Name: 3D胶原凝胶和微通道3D相互作用的研究准备在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习制备定向与随机三维胶原凝胶基质的方法，利用PDMS微通道技术观察细胞迁移行为。该技术可模拟真实组织中的细胞外基质结构，为组织工程研究提供经济高效的实验方案。

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作者感谢以下基金对本研究的资助：UO1CA143069、R01CA142833、R01CA114462、RO1CA179556、T32-AG000213-24 和 T32-GM008692-18。我们还感谢 LOCI 的 Jeremy Bredfelt 和 Yuming Liu 在 CT-FIRE 分析开发及使用过程中提供的支持与协助。

1. 用于三维研究和细胞收缩检测的胶原蛋白溶液的中和、稀释与聚合
<ol>
	<li>在冰上、无菌细胞培养超净台中，用预冷的无菌100 mM HEPES（溶于2×PBS，pH 7.4）以1:1比例中和胶原蛋白，置于15 ml锥形管中。用塑料移液管充分混匀，直至溶液均匀，无可见混匀产生的旋涡。混匀过程中注意避免引入气泡。短暂置于冰上保存。</li>
	<li>用细胞培养基（如RPMI、DMEM）将中和后的胶原蛋白稀释至适当浓度 等等。).
	<ol>
		<li>为计算制备目标胶原蛋白浓度所需的中和胶原量，使用以下公式 N = (D×V)/(S/2)，其中 N 中和胶原所需的量， D 即所需的胶原蛋白浓度， V 是目标胶原蛋白浓度的终体积，S 是起始储备胶原蛋白浓度。</li>
		<li>通过加入细胞和细胞培养基溶液，将中和后的胶原液体积补足。充分混匀后置于冰上保存，待准备浇铸时使用。
		<ol>
			<li>示例：制备1 ml体积、浓度为2 mg/ml的凝胶（在6孔板或50 mm玻璃底培养皿中成胶的典型体积），首先将目标浓度（2 mg/ml）乘以目标终体积（1 ml），得到2 mg。将该数值除以试剂瓶上标注的储存液浓度的一半（9.49 mg/ml）。在此情况下，取0.42 ml中和后的胶原蛋白溶液，与0.58 ml培养基/细胞混合液混合稀释。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将冰冷的胶原/细胞/培养基混合物移入未经组织培养处理的6孔板或50 mm玻璃底培养皿中。用移液枪头将溶液均匀铺开。 
	注意：必须使用未经组织培养处理的培养板，以尽量减少细胞在胶原凝胶外的贴附或生长。</li>
	<li>室温下静置约10至15分钟，使其聚合。凝胶在聚合后应变为不透明状。</li>
	<li>待其变浑浊后，将培养皿转移至37 ˚C继续孵育45–60分钟，以完成聚合。</li>
	<li>孵育45至60分钟后，加入2至3毫升培养基，用P200移液器吸头沿孔或培养皿边缘移动一周，使凝胶从孔壁脱离。轻轻摇晃培养皿以释放凝胶，胶原凝胶应悬浮于培养基中。</li>
</ol>
2. 蛋白质印迹、细胞形态发生及凝胶收缩力测定
<ol>
	<li>为评估蛋白质水平、细胞形态或细胞收缩力与细胞外基质（ECM）硬度的关系，首先根据步骤1.1–1.6制备接种细胞的胶原凝胶，用于为期7–10天的实验。每种细胞系的接种密度需根据其生长速率和汇合度通过实验确定。对于10天的实验，接种密度可为每凝胶20,000–100,000个细胞。</li>
	<li>为测量细胞收缩力，每隔24小时或在适当的时间间隔，使用直尺或相机测量凝胶直径。 
	注意：此外，还可通过显微镜采集的相应图像，检测凝胶中接种细胞系的特征性形态学特征，如类腺泡结构、上皮细胞管状结构、细胞突起和片足。</li>
	<li>为评估蛋白质水平，使用RIPA缓冲液裂解凝胶，并按照Wozniak所述方法对目标蛋白质进行Western印迹分析 等. 17 和 Gallagher 等. 18.
	<ol>
		<li>重要提示：在比较不同细胞系的收缩力时，应将收缩力归一化为总DNA量，该DNA可按照Lui所述方法从凝胶中提取。 等19，或一种不变的持家蛋白（组蛋白、GAPDH） 等等。通过Wozniak所述的Western印迹分析方法检测） 等.17 和 Gallagher 等.18若使用血细胞计数板对凝胶内的细胞进行计数，需将细胞数量归一化至凝胶的总面积，因为收缩的凝胶会使细胞浓缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每隔3至4天更换凝胶培养基，移除1毫升旧培养基，并加入1毫升新鲜培养基。测量完成后应及时补充培养基，因为添加新鲜培养基或血清会导致收缩力出现短暂升高。</li>
</ol>
3. 用于胶原纤维定向排列的PDMS微通道制备
注意：为了生成取向的胶原基质，需要通过软光刻技术制备SU-8硅模板，以制作PDMS微通道的模具（图2A）15。
<ol>
	<li>制备PDMS通道时，使用一次性杯子和搅拌棒将PDMS充分混合。对于6英寸的硅胶母模，将20 g弹性体基质与2 g固化剂混合。</li>
	<li>将装有PDMS混合物的一次性杯子置于真空腔中，在550 mm Hg的真空压力下脱气。脱气时间为1 - 1.5小时。</li>
	<li>在对PDMS进行脱气的同时，准备用于浇注的硅胶母模。将一张干净的透明薄膜放置在加热板上，然后将硅胶母模置于其上，确保微通道模具面朝上。 
	注意：在PDMS浇铸和固化过程中，硅胶母模将被夹在两张透明薄膜之间。</li>
