层与层胶原沉积在微流体装置的Microtissue稳定
2015年9月29日
在微流控器件中创造功能性微组织需要通过将传统细胞培养技术适应微器件中有限的空间维度来稳定细胞表型。胶原蛋白的修饰允许超薄胶原蛋白组装体逐层沉积，这些组装体可以稳定原代细胞，例如肝细胞，作为微流体组织模型。
该程序的总体目标是将薄的胶原蛋白组件沉积到微流体装置中的细胞上。这是通过首先通过甲基化修饰酸化的天然胶原蛋白以产生带正电的净胶原蛋白分子来实现的。第二步是通过修饰酸化的天然胶原蛋白，以产生带负电的胶原蛋白分子。
接下来，制备微流体装置并接种肝细胞，使其附着并扩散过夜。最后一步是通过交替将细胞暴露于带正电和带负电的胶原蛋白溶液来沉积胶原蛋白组件，从而在细胞层顶部产生 10 个双层胶原蛋白。最终，相和免疫荧光显微镜以及白蛋白和尿素测定用于显示细胞极性和分泌功能的发育和维持。
该技术的主要优点是，它能够使用与 20 多年来在平板培养中应用的技术类似的技术在微型设备中培养肝细胞。它不需要复杂的器件设计，并且沉积的基体非常薄，约为 100 纳米。我们最初想到这种方法是在集思广益如何将 Capy 类细胞培养技术从板转化为微流控设备时产生的。
胶原蛋白夹心方法适用于开顶显微系统，但使用的水凝胶与通道高度有限的封闭微型器件不兼容。用冰、冷水、无菌水将 100 毫克天然酸化胶原蛋白溶液稀释至每毫升 0.5 毫克的浓度，然后将溶液放在冰上以防止酸化。接下来，用几滴普通氢氧化钠将胶原蛋白溶液的 pH 值调节到 9 到 10 之间，并在室温下轻轻搅拌溶液 30 分钟。
随着胶原蛋白沉淀，溶液开始变得浑浊，将沉淀的胶原蛋白溶液旋转 3000 倍 G，持续 25 分钟。然后，在管底可见透明凝胶状沉淀，吸出 snat，然后将沉淀的胶原蛋白重悬于 200 毫升含 0.1 正盐酸的甲醇中，让甲基化反应发生，同时在室温下搅拌 4 天后甲基化离心机，在 3000 倍 G 的溶液中沉淀 25 分钟，使甲基化胶原蛋白沉淀， 然后吸出并处理酸化甲醇 supinate。接下来，将甲基化胶原蛋白溶解在 25 毫升无菌 PBS 中，并通过 60 微米细胞过滤器过滤溶液。
使用 20 微升的正常氢氧化钠将溶液的 pH 值调节至 7.3 至 7.4。使用商业大鼠胶原蛋白 ELIZA 试剂盒或羟脯氨酸测定试剂盒评估胶原蛋白溶液的浓度。然后用无菌 PBS 将溶液稀释至 3 毫克/毫升。
通过将甲基化胶原蛋白溶液转移到带有螺旋盖的玻璃瓶中来对其进行消毒。小心地在瓶子底部分层放置 3 毫升氯仿，并让瓶子在 4 摄氏度下凝固过夜。第二天早上。
在无菌条件下，去除顶部的甲基化胶原蛋白层。将甲基化胶原蛋白储存在 4 摄氏度，并在一个月内使用。再用冰、冷水、无菌水将 100 毫克天然酸化胶原蛋白溶液稀释至每毫升 0.5 毫克的浓度，然后将溶液放在冰上以防止染色，如前所述，用氢氧化钠调节胶原蛋白溶液的 pH 值，并在室温下搅拌溶液以沉淀胶原蛋白。
接下来，将 40 毫克 6 烯酸酐溶解在 10 毫升丙酮中。以 0.5 毫升的增量缓慢地将此混合物添加到胶原蛋白溶液中，同时搅拌并持续监测溶液的 pH 值。当 pH 值接近 9.0 时，加入一滴或两滴一种正常氢氧化钠，将 pH 值保持在 9.0 以上，在室温下连续搅拌 120 分钟。
加入所有六种 cynic 和氢化物溶液后，观察混合物随着琥珀酸胶原蛋白的溶解而变得透明，继续定期检查 pH 值以确保其保持在 9.0 以上。当所有琥珀酸胶原蛋白都溶解后，使用 20 微升的正常盐酸将溶液的 pH 值调节至 4.0。观察溶液，随着琥珀酸胶原蛋白沉淀，再次变得浑浊。
接下来，将溶液以 3000 倍 G 离心 25 分钟。为了沉淀琥珀酸胶原蛋白 asbury 并用未反应的镍酐处理酸化的 snat，将琥珀酸胶原蛋白溶解在 25 毫升无菌 PBS 中，得到最终浓度约为 3 毫克/毫升。然后通过 60 微米的细胞过滤器过滤溶液，然后将溶液的 pH 值调节到 7.3 到 7.4 之间。
使用 20 微升增量的一种正常氢氧化钠，使用市售胶原大鼠 ELIZA 试剂盒或羟脯氨酸测定试剂盒评估溶液的浓度。然后将溶液稀释至每毫升 3 毫克。使用无菌 PBS 对这种胶原蛋白溶液进行消毒，方法与甲基化胶原蛋白溶液相同。
首先使用标准技术制造微流体装置，该装置具有 100 微米高、0.4 至 1.5 毫米宽和 1 至 10 毫米长的细胞培养室，用于细胞生长。使用等离子清洁剂氧化设备和载玻片的表面。然后将两者压在一起形成粘合。
通过暴露在紫外线下至少 30 分钟对设备进行消毒后。用每毫升 15 微克的纤连蛋白填充腔室，溶于无菌 PBS 中，并在 37 摄氏度下孵育 45 分钟。接下来，查看带有单元格的设备，如随附的文本协议中所述。
在层流组织培养罩中，为每个设备准备足够体积的甲基化和化胶原蛋白溶液，每种溶液可应用 10 次，以及几极毫升的培养基。将溶液放在冰上。交替用 20 μL 甲基化和活化胶原蛋白溶液冲洗装置。
在每个应用程序之间等待 1 分钟。每种溶液总共冲洗设备 10 次。快速工作以最大限度地减少细胞没有培养基的时间 在生长胶原蛋白层的同时，可以观察到胶原蛋白在微流体装置的入口和出口处缓慢积累。
如果流体流动阻力增加，请用介质冲洗设备一次或两次，然后继续分层。涂完所有层后，用新鲜培养基冲洗设备两次，然后放回培养箱中。甲基化和化会改变胶原分子的电荷特性。
