Name: 形成免疫突触和Kinapse研究的支持平面双层膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 了解利用支持平面双层膜研究免疫突触形成的方法，通过TIRF显微镜可视化细胞黏附蛋白在脂质双层上的锚定过程。该技术有助于深入理解免疫细胞间的分子相互作用机制。

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1. 准备脂质
<ol>
<li>为了将蛋白质连接到双层膜的上层，我们使用 Ni2+ 螯合脂质，以锚定带有聚组氨酸标签的重组蛋白。某些细胞类型可能会非特异性地黏附于 Ni2+ 包被的双层膜，但 T 细胞通常不会，因此该&nbsp;方法是研究 T 细胞活化的理想选择。</li>
<li>通过在玻璃试管中将 20% 的 Ni2+ 螯合脂质和 80% 的磷脂酰胆碱溶于 1–2 ml 氯仿-甲醇中，配制脂质双层溶液。
<ol>
<li>在温水浴（30–37°C）中，用氮气流吹干溶剂，通常需要约 15 分钟。</li>
<li>使用冻干机在高真空条件下除去残留溶剂，持续 90 分钟。</li>
</ol>
</li>
<li>将脂质溶解于含 2% N-辛基-葡萄糖苷去污剂的 Tris-生理盐水缓冲液中，从而&nbsp;形成混合去污剂/磷脂胶束溶液。最终磷脂浓度应为 0.4 mM。为形成脂质体，需将此溶液在 Tris-生理盐水中透析三次以去除去污剂并形成脂质体。我们通常使用约 1 ml 体积，配合截留分子量约为 10 kDa 的 Spectra/Por #2 透析管（直径 6 mm）。夹紧透析管时需注意排除任何气泡s。通常对该溶液进行无菌过滤，并在洁净条件下进行透析，操作时佩戴经 70% 乙醇灭菌的手套。</li>
<li>该溶液应呈透明澄清状，并在氩气环境中储存以防止氧化。若溶液浑浊，则表明已&nbsp;形成多层囊泡，需重新制备。</li>
</ol>
2. 确定有多少 ICAM-1 和 MHC 被沉积在平面双层膜上
<ol>
<li>为了建立实验体系，首先需要确定在给定浓度的可溶性蛋白条件下，有多少 ICAM-1 和 MHC 分子会沉积在特定表面积的 Ni2+ 螯合双层膜上。为此，将双层膜沉积于直径为 5 微米的玻璃小球上，在接近成像所用流动池条件的环境下，将玻璃小球与蛋白溶液共同孵育，然后通过流式免疫荧光测定法检测结合蛋白的密度。</li>
<li>使用每分子标记已知数量荧光素的 FITC 标记抗体来检测表面结合的蛋白。采用荧光素标准微球对流式微荧光仪进行校准。</li>
<li>我们将建立接近抗原呈递细胞条件的实验体系，其中 ICAM-1 的密度为 200 个分子/μm²，I-Ek-MCC91-103 复合物的密度为 0.2–20 个分子/μm²。 </li>
</ol>
3. 清洁用于形成平面双层膜的玻璃盖玻片
<ol>
<li>当脂质体融合到玻璃表面时，会自发形成平面双层膜，但前提是玻璃必须经过适当清洁。</li>
<li>使用Piranha溶液时，我们需穿戴全套防护服，包括耐酸围裙和厚重的耐酸手套。务必小心地将&nbsp;废液与有机废物分开，并妥善处理。</li>
<li>配制酸性Piranha溶液时，将75 ml浓硫酸加入一个干燥的烧杯中，再小心加入25 ml 30%过氧化氢。该溶液会迅速升温至超过100°C。</li>
<li>将干燥的盖玻片浸入溶液中15分钟。取出后，用纯化水每面冲洗约一分钟。使用真空源吸干盖玻片上的纯化水。待Piranha溶液冷却后，倒入专用的Piranha废液容器中，容器应留有松动的瓶盖，并在通风橱内明显标记。当所有脂质体、盖玻片和蛋白质准备就绪后，即可构建免疫突触。 </li>
</ol>
4. 形成双层膜
<ol>
<li>为了形成双层膜，本实验室使用Bioptechs FCSII腔室，其优点在于集成了加热功能。FCSII系统安装在不锈钢基座上，通过夹具将微流控歧管、顶部0.5 mm垫片、一侧涂有氧化铟锡用于加热的微通道载玻片（另一侧带有流体沟槽）、定义流动腔高度的无尘0.25 mm垫片，以及用于形成双层膜的经Piranha溶液清洗的40 mm圆形盖玻片固定在一起。</li>
<li>双层膜形成的盖玻片表面必须高度亲水且洁净，而微通道载玻片则在更疏水的条件下效果更佳。通过在室温下用1% HSA处理60分钟，随后用纯水清洗并彻底干燥（此条件化处理过程以及每次使用之间均需执行），可使微通道载玻片变得更疏水。该过程留下的变性蛋白涂层可使1 μl脂质体悬浮液形成一个圆形、半球状液滴，其高度&gt;0.25 mm。</li>
<li>为组装流动池并形成平面双层膜，先将带有管道朝上的歧管放置于平坦表面上。然后将0.5 mm厚带孔垫片对准流体管放置，并确保其平整贴合。轻轻将微通道载玻片面朝上置于垫片上，注意在确认载玻片上的孔与微流控管道对齐之前，不要施加任何向下的压力。接着将无尘0.25 mm矩形开孔垫片放置在微通道载玻片上方，使通道与流体通道对齐，且无明显气隙。</li>
<li>在微通道载玻片表面以中心间距2.5 mm的模式放置最多5个1 μl脂质体悬浮液滴。这5个脂质体液滴可具有不同组分，但在本实验中仅形成两个双层膜：一个不含Ni2+螯合脂质，另一个含10% Ni2+螯合脂质。</li>
<li>液滴放置完毕后，应一次性小心地将盖玻片整体压下覆盖于表面，并尽快将其夹紧固定。脂质体液滴应与盖玻片接触，且该接触一旦建立即不可中断，因为双层膜很可能已经形成；任何扰动均可能导致双层膜缺陷。</li>
<li>务必记住在微通道载玻片上用少量墨点标记双层膜的位置，以便在显微镜下准确定位盖玻片。静置20分钟以确保系统达到平衡。使用连接约20 cm柔性管和三通阀的20 ml注射器转移所有溶液。将三通阀的另一端通过短段管路连接至流动池，以尽量减少三通阀与流动池之间的死体积。向注射器中注入含2 mM MgCl2、1 mM CaCl2、5 mM葡萄糖和1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐水。</li>
<li>预先排空管路和三通阀中的空气，确保无气泡残留。将装置连接至流动池，并一次性推动5 ml溶液，同时观察确保无气泡经过双层膜区域。此时，双层膜即已制备完成。</li>
</ol>
本视频文章支持《从猎手到采集者再回归：免疫突触与免疫滑突作为变形虫运动主题的变体》一文，作者为 <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">Michael L. Dustin</a>, <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">细胞与发育生物学年度评论</a>第24卷，2008年