	<li>1 - 1.5小时后，从真空腔中取出脱气后的PDMS，缓慢地将其倾倒在硅胶母模上。 
	重要提示：避免产生气泡。持续从母模中心倾倒，并依靠重力使其均匀铺展。 
	注意：PDMS液滴无需完全延伸至母模边缘。</li>
	<li>将PDMS浇注到母模上后，在硅胶母模和PDMS上方覆盖第二张透明薄膜。小心地将第二张透明膜从一端滚压至另一端，覆盖在PDMS/硅胶母模上，以避免夹入气泡。操作时请勿过快。此时PDMS应已均匀覆盖母模表面。</li>
	<li>在透明膜上方轻轻放置一片橡胶片，然后在其上放置一片1/8&#34;的亚克力板。</li>
	<li>在亚克力板上放置三个10磅的重物。初始时，这些重物会呈现“漂浮”状态&#34;float&#34;。请等待其自然沉降并稳定后再进行后续操作。</li>
	<li>将加热板温度设定为70 ˚C，使PDMS固化4小时。固化完成后至少再冷却1小时，方可进行扰动操作。</li>
	<li>小心地从晶圆上剥离顶部的透明薄膜，并使用镊子取出通道结构。</li>
	<li>将制得的PDMS通道存放在无尘培养皿中，待使用时取出。</li>
</ol>
4. 准备PDMS微通道以供使用
<ol>
	<li>将通道倒置放置在新的、洁净的透明胶片上。使用尖头镊子以环形运动清洁所有端口（图2b），并清除任何PDMS碎片。</li>
	<li>使用一段包装胶带作为粘尘纸清洁通道。将胶带粘性面朝上贴在实验台表面，然后将通道置于其上。用镊子的圆头按压通道，确保充分接触。取下并重复操作于两侧，直至可见碎屑被清除。</li>
	<li>将清洁并准备好的PDMS通道转移至50 ml锥形管中，加入70%乙醇。涡旋振荡最大速度30秒。弃去乙醇，更换为新鲜的70%乙醇。保存于70%乙醇中，待用时取出。</li>
	<li>在组织培养超净台内，采用无菌技术将PDMS通道转移至洁净无菌的盖玻片或玻璃底培养皿上。将通道面朝上放置，并进行紫外照射，直至乙醇完全挥发。</li>
	<li>干燥后，翻转PDMS使通道面朝向盖玻片向下。将PDMS通道压紧在玻璃表面以形成良好密封。添加一块无菌PDMS覆盖/封闭中心端口（端口B，图2b）。彻底干燥后方可进行后续操作。</li>
	<li>用无菌水中配制的10 µg/ml胶原蛋白预包被通道内表面。包被时，在通道顶部加入100 µl液滴，并通过负压抽吸使其流经通道。37 ˚C孵育1小时后，将含有胶原包被液的通道转移至冰箱，冷藏约15–30分钟。</li>
	<li>用抽吸装置或移液器移除胶原包被液，并开始胶原的制备步骤。</li>
</ol>
5. 微通道中使用的胶原蛋白制备
<ol>
	<li>在冰上，用预冷的100 mM HEPES（溶于2倍PBS，pH 7.4）以1:1比例中和胶原蛋白。充分混匀至溶液均匀（更多细节见第1.1节）。</li>
	<li>用细胞培养基将中和后的胶原蛋白稀释至适当浓度（更多细节见第1.2节）。在冰上孵育15分钟。</li>
	<li>同时，将安装好的通道置于冰上预冷。 
	注意：目标是使通道操作中所有组分的温度保持在4 ˚C或以下。胶原蛋白成核的温度和时间是聚合过程中的关键参数，如有需要，可作为进一步优化的起始条件。</li>
	<li>此时用血细胞计数板对细胞进行计数，并以适当的接种密度重悬细胞。为便于计算，建议将细胞重悬至每毫升含100万至300万个细胞（更多细节亦见第2.1节）。</li>
	<li>细胞计数完成后且已过15分钟，即可进行胶原蛋白浇注操作。</li>
</ol>
6. 制备取向排列与随机分布的胶原微通道
<ol>
	<li>在将胶原蛋白吸入通道之前，使用管路内真空调节器调整并设定真空压力。真空压力提供诱导和控制胶原蛋白流动速率的作用力，从而决定基质的取向程度。
	<ol>
		<li>对于随机或非取向基质，使用宽通道（3 mm 宽 × 200 µm 高），真空压力为 10 mm Hg 或更低。</li>
		<li>对于取向基质，使用窄通道（1 mm 宽 × 200 µm 高），真空压力为 60 mm Hg 或更高。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将安装好的通道从冰上取下，放置于洁净且已消毒的超净工作台表面上。</li>
	<li>迅速操作，将 120–150 µl 中和后的胶原蛋白溶液加入端口 A（图 2b）。</li>
	<li>将连接至真空管路的 25 ml 移液管置于端口 C 上（图 2b），将胶原蛋白吸入通道内。操作时应以单一、均匀的动作完成吸入。重要提示：对于随机或非取向基质，应缓慢地将胶原蛋白沿通道吸入（约 0.5–1 mm/秒），到达通道末端后即停止；对于取向基质，应更快地拉动胶原蛋白，但需注意避免产生气泡。</li>
	<li>使用 p200 移液器或抽吸装置小心移除端口区域多余的胶原蛋白。</li>
	<li>在端口 A 和 C 上放置无菌 PDMS 封片。所有端口此时均应被覆盖。</li>
	<li>2–3 分钟后，移除中央 PDMS 封片（端口 B），向中央端口加入 2–3 μl 细胞悬液（5,000–10,000 个细胞）。室温下静置 10–15 分钟，使其部分聚合（变为不透明）。</li>
	<li>10–15 分钟后，转移至 37 ˚C 继续孵育 15–30 分钟以完成聚合。移除 PDMS 覆盖片，加入培养基完全覆盖通道，并根据需要培养细胞。可通过移除 1 ml 旧培养基并替换为 1 ml 新培养基的方式对细胞进行换液。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

