Name: 层与层胶原沉积在微流体装置的Microtissue稳定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解微流体装置中层与层胶原沉积技术，通过甲基化和琥珀酰化修饰胶原形成正负电荷分子，交替沉积构建超薄胶原组装层以稳定肝细胞表型，维持细胞极性和分泌功能。

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本工作得到了美国国立卫生研究院的资助，包括美国国家转化科学促进中心的微生理系统联盟资助（UH2TR000503）、糖尿病与消化及肾脏疾病研究所的露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖博士后奖学金（F32DK098905，授予WJM）以及独立研究之路奖（DK095984，授予AB）。

1. 天然可溶性胶原蛋白溶液的制备
<ol>
	<li>采用标准分离方案（如 Piez et al.15 报道的方法），制备或购买 200 mg 来自大鼠尾部的酸化可溶性 I 型胶原，浓度为 1–3 mg/ml。</li>
	<li>根据所需修饰胶原溶液的终体积，按比例调整起始材料的用量。使用 200 mg 可溶性天然胶原，分别制备约 25–30 ml 甲基化胶原溶液和 25–30 ml 琥珀酰化胶原溶液，浓度均为 3 mg/ml。</li>
</ol>
2. 胶原蛋白甲基化
<ol>
	<li>将100 mg天然酸化（pH 2–3）的胶原蛋白溶液用冰冻无菌水稀释至浓度为0.5 mg/ml，并将溶液置于冰上以防止凝胶化。</li>
	<li>用几滴1 N NaOH将胶原蛋白溶液的pH调整至9–10，并在室温下搅拌30分钟。观察胶原蛋白沉淀，溶液将变得浑浊。</li>
	<li>在3,000 × g下离心沉淀的胶原蛋白溶液25分钟。管底应可见清晰的凝胶状沉淀。吸除并妥善处理上清液。</li>
	<li>将沉淀的胶原蛋白重悬于含0.1 N HCl的200 ml甲醇中，在室温下持续搅拌进行甲基化反应，持续4天。胶原蛋白不会完全溶解，但应破碎成微小可见的颗粒，使溶液呈浑浊状。</li>
	<li>甲基化反应完成后，在3,000 × g下离心25分钟，使甲基化胶原蛋白形成沉淀。吸除并丢弃酸化甲醇上清液。</li>
	<li>用无菌PBS反复吹打，将甲基化胶原蛋白溶解于25 ml无菌PBS中，得到浓度约为3 mg/ml的溶液，并通过60 µm细胞筛过滤。使用1 N NaOH以每次20 µl的增量调节溶液pH至7.3–7.4。</li>
	<li>使用商用大鼠胶原蛋白ELISA试剂盒或羟脯氨酸测定试剂盒检测溶液浓度。用无菌PBS将溶液稀释至3 mg/ml。</li>
	<li>将甲基化胶原蛋白溶液转移至带螺口盖的玻璃瓶中进行灭菌，在瓶底小心加入3 ml氯仿，于4 °C静置过夜&#160;，然后无菌操作取出上层液体（即甲基化胶原蛋白）并储存。</li>
	<li>将溶液储存于4 °C，建议在1个月内使用。</li>
</ol>
3. 胶原蛋白琥珀酰化
<ol>
	<li>将另外100 mg的天然酸化（pH 2–3）胶原蛋白溶液用预冷的无菌水稀释至浓度为0.5 mg/ml，并将溶液置于冰上保存，以防止凝胶化。</li>
	<li>用几滴 1 N NaOH 将胶原溶液的 pH 调至 9–10，在室温下搅拌 30 分钟。胶原应发生沉淀，使溶液变浑浊。</li>
	<li>将40 mg丁二酸酐（每毫克胶原使用0.4 mg）溶于10 ml丙酮（1/20）th 胶原溶液的体积）。以约0.5 ml的增量缓慢将该混合物加入胶原溶液中，同时持续搅拌并监测pH值。当pH接近9.0时，加入1至2滴1 N NaOH，以维持pH高于9.0。</li>
	<li>在将全部乙酸酐加入丙酮后，于室温下继续搅拌120分钟。观察溶液逐渐变澄清，表明琥珀酰化胶原蛋白已溶解。定期检测pH值，确保其保持在9.0以上。</li>
	<li>用1 N HCl以20 µl为增量调节溶液pH至4.0。可观察到溶液再次变浑浊，因为琥珀酰化胶原发生沉淀。</li>
	<li>琥珀酰化反应后，将溶液在3,000 × g离心25分钟，使琥珀酰化胶原沉淀。用移液器吸除并弃去含有未反应琥珀酸酐的酸性上清液。</li>
	<li>将琥珀酰化胶原溶于25 ml无菌PBS中，终浓度约为3 mg/ml，通过反复吹打混匀，并经60 µm细胞滤网过滤。使用1 N NaOH以20 µl为增量逐步调节溶液pH至7.3–7.4。</li>
	<li>使用商用大鼠胶原蛋白ELISA试剂盒或羟脯氨酸检测试剂盒测定溶液浓度。用无菌PBS将溶液稀释至3 mg/ml。</li>
	<li>将琥珀酰化胶原溶液转移至带螺口盖的玻璃瓶中，于瓶底小心地加入3 ml氯仿，4 °C静置过夜，然后无菌操作移除并保存上层液体，即为琥珀酰化胶原。</li>
	<li>将溶液于 4 °C 保存，可在 1 个月内使用。</li>
</ol>
4. 胶原蛋白修饰的验证
<ol>
	<li>从天然、甲基化和琥珀酰化胶原溶液中分别制备1 ml样品，并用无菌纯水稀释至浓度为0.1 mg/ml，用于氢离子滴定。进一步将缓冲液通过10 kDa截留分子量的透析膜在水中透析至少1,000倍，更换3次溶液，每次至少4小时&#160;。</li>
	<li>用少量NaOH和HCl将各溶液的pH值调节至7.3。以pH 7.3作为任意参考点，按照Tanford16所述方法对各样品进行氢离子滴定，绘制天然、甲基化和琥珀酰化胶原溶液的滴定曲线。</li>