Ation 去除带正电荷的基团并用带负电荷的基团取而代之，甲基化去除带负电荷的基团，产生带净正电荷的分子，从而允许两种胶原蛋白变体逐层沉积在带电表面（如细胞）的顶部。在微流体装置内接种在纤连蛋白涂层玻璃上的原代肝细胞可以逐层涂覆。胶原蛋白基质组装，在细胞上沉积 10 个双层，逐层形成约 140 纳米肝细胞的胶原层厚度，没有顶部胶原蛋白。
随着时间的推移，基质失去了其分化的表型契约并从微流体装置的表面升起。相比之下，覆盖有超薄胶原组装体的肝细胞保持其分化形态，活力大于 90%，极化超过 14 天。除了细胞活力形态和极化外，胶原蛋白逐层技术还可以恢复和稳定原代肝细胞的功能，如图所示，看完这个视频，您应该对如何甲基化和琥珀酸胶原蛋白以产生带净正电荷和负电荷的胶原蛋白溶液以及如何在逐层沉积中使用它们在微流体装置中的细胞顶部创建薄的胶原蛋白组装体。
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概述
本研究聚焦于在微流控装置内将薄层胶原蛋白组装物沉积到细胞上，以稳定细胞表型。该方法包括修改胶原蛋白以创建正负电荷分子，这些分子交替沉积以形成多层结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 细胞培养
- 组织工程
背景
- 微组织对于模拟器官功能至关重要。
- 在微流控应用中，稳定细胞表型至关重要。
- 胶原蛋白是组织工程的关键组成部分。
- 逐层沉积技术可增强细胞功能。
研究目的
- 开发微流控装置中胶原蛋白组装沉积的方法。
- 稳定肝细胞等主要细胞以用于组织模型。
- 评估沉积后的细胞极性和分泌功能。
使用的方法
- 通过甲基化和其他方法修改天然胶原蛋白。
- 准备微流控装置并种植肝细胞。
- 通过交替暴露细胞于带电溶液来实现胶原蛋白的逐层沉积。
- 使用相位和免疫荧光显微镜，以及白蛋白和尿素测定。
主要结果
- 成功在肝细胞上沉积10层胶原蛋白双层。
- 证明了细胞极性的维持。
- 通过测定证实肝细胞的分泌功能。
- 使用显微镜技术观察到结构完整性。
结论
- 该方法有效地在微型装置中稳定细胞表型。
- 逐层胶原蛋白沉积增强了组织模型的功能。
- 该方法可以应用于其他细胞类型和各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Stabilizing primary hepatocyte morphology and function in microfluidic devices remains a critical challenge for liver tissue modeling and drug metabolism studies. This layer-by-layer collagen deposition technique enables long-term culture of microtissues by creating ultrathin, biocompatible matrices that recapitulate key aspects of the native extracellular matrix. By supporting differentiated phenotypes for over 14 days, the method improves predictive confidence in preclinical hepatocyte-based assays, reducing biological variability that can compromise lead identification and safety screening outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hepatocyte-specific pathways by maintaining polarized morphology and secretory function essential for target validation in liver disease models.
- Operational Value: Reduces phenotypic drift during culture, increasing reproducibility of functional readouts used to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized collagen-coated microfluidic platforms that support quantitative albumin and urea assays for consistent compound screening.
- Operational Value: Compatible with existing microfluidic fabrication workflows, allowing scalable integration into automated screening systems without complex device redesign.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains hepatocyte differentiation and function over two weeks, supporting preclinical continuity from discovery to toxicology studies.