三维胶原凝胶为我们理解细胞如何解读和响应其局部微环境提供了重要的工具。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原基质中的基本实验方案，并可重复地制备出具有随机排列或定向排列胶原纤维的基质。这两种方案均可作为可调节的平台，在聚合过程中可选择性地加入不同类型的胶原亚型、交联剂或其他基质蛋白。此外，该平台也易于改造，可用于评估不同时间点和终点的基因表达与蛋白质生成情况。成像分析、蛋白质和RNA水平检测以及代谢谱读取均能很好地与这些三维技术相兼容。
与所有技术一样，评估凝胶和检测的质量至关重要。高质量胶原凝胶的一个标志是能够耐受人工操作。例如，将1 ml [1 mg/ml]的胶原凝胶倒入六孔板后，应能用镊子轻松夹起并进行操作。如果凝胶出现撕裂或碎裂，则表明其质量不理想，需要采取措施改善胶原蛋白的聚合过程。温度和pH值是实现良好纤维形成和凝胶化的最重要参数。排查问题时，首先应确保所有组分在准备发生凝胶化之前始终保存在冰上。同时，必须确保中和缓冲液与胶原原液充分混合。接下来，需确认中和缓冲液的pH值为7.4。推荐使用HEPES缓冲的PBS，因为它与组织培养高度兼容，具有较宽的缓冲范围，且其储存液在4 ...

