Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

该程序的总体目标是生成对齐和随机的 3D 胶原蛋白基质，以便在 3D 环境背景下观察细胞迁移或其他细胞过程。这种方法旨在捕获我们在真实组织中发现的胶原蛋白特征，这有助于回答关键问题，例如细胞用于识别对齐或随机细胞外基质的机制。这种技术的主要优点是您可以纵 3D 环境的组织、其中的图像单元，并且您可以使用常用设备经济高效地完成此作。

一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为他们没有很好地混合胶原蛋白溶液和中和缓冲液，并且他们不一致地通过通道吸收胶原蛋白。演示此程序的是 Brian Burkel，他是我实验室的高级科学家。首先，在添加细胞和培养基之前，将胶原蛋白和 HEPES 缓冲液彻底混合，以确保胶原蛋白的正确中和。

然后，将细胞和培养基添加到中和的胶原蛋白混合物中，并按照随附的文本方案中的说明将其置于冰上。将冰冷的混合物移液到无菌、未经组织培养处理的表面，以尽量减少胶原蛋白凝胶外细胞的附着和生长。使用移液管均匀涂抹溶液。

让凝胶在室温下聚合约 10 至 15 分钟。接下来，盖上凝胶，将它们移至 37 摄氏度的培养箱中再放置 45 至 60 分钟以完成聚合。聚合后，凝胶会变得不透明。

聚合后，加入 2 到 3 mL 培养基。然后，通过在孔的周边运行 200 移液管，从孔的侧面释放凝胶。轻轻旋转培养皿，使凝胶从底面释放出来。

为了创建用于对齐胶原蛋白基质的 PDMS 微通道。首先，使用其他地方描述的标准软光刻技术准备 SuA 硅母版。接下来，用工艺棒将 20 克弹性体基质与 2 克固化剂在一次性杯子中彻底混合。

充分混合后，将一次性杯子放入真空室中，在 550 毫米汞柱的真空压力下对 PDMS 混合物进行脱气。将混合物脱气大约一到一个半小时。在 PDMS 脱气时，将一张干净的透明薄膜放在热板上，然后是硅母版，以准备硅母版。

确保微通道模具朝上。一到一个半小时后，从真空室中取出脱气的 PDMS。慢慢将 PDMS 倒入母版的中心，并让重力使其均匀分布。

接下来，小心地在硅母版和 PDMS 顶部滚动第二张透明薄膜，以避免气泡。轻轻地将一块橡胶板放在透明板的顶部，然后是一块 1/8 英寸的亚克力板，然后，在亚克力板顶部添加三个 10 磅重物中的第一个。最初，第一个配重物将浮动，使其稳定下来，然后再继续处理剩余的两个配重板。

准备继续时，将热板设置为 70 摄氏度，并固化 PDMS 四个小时。固化后，让 PDMS 再冷却至少一小时，然后小心地剥离晶圆的顶部透明薄膜。最后，用镊子取出通道。

将通道倒置在新的干净透明薄膜上，并使用锋利的镊子打圈清洁所有端口。取出任何松动的 PDMS 碎片。接下来，将一条包装胶带放在工作台上，粘性面朝上，并将 PDMS 通道正面朝下放在胶带顶部。

用一对镊子的圆端向下按压通道，以确保接触良好。拆下通道并在两侧重复此过程，直到清除所有可见的碎屑。然后，将干净的、准备好的 PDMS 通道转移到装有 70% 乙醇的 50 毫升锥形管中。

以最大速度涡旋通道 30 秒，然后用新鲜的 70% 乙醇替换溶液。使用无菌技术，将 PDMS 通道面朝上转移到干净无菌的培养皿中。然后，对通道进行紫外线处理，直到乙醇蒸发。

干燥后，将通道翻转到盖玻片或玻璃底盘上，然后将它们压在玻璃杯上以形成良好的密封。添加一片无菌 PDMS 以覆盖并关闭通道的中心部分，并在继续之前让设置彻底干燥。接下来，将 100 微升每毫升 10 微克胶原蛋白溶液的液滴放在通道顶部，并使用真空将其吸入通道。

将通道在 37 摄氏度下孵育 1 小时，然后将仍然充满胶原蛋白涂层溶液的通道转移到冰箱中。将装置冷却约 15 至 30 分钟，然后使用抽吸器或移液管从通道中取出胶原蛋白涂层溶液。首先中和胶原蛋白溶液，用细胞培养基稀释，然后在冰上孵育 15 分钟。

然后，将 120 至 150 微升胶原蛋白溶液放入预冷通道的端口 A 中。接下来，将 25 毫升移液器连接到真空管上，并将其放在端口 C 上，使用它通过一个均匀的运动吸入混合物，一旦胶原蛋白到达末端就停止。生成随机矩阵的最重要步骤是缓慢地通过通道吸取胶原蛋白。

如果它被太快地通过，将导致通道部分或整个通道的对齐增加。小心地从端口区域去除多余的溶液，然后将无菌 PDMS 贴片放在两个端口（A 和 C）上。两到三分钟后，取下覆盖端口 B 的中心 PDMS 贴片，并将两到三窝浓度为每毫升 1 到 300 万个细胞的微窝细胞添加到中心端口中。让凝胶在室温下部分聚合 10 到 15 分钟，然后将混合物转移到 37 摄氏度的培养箱中再 15 到 30 分钟。

聚合后，取下 PDMS 端口盖并添加介质以完全覆盖通道。在这里，将 50， 000 个 4 个 T 1 细胞包埋在 2 mg/ml 或 3.5 mg/ml 胶原蛋白凝胶中 5 天。四个 T 细胞 one line 是一种高度收缩的 Med Aesthetic 癌症细胞系，但它只能将高密度凝胶收缩约 10%可压缩，低密度凝胶在同一时间范围内收缩 57%。

胶原蛋白排列的程度受胶原蛋白流速的调节，因此较高的胶原蛋白流速会产生更好的排列。使用较窄的通道加上较高的真空压力可增强胶原蛋白网络的对齐，而较宽的通道与低真空压力结合使用可产生随机基质。一旦掌握，如果作得当，可以在两个半小时内完成胶原蛋白凝胶或通道的倾倒。

在尝试此过程时，请务必记住在开始之前设置组件。一旦你开始使用胶原蛋白，你就需要快速工作。经过开发，这项技术为 3D 细胞生物学领域的研究人员铺平了道路，以探索细胞粘附、迁移和侵袭到三维细胞外环境中。

观看此视频后，您应该对如何倾倒不同密度的胶原蛋白凝胶以及如何生成随机和对齐的胶原蛋白基质有很好的了解。