- Operational Value: Extends the usable window for longitudinal assessment of drug-induced liver injury (DILI) biomarkers in microfluidic tissue models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling stable hepatocyte cultures that support early-stage assay development and preclinical validation of liver-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by preserving hepatocyte polarity and function, which are critical for assessing target engagement in metabolic pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts via albumin and urea secretion, facilitating reliable compound evaluation in microtissue formats.
- Analytics: Generates functional endpoints that allow cross-condition comparison of hepatocyte health and metabolic activity.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by stabilizing phenotypes needed for disease-relevant modeling.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface modification technique applicable across multiple microfluidic platforms and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintenance of differentiated hepatocyte phenotype and function over extended culture periods.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via ultrathin, precisely deposited collagen layers that minimize batch variability.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false negatives from dedifferentiated cells in liver toxicity screening.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on stable, long-term functional readouts from microfluidic liver models.
Implementation Considerations
- Expertise in collagen chemistry and microfluidic device preparation is required for methylation and succination steps.
- Access to centrifugation, pH control, and sterile filtration infrastructure is necessary for collagen modification.
- Standardization across teams depends on consistent layering timing and solution handling to ensure uniform thin-film deposition.
- Adaptation to other cell types requires validation of collagen compatibility and impact on phenotype stability.
- Practical limitations include the incompatibility of hydrogels with closed microfluidic devices having limited channel heights, as noted in the source.