许多细胞过程已在二维条件下被广泛研究，从而形成了关于基本细胞信号传导机制的系统性认知。然而，这些研究忽略了细胞从局部细胞微环境及细胞外基质（ECM）的结构与力学特性中所接收到的重要细胞信号。为了更深入地理解细胞在生理环境中的相互作用，有必要在三维（3D）体系中对其进行研究。这些3D实验中的ECM可来源于细胞自身产生，也可由纯化的蛋白质重新构建。无论ECM来源如何，3D基质实验已被证实对于理解细胞如何在生理环境中迁移和相互作用具有不可估量的价值。例如，在3D基质中培养的细胞表现出依赖于周围ECM力学特性的独特运动模式，而这些模式在二维实验中并未观察到4-6。此外，与在玻璃或塑料等坚硬表面培养的细胞相比，在3D环境中培养的细胞具有更少且不明显的应力纤维和黏着斑7。
然而，情境化三维检测的重要性并不仅限于细胞迁移。某些其他细胞信号事件也只能通过三维检测来进行研究。在组织和细胞分化过程中，细胞外环境和细胞外基质（ECM）的刚度可提供影响形态发生事件的信号。例如，乳腺上皮细胞的管状结构形成仅发生在低刚度的三维基质中，而在高刚度基质或二维基底上则无法发生8,9。当在高刚度三维基质中培养时，这些上皮细胞会表现出异常表型，其特征是增殖增加以及由FAK和ERK信号通路改变所驱动的细胞膜突起增多10。已知许多其他信号通路和细胞过程同样受到局部细胞环境刚度的影响，这些信号级联反应凸显了在具有适当局部机械特性的三维ECM背景下研究信号事件和细胞表型的重要性。
I型胶原是一种特别相关的可使用蛋白质 体外 研究中至关重要，因为它是细胞外基质（ECM）中最丰富的成分，决定了细胞微环境的多种力学特性。尽管最初被认为仅是一种结构蛋白，但现已明确其功能远为复杂。胶原纤维的组成、结构、取向、密度和刚度共同构成了一个集中的信号信息微环境。5在某些疾病的发展过程中，如慢性炎症和肿瘤发生，胶原网络会经历显著的重塑。2,11在乳腺癌中，胶原沉积增加和组织硬度升高伴随肿瘤进展，并可能促进其发展。在这些早期肿瘤中，硬化后的胶原网络呈现受力状态且排列更为有序，大多数纤维围绕正在生长的肿瘤形成包被。2随着肿瘤的进展，胶原持续发生重组，纤维网络的某些区域逐渐垂直于肿瘤边界排列。2,12垂直排列作为一种预后生物标志物，提示此类患者无病进展生存期和总体生存率较差1一种对此相关性的解释是，不良预后是由于肿瘤细胞在排列整齐的胶原网络中持续迁移，导致其扩散增加所致。3. 
为了理解细胞如何特异性响应肿瘤进展过程中所观察到的排列与组织结构，有必要制备随机和定向排列的三维胶原基质用于实验。目前有三种基本方法可在纤维网络中诱导胶原纤维的定向排列。第一种技术利用应变诱导装置，通过在两点之间收缩或拉伸胶原以实现定向排列。沿受力轴方向的纤维被拉紧，而垂直于该轴的纤维则被压缩并发生屈曲。尽管应变诱导技术通常能实现优异的定向排列效果，但该方法需要使用体积较大的设备，难以适配多种实验平台3,13。另一种方法是通过在局部接种细胞团块，由细胞自身收缩并牵引胶原纤维实现细胞诱导的应变13。该方法的主要问题是结果变异性较大，因为多种参数可能发生变化。第二种方法是在胶原聚合过程中利用磁性微珠和外加磁场来诱导胶原纤维的定向排列13,14。该方法使用简单设备即可获得良好效果，但需要借助抗体或其他手段使聚合物磁化，因此成本相对较高，且由于网络中连接点增加，可能改变胶原凝胶的刚度。此外，该过程中使用的磁性微珠通常具有自发荧光，会对成像实验造成干扰。最后一种方法是利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道来实现胶原纤维的定向排列3,15,16。该方法通过将正在聚合的胶原溶液流经微小的微流控通道来实现纤维定向。这些微流控通道可设计成多种结构，易于适配各种实验平台。此外，由于其尺寸微小，仅需极少量的胶原和其他试剂，因此成本非常低廉。
本文提供了一种将细胞嵌入三维纤维状胶原蛋白水凝胶中的简单实验方案。此外，还提供了一种更先进的技术，即利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道来控制胶原基质的排列与取向。该方案可轻松适配多种实验平台，能够可重复地生成有序或随机的胶原基质，用于在三维生理微环境中研究细胞迁移、细胞分裂及其他细胞过程。