用于免疫突触与运动突触研究的支撑性平面双层膜的构建

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

支撑性平面双层膜是用于模拟免疫突触中分子相互作用的有力工具。为模拟淋巴细胞与抗原呈递细胞之间的相互作用，我们利用Ni²⁺-螯合脂质将带有聚组氨酸标签的重组细胞黏附分子和MHC蛋白锚定在双层膜的上层叶。平面双层膜的制备包括脂质准备、处理用于形成双层膜的玻璃表面，并在含有流动池的特制腔室中形成双层膜，随后将淋巴细胞加入流动池。接着，向双层膜中加入Ni²⁺，再引入带有his标签的重组蛋白。最后，将淋巴细胞注入流动池，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）观察免疫突触的形成过程，以及调控T细胞运动、受体分选位点和受体降解位点的机制。

关键词：支撑性平面双层膜，免疫突触，Ni²⁺-螯合脂质，聚组氨酸标签，重组蛋白，全内反射荧光显微镜（TIRF），T细胞运动，受体分选，受体降解

支撑性平面双层膜是用于模拟免疫突触中分子相互作用的有力工具。本文中，我们展示了将已知可调控突触形成的细胞黏附蛋白锚定于脂质双层膜上层，并利用全内反射荧光显微镜（TIRF）观察突触形成的方法。