	<li>绘制每分子结合的H+离子数相对于酸添加体积引起的pH变化曲线。与天然胶原相比，高pH“氨基”区域应显示琥珀酰化胶原向中性点偏移（表明氨基减少）；低pH“羧基”区域应显示甲基化胶原向左偏移（表明羧基减少），而琥珀酰化胶原向右偏移（表明羧基增加）。</li>
	<li>采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBA）比色法，按照标准操作流程17,18，测定天然胶原中被琥珀酰化取代的氨基百分比，以评估琥珀酰化反应的效率。</li>
</ol>
5. 微流控装置的制备与细胞接种
<ol>
	<li>采用标准方法制备微流控装置9。通过光刻技术在硅片上制备SU-8模具，再以此模具对PDMS进行复制 molding，从而制造出用于细胞培养的微流控腔室，其通道高度为100 µm，宽度为0.4–1.5 mm，长度为1–10 mm，适用于细胞生长。</li>
	<li>使用等离子清洗仪对装置表面和玻片表面进行氧化处理，然后压合以实现键合。将装置置于紫外光下灭菌至少30分钟，随后向腔室内加入含50 µg/ml纤连蛋白的无菌PBS溶液，并在37 °C下孵育45分钟。</li>
	<li>向装置中接种细胞，例如原代大鼠或人肝细胞，这些细胞需要胶原凝胶以维持其表型或分化状态的稳定。我们使用20 µl新鲜分离的原代大鼠肝细胞7,19，或每装置接种14×106 个/ml的市售冷冻保存原代人肝细胞。</li>
	<li>让细胞贴壁4–6小时，随后洗去未贴壁细胞，并将接种培养基更换为生长培养基。过夜孵育以确保细胞充分铺展，形成融合的单层细胞。</li>
</ol>
6. 逐层胶原蛋白沉积
<ol>
	<li>在超净工作台中，为每个装置分别准备足量的甲基化胶原蛋白溶液和琥珀酰化胶原蛋白溶液，每种溶液各使用10次，同时准备数毫升培养基。将溶液置于冰上保存。我们每个装置每层使用20 µl胶原蛋白溶液（约为装置总体积的10–15倍）。</li>
	<li>首先使用甲基化（多聚阳离子）溶液，交替用20 µl甲基化和琥珀酰化胶原蛋白溶液冲洗装置，每次加入后等待1分钟。每种溶液总共冲洗10次，整个过程约需20分钟。操作应迅速，以尽量减少细胞脱离培养基的时间。</li>
	<li>观察胶原蛋白根据其分子大小在入口或出口处缓慢积聚。若液体流动阻力增加，可用培养基冲洗装置一至两次，然后继续进行层叠处理。</li>
	<li>完成所有涂层后，用新鲜培养基冲洗装置两次，并放回培养箱。根据细胞类型不同，数小时内应可观察到由细胞外基质诱导的形态学变化，例如肝细胞极性的增强。</li>
	<li>采用标准方法9制备代表性装置用于透射电子显微镜观察，以确认培养细胞表面存在胶原蛋白基质的组装结构。</li>
</ol>
7. 细胞表型与功能的稳定
<ol>
	<li>使用针对该细胞类型的常规方法对细胞形态、活力和极性进行成像。对于肝细胞，采用相差显微镜、LIVE/DEAD 染色法检测活力，以及 CMFDA 染料检测顶膜极化，在14天内连续采集图像，以展示胶原沉积的影响。</li>
	<li>对于细胞形态观察，通过进样口用移液器加入20 µl PBS冲洗，再注入20 µl PBS，然后使用相差显微镜对装置进行成像。</li>
	<li>对于 LIVE/DEAD 染色，通过进样口用移液器加入20 µl PBS冲洗，注入20 µl 根据制造商说明书配制的含 DAPI 的 LIVE/DEAD 染色液，在37 °C孵育30分钟，再次用20 µl PBS冲洗装置，然后使用荧光显微镜对装置进行成像。</li>
	<li>对于胆小管染色，通过进样口用移液器加入20 µl PBS冲洗，注入20 µl 根据制造商说明书配制的含 DAPI 的2 µM CMFDA 染色液，在37 °C孵育30分钟，再次用20 µl PBS冲洗装置，然后使用荧光显微镜对装置进行成像。</li>
	<li>在培养期间的适当时间点收集用过的培养基，并测定细胞代谢产物，以评估细胞功能。对于肝细胞，测定用过培养基中的白蛋白和尿素含量。</li>
	<li>对细胞本身进行终点功能分析，例如检测酶活性水平、抗体染色或RNA分析。对于肝细胞，诱导并测定细胞色素P450酶活性或II相结合酶谷胱甘肽S-转移酶的活性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过逐层沉积修饰胶原蛋白，可在带电细胞或其他材料表面沉积超薄纯胶原蛋白组装层。本研究结果表明，对天然胶原蛋白进行甲基化和琥珀酰化修饰可分别制备出带正电和带负电的多聚胶原蛋白溶液（图1），此类溶液可结合逐层自组装技术，用于在细胞（图2）或其他带电材料表面沉积超薄胶原基质组装层。此类超薄基质层可在微流控装置中接种后，稳定细胞（如肝细胞）的形态、活性和极性（图3），并维持其功能（图4）。
为了成功沉积超薄胶原层，生成甲基化和琥珀酰化胶原的修饰反应至关重要。由于羧基的甲基化反应在热力学上不利，根据勒夏特列原理，胶原的甲基化反应必须在酸化甲醇中进行，以推动反应正向进行。因此，在pH沉淀后，必须彻底去除胶原中的过量水分，再将其溶解于酸化甲醇中，以提高反应效率。对于琥珀酰化反应，在加入丙酮中的琥珀酸酐时，维持溶液pH高于9至关重要。持续监测pH值，并缓慢加入琥珀酸酐的丙酮溶液，有助于确保反应高效进行。在逐层沉积过程中，必须尽量减少细胞脱离培养基的时间。沉积10个...