<table><tbody><tr><td>高浓度大鼠尾胶原蛋白</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒</td><td>Corning</td><td>NC9285739</td><td>用于PDMS通道的弹性体</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310</td><td>用于HEPES中和缓冲液</td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>用于HEPES中和缓冲液</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td>用于HEPES中和缓冲液</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S374</td><td>用于HEPES中和缓冲液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>用于HEPES中和缓冲液</td></tr><tr><td>Levy 改良型 Neubauer 血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>15170-208</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>6孔非组织培养板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P50g-1.5-30-f</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art 塑料真空干燥器</td><td>Bel-Art</td><td>F4200-2021</td><td>PDMS脱气室</td></tr><tr><td>透明胶片&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>pp2950</td><td>用于浇注PDMS通道的塑料薄膜</td></tr><tr><td>ThermoScientific CimaRec</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>HP141925</td><td>用于固化PDMS微通道的加热板</td></tr><tr><td>真空调节器</td><td>Precision Medical</td><td>PM3100</td><td>胶原蛋白微通道用真空调节器</td></tr><tr><td>8&quot; x 8&quot; 橡胶片</td><td>Amazon - Rubber-Cal</td><td>Silicone - 60A</td><td>用于浇注PDMS微通道的橡胶片</td></tr><tr><td>8&quot; x 8&quot; x 0.125&quot; 丙烯酸板</td><td>Amazon</td><td>Plexiglass sheets</td><td>用于浇注PDMS微通道</td></tr><tr><td>10磅重物</td><td>Amazon</td><td>CAP Barbell</td><td>用于浇注PDMS微通道</td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td>Dot Scientific</td><td>229202B, 229206B, and 667225B</td><td>2&amp;nbsp;ml, 5&amp;nbsp;ml, and 25&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher</td><td>NC9663244</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究三维相互作用的3d胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