支撑性平面双层膜是用于模拟免疫突触中分子相互作用的有力工具。为模拟这些相互作用……

大家好，我是来自格拉尔研究所和纽约大学医学院的 Mike Dustin。今天我将为大家演示如何制备用于免疫突触研究的支撑性平面生物膜。现在我们开始吧。为了制备脂质双层，我们在玻璃试管中配制含有20%镍螯合脂质和80%磷脂酰胆碱的溶液，溶剂为一到两毫升的氯仿-甲醇混合液。第一步是在30至37摄氏度的温水浴中，用氮气流吹干溶剂。该过程通常需要约15分钟。然后使用冷冻干燥机在高真空条件下除去残留溶剂，持续90分钟。接着，将脂质溶解于2% N-辛基葡萄糖苷去垢剂溶解的生理盐水缓冲液中，终浓度为0.4毫摩尔。由此形成含有混合去垢剂与磷脂胶束的溶液，以制备脂质体。将此溶液在三份Tris盐溶液中透析，以去除去垢剂并形成脂质体。我们通常处理的体积约为1毫升，使用直径为6毫米、截留分子量约为10千道尔顿的透析管，并在夹紧透析管时注意排除任何气泡。对该溶液进行无菌过滤，并在洁净条件下进行透析，操作时使用70%乙醇消毒的手套。该溶液应为澄清透明，并在氩气环境中保存以防止氧化。如果溶液浑浊，则说明已形成多层囊泡，需要重新制备。为了开展实验，我们首先需要确定在特定浓度的可溶性蛋白条件下，有多少ICAM-1和MHC被沉积到给定表面积的镍螯合双层膜上。为此，我们将双层结构沉积在直径为五微米的玻璃小球表面。在接近成像所用流动池条件的情况下，将玻璃微珠与蛋白质溶液共同孵育，然后通过流动免疫荧光定量分析法读取结合蛋白的密度。使用每分子标记有已知数量荧光素的FSI标记抗体来检测表面结合的蛋白质，并利用荧光素标准微珠对流动微荧光计进行校准。我们将建立接近抗原呈递细胞表面条件的环境，其中 ICAM-1 的密度为每平方微米 200 个分子，I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 的密度为每平方微米 0.2 至 20 个分子。当脂质体与玻璃融合时，会自发形成复合平面双层膜，但前提是玻璃表面必须经过适当清洁。我们使用酸性 Piranha 溶液（即新配制的浓硫酸与 30% 过氧化氢的混合液），该溶液可彻底破坏所有有机物质，并使玻璃表面具有极强的亲水性。使用piranha溶液时，我们需穿戴全套防护服，包括防酸围裙和厚重的耐酸手套。废液必须与有机废物严格分开，并妥善处理。配制酸性piranha溶液时，先将75毫升浓硫酸加入一个干燥的烧杯中，然后小心加入25毫升30%的过氧化氢。溶液会迅速加热至超过100摄氏度，然后将干燥的盖玻片浸入该溶液中15分钟。在Piranha溶液中孵育后，将盖玻片浸入纯水中，随后每面各冲洗一分钟。接着使用真空源干燥盖玻片，以去除纯水。让洗液冷却后倒入洗液废液容器中，容器盖子保持松动，并在通风橱内明确标记，用于形成双层膜。我们实验室使用双通道FCS腔室，其优点在于具有集成加热功能。FCS two系统安装在不锈钢基座上，通过夹具将微流控歧管与一个0.5毫米厚的顶部垫片、以及一面涂有氧化铟锡用于加热、另一面带有流体沟槽的微流道载玻片固定在一起。