用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 体内

本实验的总体目标是制备有序和随机的三维胶原基质，用于在三维环境中观察细胞迁移或其他细胞过程。该方法旨在模拟我们在真实组织中发现的胶原结构特征，有助于回答一些关键科学问题，例如细胞识别有序或随机细胞外基质的机制。该技术的主要优势在于，您可以调控三维环境的结构排列，对其中的细胞进行成像，并且可以利用常规设备以较低成本实现这些操作。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，原因是胶原蛋白溶液与中和缓冲液混合不充分，以及在通过通道吸取胶原蛋白时操作不一致。本实验操作将由我实验室的高级科学家 Brian Burkel 进行演示。开始时，在加入细胞和培养基之前，应充分混合胶原蛋白溶液与 HEPES 缓冲液，以确保胶原蛋白得到充分中和。

然后，将细胞和培养基加入中和后的胶原蛋白混合物中，并按随附的文字方案所述将其置于冰上。用移液器将冰冻的混合物加入无菌的非组织培养处理表面，以尽量减少细胞在胶原凝胶外部的贴附和生长。使用移液器将溶液均匀铺开。

将凝胶在室温下静置约10至15分钟，使其聚合。随后，盖上凝胶，并将其转移至37摄氏度的培养箱中，继续孵育45至60分钟，以完成聚合过程。聚合完成后，凝胶将变为不透明状态。

聚合完成后，加入两到三毫升培养基。然后用200微升移液器沿孔板边缘移动，使凝胶从孔壁脱离。轻轻摇晃培养皿，使凝胶从底部表面完全释放。

为了制备用于排列胶原基质的PDMS微通道，首先使用其他文献中描述的标准软光刻技术制备SuA硅模板。接着，用一次性搅拌棒在一次性杯子中将20克弹性体基质与2克固化剂充分混合。

充分混合后，将一次性杯子放入真空腔中，在550毫米汞柱的真空压力下对PDMS混合物进行脱气处理，脱气时间约为1至1.5小时。在对PDMS脱气的同时，将一张干净的透明薄膜放在加热板上，再将硅模板置于其上，以完成硅母模的准备工作。

确保微通道模具朝上。一至一个半小时后，将脱气的PDMS从真空室中取出。缓慢将PDMS倒入模具中心，使其在重力作用下均匀铺展。

接下来，小心地将第二张透明薄膜卷放在硅模板和PDMS之上，以避免产生气泡。轻轻将一张橡胶片置于透明膜上方，随后放上一块1/8英寸厚的亚克力板，然后在亚克力板上放置三块十磅重物中的第一块。最初，第一块重物会处于浮动状态，请待其下沉并稳定后再继续放置剩余的两块重物。

当准备继续操作时，将加热板设置为 70 摄氏度，并将 PDMS 固化四小时。固化完成后，让 PDMS 至少再冷却一小时，然后小心地剥离晶圆顶部的透明薄膜。最后，用镊子移除通道。

将通道倒置放在一张新的洁净透明薄膜上，用尖头镊子以旋转动作清洁所有端口。去除松动的PDMS碎片。接着，将一片封箱胶带粘性面朝上贴在实验台上，然后将PDMS通道面朝下放置在胶带表面。

用镊子的圆形端按压通道，以确保良好接触。取下通道，并在两侧重复此操作，直至所有可见碎屑均被清除。然后，将清洁并预处理好的PDMS通道转移至一个装有70%乙醇的50毫升锥形管中。

将通道在最大速度下涡旋振荡30秒，然后用新鲜的70%乙醇替换溶液。采用无菌技术，将PDMS通道面朝上转移至干净且无菌的培养皿中。随后，用紫外光处理通道，直至乙醇完全蒸发。

干燥后，将通道翻转并置于盖玻片或玻璃底培养皿上，压紧使其与玻璃表面形成良好密封。添加一块无菌PDMS覆盖并封闭通道的中央部分，待装置充分干燥后再进行后续操作。接着，在通道顶部加入100微升浓度为10微克/毫升的胶原蛋白溶液液滴，并利用真空负压将其吸入并流经整个通道。

将通道在37摄氏度下孵育一小时，然后将仍装有胶原蛋白包被溶液的通道转移至冰箱中。冷藏约15至30分钟，随后使用吸管或移液器从通道中移除胶原蛋白包被溶液。首先中和胶原蛋白溶液，用细胞培养基稀释，并在冰上孵育15分钟。

然后，将 120 至 150 微升胶原蛋白溶液加入预冷通道的 A 口。接着，将一支 25 毫升移液管连接至真空管路，并置于 C 口上方，通过一次均匀的动作抽吸混合物，当胶原蛋白溶液到达通道末端时停止。生成随机基质最关键的一步是缓慢地将胶原蛋白抽过通道。

如果抽吸过快，会导致通道部分或整个通道内出现更明显的排列。仔细去除两端接口区域多余的溶液，然后在A和C两个接口上放置无菌的PDMS补片。两到三分钟后，移除覆盖B接口的中央PDMS补片，并向中央接口加入两到三微升细胞，细胞浓度为每毫升一百万至三百万个。让凝胶在室温下部分聚合10至15分钟，随后将构建物转移至37摄氏度培养箱中继续孵育15至30分钟。

聚合完成后，移除PDMS端口盖，并加入培养基以完全覆盖通道。此处将50,000个4T1细胞包埋于2 mg/ml或3.5 mg/ml的胶原凝胶中培养5天。4T1细胞系是一种高收缩性的乳腺癌细胞系，但其仅能使高密度凝胶收缩约10%；而在相同时间内，可使低密度凝胶收缩57%。

胶原蛋白的排列程度受胶原蛋白流动速率的调控，较高的胶原蛋白流速可产生更佳的排列效果。使用更窄的通道并结合较高的真空压力可增强胶原网络的排列性，而使用较宽的通道并结合较低的真空压力则会形成随机分布的基质。一旦掌握操作技巧，若操作得当，制备胶原凝胶或通道可在两个半小时内完成。

进行该操作时，重要的是要记住在开始之前先完成各组件的准备工作。一旦开始使用胶原蛋白，就需要迅速操作。该技术建立后，为三维细胞生物学领域的研究人员探索细胞在三维细胞外环境中的黏附、迁移和侵袭行为铺平了道路。

观看本视频后，您应能充分理解如何制备不同密度的胶原凝胶，以及如何生成随机分布和定向排列的胶原基质。