尽管微流控技术能够精确控制细胞微环境，但在微流控装置中培养细胞（尤其是原代细胞）仍具有挑战性。许多传统的细胞培养技术已被开发用于在组织培养板中维持和稳定细胞功能，但将这些技术转化应用于微流控装置中往往较为困难。
其中一种技术是将细胞培养在胶原凝胶上或夹在胶原凝胶之间，以此作为生理性的三维细胞环境模型。1 I型胶原是生物材料应用中最常用的蛋白质之一，因其在细胞外基质中广泛存在、天然丰度高、具有稳定的细胞黏附位点以及良好的生物相容性。2 多种细胞均可从胶原三维培养中获益，包括癌细胞3,45、微血管内皮细胞6和肝细胞7等。尽管在组织培养板等开放体系中使用胶原凝胶较为简便，但由于微流控装置通道尺寸有限且结构封闭，若使用会凝固的液体则容易完全堵塞通道，因而难以实施。
为解决这一问题，我们将逐层沉积技术8与天然胶原蛋白溶液的化学修饰相结合，在微流控装置中培养的细胞表面构建超薄胶原组装层。这些胶原层能够像胶原凝胶一样稳定细胞形态和功能，并可在不堵塞微流控通道的情况下将胶原基质沉积到细胞上。该方法的目标是对天然胶原蛋白进行修饰，制备出带正电和带负电的胶原蛋白溶液，并通过在细胞表面沉积薄层胶原基质来稳定微流控培养中的细胞。该技术已成功用于稳定原代肝细胞在微流控装置中的形态与功能9。
尽管层层自组装技术此前已有采用天然和合成聚电解质的报道10 覆盖培养板中的肝细胞11,12 作为微流控装置中肝细胞的接种层13,14该方法描述了在肝细胞上沉积一层纯胶原，以模拟三维胶原培养技术。在本方案中，我们以肝细胞为例，说明可通过三维胶原层进行维持的细胞类型。许多其他在胶原三维培养中受益的细胞类型，同样可从逐层沉积形成的超薄胶原基质组装后进行培养中获益。