传统上，大多数细胞过程仅在二维条件下进行研究。尽管这些研究有助于了解一般的细胞信号传导机制，但却忽略了细胞从局部微环境和细胞外基质（ECM）的结构与力学特性中接收到的重要细胞信号。为了理解细胞在生理性的细胞外基质中的相互作用，有必要在三维检测体系中对其进行研究。细胞迁移、细胞分化和细胞增殖等过程均已被证实会受到三维细胞外基质力学性质局部变化的影响。I型胶原是细胞外基质中一种核心的纤维成分，其作用远不止是组织的简单结构组分。在正常条件下，来自胶原网络的力学信号可指导形态发生并维持细胞结构。在疾病状态下的微环境（如肿瘤微环境）中，胶原网络常发生显著重塑，表现为成分改变、沉积增加以及纤维排列结构异常。在乳腺癌中，纤维排列程度具有重要意义，垂直于肿瘤边界的排列纤维增加与患者预后较差相关1。排列有序的胶原基质可通过持续性迁移促进肿瘤细胞的扩散2,3。以下是一个将细胞嵌入三维纤维状胶原水凝胶中的简单实验方案。该方案易于适配多种实验平台，可重复地构建出有序或随机排列的胶原基质，用于在可调控的三维生理微环境中研究细胞迁移、细胞分裂及其他细胞过程。

尽管三维实验可以在相同刚度的胶原凝胶中进行，但通过改变凝胶的刚度可用于确定细胞对其微环境力学变化的响应方式。当嵌入的细胞无法局部收缩周围胶原时，该胶原水凝胶即被定义为刚性凝胶。不同类型细胞的内在收缩力各不相同，因此最好首先建立一条简单的收缩力曲线，以确定细胞感知为顺应性或刚性的胶原浓度。
首先保持细胞数量恒定，逐步增加胶原凝胶的浓度。凝胶的刚度将随浓度呈指数级增长，如先前研究所示。10,20一个收缩力测定实验的代表性示例如下所示 图1此处，将50,000个4T1细胞包埋于2 mg/ml或3.5 mg/ml的胶原凝胶中培养5天。4T1细胞系是一种高收缩性、具有转移能力的癌细胞系，但其仅能使高密度凝胶收缩约10%（图1a，c）。这种低程度收缩对于刚性凝胶分类而言是典型的。类似的低密度凝胶（2 mg/ml， 图1b，c在相同时间范围内收...

