and post-exposure incubation protocols across teams.
- Adaptation considerations include tissue hydration consistency and insert handling to avoid mechanical damage.
- Practical limitations include fixed exposure periods and single viability cut-off, which may require optimization for chemico-specific interference.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Treatment Preparation (Day 0)
3:08
Pre-treatment and Test Article Exposure (Day 1)
4:42
Rinsing
6:13
MTT Viability Assay (Liquid Test Day 1; Solid Test Day 2)
8:19
Results: Representative EIT Results for 10 Test Articles
9:36
Conclusion