<table><tbody><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>浓缩型大鼠尾部Ⅰ型胶原蛋白的可选产品</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>浓缩型大鼠尾部Ⅰ型胶原蛋白的可选产品</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>浓缩型大鼠尾部Ⅰ型胶原蛋白的可选产品</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>R&D Systems</td><td>3440-100-01</td><td>浓缩型大鼠尾部Ⅰ型胶原蛋白的可选产品</td></tr><tr><td>丁二酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>琥珀酰化试剂</td></tr><tr><td>无水甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>甲基化试剂</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>用于pH沉淀的试剂</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>用于pH沉淀的试剂</td></tr><tr><td>大鼠Ⅰ型胶原蛋白ELISA试剂盒</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>检测胶原蛋白含量的可选方法</td></tr><tr><td>羟脯氨酸检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>检测胶原蛋白含量的可选方法</td></tr><tr><td>羟脯氨酸检测试剂盒</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>检测胶原蛋白含量的可选方法</td></tr></tbody></table>

逐层胶原沉积微流控装置用于微组织稳定化

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

尽管微流控技术能够精确控制细胞微环境，但在微流控装置内培养细胞仍具有挑战性。在I型胶原凝胶中进行细胞的三维培养有助于稳定细胞形态和功能，这对于在微器件中构建微流控组织模型至关重要。由于微通道尺寸有限，将传统的三维培养技术从组织培养板转移至微流控装置往往较为困难。在本方法中，我们描述了一种对天然I型胶原进行修饰的技术，以制备可带多正电荷和多负电荷的胶原溶液，并可利用逐层沉积法在微流控装置内培养的细胞上方形成超薄胶原结构。这些薄层胶原能够稳定细胞形态和功能，本文以原代肝细胞作为示例细胞进行了验证，从而实现微组织在微流控装置中的长期培养。

天然胶原蛋白可通过甲基化和琥珀酰化修饰，制备出可用于逐层沉积的多阳离子和多阴离子胶原蛋白溶液。琥珀酰化修饰将天然胶原蛋白的ε-氨基与琥珀酰基团结合，而甲基化则将天然胶原蛋白的羧基与甲基团结合（图1A）。这些对胶原蛋白氨基酸侧链的修饰会改变溶液的pH滴定曲线。与天然胶原蛋白相比，琥珀酰化减少了氨基的数量并增加了羧基的数量，而甲基化对氨基数量无影响，但减少了羧基的数量（图1B）。这些修饰改变了胶原分子的电荷特性。琥珀酰化去除了带正电荷的基团，并将其替换为带负电荷的基团，而甲基化则去除了带负电荷的基团（图1C）。
逐层沉积甲基化和琥珀酰化胶原溶液（COL LBL）可在带电表面（如细胞）上形成超薄的胶原基质组装层（图 2A）。在微流控装置内，接种于纤连蛋白包被的玻璃表面的原代肝细胞（图 2B）可被这种纯胶原基质组装层包覆（图 2C）。在细胞上沉积10个双层可形成厚度约为140 nm的胶原层...

在微流控装置中构建功能性微组织需要通过将传统细胞培养技术适应微器件的有限空间尺寸，以稳定细胞表型。对胶原蛋白进行修饰可实现超薄胶原组装体的逐层沉积，从而在微流控组织模型中稳定原代细胞（如肝细胞）。

尽管微流控技术能够精确控制细胞微环境，但在微流控装置内培养细胞仍具有挑战性。3D ...