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

从历史上看，大多数细胞过程仅在二维条件下进行研究。尽管这些研究为一般的细胞信号传导提供了重要信息……

本实验的总体目标是制备有序和随机的三维胶原基质，用于在三维环境中观察细胞迁移或其他细胞过程。该方法旨在模拟真实组织中存在的胶原结构特征，有助于回答一些关键科学问题，例如细胞识别有序或随机细胞外基质所依赖的分子机制。该技术的主要优势在于，可调控三维环境的结构排列，实现对基质内细胞的成像，且仅需使用常规设备即可低成本地完成实验。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，原因是胶原蛋白溶液与中和缓冲液混合不充分，以及在通过通道吸取胶原蛋白时操作不一致。本次实验操作将由我实验室的高级科学家 Brian Burkel 进行演示。开始时，在加入细胞和培养基之前，应充分混合胶原蛋白溶液与 HEPES 缓冲液，以确保胶原蛋白得到充分中和。然后，将细胞和培养基加入中和后的胶原蛋白混合物中，并按随附的文字实验方案所述置于冰上。用移液器将冰冻的混合物转移至无菌的非组织培养处理表面，以尽量减少细胞在胶原凝胶外部的贴附和生长。使用移液器将溶液均匀铺开。将凝胶在室温下静置约10至15分钟，使其聚合。随后，盖上凝胶，并将其转移至37°C培养箱中，继续孵育45至60分钟以完成聚合。聚合完成后，凝胶将变为不透明状态。聚合完成后，加入两到三毫升培养基。然后用200微升移液器沿孔板边缘绕行一圈，使凝胶从孔壁脱离。轻轻摇晃培养皿，使凝胶从底部表面完全释放。为了制备用于排列胶原基质的PDMS微通道，首先使用其他文献中所述的标准软光刻技术制备SuA硅模板。接着，用一次性搅拌棒在一次性杯子中将20克弹性体基液与2克固化剂充分混合。充分混合后，将一次性杯子放入真空腔中，在550毫米汞柱的真空压力下对PDMS混合物进行脱气处理，脱气时间约为1至1.5小时。在对PDMS脱气的同时，将一张干净的透明薄膜放在加热板上，再将硅模板置于其上，以完成硅母模的准备工作。确保微通道模具朝上。一至一个半小时后，将脱气的PDMS从真空腔中取出。缓慢将PDMS倒入模具中心，使其在重力作用下均匀铺展。接下来，小心地将第二张透明薄膜卷放在硅模板和PDMS之上，以避免产生气泡。轻轻将一张橡胶片置于透明膜上方，随后放上一块1/8英寸厚的亚克力板，然后在亚克力板上放置三块十磅重物中的第一块。最初，第一块重物会处于浮动状态，请待其下沉并稳定后再继续放置剩余的两块重物。 当准备继续操作时，将加热板设置为70摄氏度，使PDMS固化4小时。固化完成后，让PDMS至少再冷却1小时，然后小心剥离晶圆上方的透明薄膜。最后，用镊子取出通道。将通道倒置放在一张新的洁净透明薄膜上，用尖头镊子以打圈动作彻底清洁所有端口。清除任何松动的PDMS碎片。接着，将一片封箱胶带粘性面朝上贴在实验台上，然后将PDMS通道面朝下放置在胶带表面。用镊子的圆形端按压通道，以确保良好接触。取下通道并在两侧重复此操作，直至所有可见碎屑均被清除。然后，将清洁并预处理好的PDMS通道转移至装有70%乙醇的50毫升锥形管中。将通道在最大速度下涡旋振荡30秒，然后用新鲜的70%乙醇替换溶液。采用无菌技术，将PDMS通道面朝上转移至干净且无菌的培养皿中。随后，用紫外光处理通道，直至乙醇完全蒸发。干燥后，将通道翻转并置于盖玻片或玻璃底培养皿上，压紧使其与玻璃表面形成良好密封。添加一块无菌PDMS覆盖并封闭通道的中央部分，待装置充分干燥后再进行后续操作。接着，在通道顶部加入100 µL浓度为10 µg/mL的胶原蛋白溶液液滴，并利用真空负压将其吸入并流经整个通道。将通道在37摄氏度下孵育一小时，然后将仍装有胶原蛋白包被溶液的通道转移至冰箱中。冷藏约15至30分钟，随后使用吸管或移液器从通道中移除胶原蛋白包被溶液。首先中和胶原蛋白溶液，用细胞培养基稀释后置于冰上孵育15分钟。然后，将 120 至 150 微升胶原蛋白溶液加入预冷通道的 A 口。接着，将一支 25 毫升移液管连接至真空管路，并置于 C 口上方，通过一次均匀的动作抽吸混合物，当胶原蛋白溶液到达通道末端时停止。生成随机基质最关键的一步是缓慢地将胶原蛋白抽过通道。如果抽吸过快，会导致通道部分或整个通道内出现更明显的取向排列。仔细去除两端接口区域多余的溶液，然后在A和C两个接口上放置无菌PDMS补片。两到三分钟后，移除覆盖B接口的中央PDMS补片，并向中央接口加入两到三微升细胞，细胞浓度为每毫升一百万至三百万个。让凝胶在室温下部分聚合10至15分钟，随后将构建物转移至37摄氏度培养箱中继续孵育15至30分钟。聚合完成后，移除PDMS端口盖，并加入培养基以完全覆盖通道。此处将50,000个4T1细胞包埋于2 mg/ml或3.5 mg/ml的胶原凝胶中培养5天。4T1细胞系是一种高收缩性的乳腺癌细胞系，但其仅能使高密度凝胶收缩约10%；而在相同时间内，低密度凝胶的收缩程度可达57%。胶原蛋白的排列程度受胶原流动速率调控，较高的胶原流动速率可产生更优的排列。使用较窄的通道并结合较高的真空压力可增强胶原网络的排列，而较宽的通道与较低的真空压力联用则形成随机分布的基质。一旦掌握操作技巧，若操作得当，制备胶原凝胶或通道可在两个半小时内完成。进行此操作时，重要的是要记住在开始之前先完成各组件的准备工作。一旦开始使用胶原蛋白，就需要迅速操作。该技术在建立后，为三维细胞生物学领域的研究人员探索细胞在三维细胞外环境中的黏附、迁移和侵袭行为铺平了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备不同密度的胶原凝胶，以及如何生成随机分布和取向排列的胶原基质。