本实验的总体目标是在微流控装置中的细胞上沉积一层薄的胶原蛋白组装结构。首先通过甲基化修饰酸化后的天然胶原蛋白，使其形成净正电荷的胶原蛋白分子；第二步是通过酰化修饰酸化后的天然胶原蛋白，使其形成净负电荷的胶原蛋白分子。接下来，制备微流控装置并接种肝细胞，使其贴壁并过夜铺展。最后一步是通过交替将细胞暴露于带正电荷和带负电荷的胶原溶液中，在细胞层上方形成10层胶原双分子层。最终，通过相差显微镜和免疫荧光显微镜以及白蛋白和尿素检测，验证细胞极性的建立与维持以及分泌功能的表现。该技术的主要优势在于，它能够在微流控装置中实现肝细胞培养，所用方法与过去二十多年中在培养板上应用的技术相似。该方法无需复杂的装置设计，且所沉积的基质非常薄，厚度约为100纳米。我们最初是在探讨如何将培养板上的细胞培养技术转移至微流控装置时，提出了这一方法的设想。胶原蛋白三明治法适用于开放式顶置显微系统，但所用的水凝胶与通道高度受限的封闭式微流控装置不兼容。将100毫克天然酸化胶原蛋白溶液用冰上预冷的无菌水稀释至浓度为0.5毫克/毫升，并将溶液置于冰上以防止凝固。接着，用几滴1 N氢氧化钠将胶原蛋白溶液的pH值调节至9至10之间，并在室温下轻轻搅拌溶液30分钟。随着胶原蛋白沉淀，溶液将开始变得浑浊，将沉淀的胶原蛋白溶液在3000 × g条件下离心25分钟。随后，应在管底观察到清晰的凝胶状沉淀物，吸除上清液，然后将沉淀的胶原蛋白重悬于200毫升含0.1 N盐酸的甲醇中，在室温下搅拌反应四天以进行甲基化反应。甲基化反应完成后，在3000 × g条件下离心25分钟，使甲基化的胶原蛋白形成沉淀，随后吸除并弃去酸化的甲醇上清液。接下来，将甲基化的胶原蛋白溶解于25毫升无菌PBS中，并通过60微米细胞筛过滤溶液。使用1 N氢氧化钠，每次加入20 µL，将溶液的pH值调节至7.3至7.4。使用商用大鼠胶原蛋白ELIZA试剂盒或羟脯氨酸检测试剂盒测定胶原溶液的浓度。然后用无菌PBS将溶液稀释至3 mg/mL。将甲基化胶原蛋白溶液转移至带螺口盖的玻璃瓶中进行灭菌。在瓶底小心地加入三毫升氯仿，并将瓶子置于四摄氏度环境中静置过夜。次日早晨。无菌条件下，移除上层甲基化胶原层。将甲基化胶原在 4 摄氏度下保存，并在一个月内使用。用冰水、无菌水将另外 100 毫克天然酸化胶原溶液稀释至浓度为 0.5 毫克/毫升，并将溶液置于冰上以防止变性；如前所述，用氢氧化钠调节胶原溶液的 pH 值，并在室温下搅拌溶液以使胶原沉淀。接着，将40毫克六氰基邻苯二甲酸酐溶解于10毫升丙酮中。在搅拌的同时，将该混合物以每次0.5毫升的增量逐次加入胶原蛋白溶液中，并持续监测溶液的pH值。当pH接近9.0时，加入一至两滴1 N氢氧化钠以维持pH高于9.0，并在室温下持续搅拌120分钟。加入全部六份氰化物和氢化物溶液后，观察混合物逐渐变澄清，表明琥珀酰化胶原蛋白已溶解，继续定期检测 pH 值，确保其保持在 9.0 以上。当所有琥珀酰化胶原蛋白完全溶解后，使用 20 µL 一当量盐酸逐次调节溶液 pH 至 4.0。观察溶液再次变浑浊，表明琥珀酰化胶原蛋白发生沉淀。接下来，将溶液在3000 × g 条件下离心25分钟。沉淀琥珀酸胶原后，弃去酸化上清液；用无水氯化亚锡处理未反应的基团，再用移液器反复吹打，将琥珀酸胶原溶解于25毫升无菌PBS中，终浓度约为3毫克/毫升。随后，将溶液通过60微米细胞筛过滤，然后调节溶液pH值至7.3至7.4之间。使用20微升的一当量氢氧化钠，通过商用大鼠胶原ELIZA试剂盒或羟脯氨酸检测试剂盒测定溶液的浓度。然后将溶液稀释至3毫克/毫升。使用无菌PBS，以与甲基化胶原溶液相同的方式对该胶原溶液进行灭菌处理。首先采用标准技术制备一种微流控装置，该装置具有细胞培养腔室，其通道高度为100微米，宽度为0.4至1.5毫米，长度为1至10毫米，用于细胞生长。使用等离子清洗仪对装置表面和载玻片表面进行氧化处理，然后将两者压合在一起以形成键合。用紫外光照射设备至少 30 分钟以进行灭菌。随后，在腔室中加入含 15 µg/mL 纤连蛋白的无菌 PBS 溶液，37 °C 下孵育 45 分钟。接着，按照随附文本方案中所述的方法将细胞接种至该装置中。在层流超净台中，为每个装置分别准备足够进行10次应用的甲基化胶原蛋白溶液和去甲基化胶原蛋白溶液，以及少量额外的培养基。将溶液置于冰上保存。交替使用20 µL甲基化胶原蛋白溶液和去甲基化胶原蛋白溶液冲洗装置。每次施加溶液之间间隔一分钟。每种溶液对装置冲洗共10次。在构建胶原蛋白层时，应迅速操作以尽量减少细胞无培养基孵育的时间；在此过程中，可观察到胶原蛋白逐渐在微流控装置的入口和出口处积聚。如果流体流动阻力增加，用培养基冲洗装置一至两次，然后继续铺层。所有层施加完毕后，用新鲜培养基冲洗装置两次，并放回培养箱。甲基化和乙酰化会改变胶原分子的电荷特性。交联作用会去除带正电荷的基团，并以带负电荷的基团替代；而甲基化则去除带负电荷的基团，从而形成整体带正电的分子，使得两种胶原蛋白变体能够在带电表面（如细胞表面）实现逐层沉积。在微流控装置中，接种于纤连蛋白包被玻璃上的原代肝细胞可通过该逐层沉积方法进行包被。组装胶原蛋白基质并在细胞上沉积10个双层结构，可形成厚度约为140纳米的胶原层；而无顶层胶原逐层结构的肝细胞则不具备此结构。随着时间的推移，基质中的细胞会失去其分化表型，发生收缩并从微流控装置表面脱落。相比之下，覆盖有超薄胶原组装层的肝细胞可维持其分化形态，在14天内保持超过90%的存活率以及细胞极性。除了细胞存活率、形态和极性外，胶原逐层组装技术还能恢复并稳定原代肝细胞的功能，如本视频所示。观看本视频后，您应充分了解如何对胶原进行甲基化和琥珀酰化处理，以制备带净正电荷和净负电荷的胶原溶液，并掌握如何利用这些溶液在微流控装置内的细胞表面进行逐层沉积，形成薄层胶原结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