preparation-3d-collagen-gels-microchannels-for-study-3d-interactions

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

3D胶原凝胶和微通道3D相互作用的研究准备<em&gt;在体内</em

利用含有包埋细胞且表面涂覆内皮细胞的圆柱形胶原凝胶（称为模块）来构建微组织。...

利用含细胞的胶原凝胶模块制备微组织

本文介绍了一种可对胶原蛋白进行荧光标记的方法，该方法可用于3D细胞培养物的固定后成像和活细胞成像。我们还提供了一种优化的实验方案，用于可视化在3D环境中培养的细胞内源性细胞骨架蛋白。...

揭示三维环境中侵袭性癌细胞的细胞骨架组织

细胞外基质的力学性质和微观结构对细胞的三维迁移具有显著影响。 体外...

用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

细胞迁移是人类发育和生命活动的重要组成部分。为了理解可能改变细胞迁移的机制，我们介绍一种平面梯度扩散系统，用于在三维胶原基质中研究趋化性，该系统能够克服现有检测方法中传统扩散室的局限性。...

用于在三维胶原基质中研究趋化性的平面梯度扩散系统

本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。...

在细胞外基质中构建三维上皮组织

本文介绍了一种采用注塑成型的方法来构建具有内皮生理特性的微血管。该基于微流控的技术可生成通畅的三维血管网络，并可调节流动、细胞组成、几何结构和生化梯度等参数。文中描述了该制备工艺及若干潜在应用示例。...

三维微血管的微图形化与组装

本文介绍了一种利用光片显微镜对嵌入三维（3D）胶原基质中的免疫细胞进行可视化观察的实验方案。该方案还详细阐述了如何在三维环境中追踪细胞迁移过程。此方法同样适用于其他类型的悬浮细胞在三维基质中的研究。...

光片显微镜用于人免疫细胞的三维可视化

本文提供了一种在三维基质中分析生长轴突行为的方法，以模拟其自然发育过程。...

生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（&lt;250 µm...

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

本文介绍了一种在三维（3D）细胞外基质中培养 IDG-SW3...

在三维细胞外基质中培养 IDG-SW3 细胞

学习制备定向与随机三维胶原凝胶基质的方法，利用PDMS微通道技术观察细胞迁移行为。该技术可模拟真实组织中的细胞外基质结构，为组织工程研究提供经济高效的实验方案。

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备在体内

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