层与层胶原沉积在微流体装置的Microtissue稳定

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。...

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

利用含有包埋细胞且表面涂覆内皮细胞的圆柱形胶原凝胶（称为模块）来构建微组织。...

利用含细胞的胶原凝胶模块制备微组织

该模型系统始于含有肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶，可用于以非破坏性方式实时研究内源性胶原蛋白的（再）组织过程。该模型系统具有高度可调性，可结合不同细胞来源和培养基添加剂使用，并能轻松适应特定研究需求。...

利用肌成纤维细胞构建纤维蛋白基组织工程支架并施加约束与应变以诱导细胞和胶原的重排

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

我们介绍一种在聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上微流控沉积图案化京尼平和纤连蛋白的方法，可延长富含血管平滑肌细胞组织的存活时间。该组织制备方法与先前的血管肌肉薄膜技术相结合，用于在与疾病相关的时程内测量血管收缩力。...

微流控京尼平沉积技术用于微图形化血管肌薄层的长期培养

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。...

三维微血管的微图形化与组装

本文提供了用于软骨细胞压缩的气动微流控装置的制备与表征的详细方法。...

一种用于对软骨细胞施加动态压缩刺激的微流控平台

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（&lt;250 µm...

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

本文介绍一种用于构建独特双层微流控装置的实验方案，以研究上皮组织稳态的电机械调控机制。该装置可施加垂直于组织平面的静态生理性电流，影响细胞间黏附、增殖及细胞挤出过程。通过活细胞成像和机械应力测量，揭示这些生物学过程的作用机制。...

利用双层微流控装置揭示电机械调控在组织稳态中的作用

了解微流体装置中层与层胶原沉积技术，通过甲基化和琥珀酰化修饰胶原形成正负电荷分子，交替沉积构建超薄胶原组装层以稳定肝细胞表型，维持细胞极性和分泌功能。

逐层胶原沉积微流控装置用于微组织稳定化

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