使用无尘的0.25毫米垫片来确定流动池的高度，并使用经piranha溶液清洗过的40毫米圆形盖玻片来组装流动池并形成平面双层膜，其中双层膜在该盖玻片上形成。将带有管路朝上的歧管放置在平坦表面上。然后将带有孔的0.5毫米垫片放置在流体管路上方，确保其孔对准管路，并保证垫片平整就位。将微流控载玻片轻轻放置，使流体通道朝上，并确保其平放，不要施加任何向下的压力，直到确认载玻片上的孔与微流控管对齐。然后将无尘的0.25毫米厚垫片（带矩形切口）放置在微流控载玻片上方，使通道与流体通道对齐，且无明显气隙。在微流控载玻片表面以中心间距为2.5毫米的模式滴加最多五个1微升的脂质体悬液液滴。这五个脂质体液滴的组成可以不同，但在本实验中仅形成两个双层膜：一个不含镍螯合脂质，另一个含10%镍螯合脂质。一旦这些液滴到位，应小心地一次性将盖玻片平放于表面，并尽快将其夹紧固定在基座上。脂质体液滴应与盖玻片接触。此接触不得中断，因为双层膜很可能已经形成，任何扰动都可能导致双层膜结构缺陷。此时，重要的是要记住在载玻片上用几个小墨点标记双层膜的位置，以帮助在显微镜下准确定位盖玻片。等待20分钟，确保系统已达到平衡。使用连接了约20厘米长柔性管和三通阀的20毫升注射器转移所有溶液。三通阀的另一个接口通过一段短管连接到流动池，以尽量减少三通阀与流动池之间的死体积。用含有氯化镁、氯化钙、葡萄糖和人血清白蛋白的heis缓冲盐水填充注射器。对管路和旋塞进行预充，确保无气泡。然后将其连接至流动池，一次性推动5 mL液体通过，同时观察以确保无气泡经过双层膜。现在，您已制备好双层膜，可用于将带有组氨酸标签的蛋白质引入双层膜中。首先必须用酪蛋白封闭并用镍离子活化。用一毫升注射器吸取酪蛋白-镍离子溶液，并连接至侧端口，注意避免产生气泡。注入溶液后，等待20分钟以确保完全封闭。然后用20毫升注射器中的H-B-S-H-S-A洗去封闭溶液。现在注入含有polyhis标记的ICAM-1和IEK的0.5毫升H-B-S-H-S-A溶液。在本实验中，ICAM-1 用 SCI-5 进行标记。因此，可通过成像双层膜中 ICAM-1 的重排来追踪 LFA-1 与 ICAM-1 的相互作用。让蛋白结合至带镍的双层膜，孵育 30 分钟。在蛋白黏附至双层膜的同时，使用定制的载物台插件将流动池固定在倒置显微镜上。然后连接加热电子设备，使系统在 37 摄氏度下达到平衡。利用先前做的标记来定位流动池，使物镜与其中一个双层膜对齐，并使用干涉反射显微镜通过聚焦视场光阑的反射光图像来确定焦平面。最后，用缓冲液冲洗流动池以去除未结合的 ICAM-1。在 ICAM-1 通道中，以草坪模式（turf M）和宽场模式采集双层膜的荧光图像，以确认 ICAM-1 在镍涂层双层膜上相对于无镍双层膜的结合情况。此时，流动池已准备好用于接收细胞。在此演示中，我们将使用一种ND T细胞受体转基因T细胞，该细胞已通过逆转录病毒转导表达ENC包被的GFPs P zap 70。首先用H-B-S-H-S-A缓冲液洗涤细胞一次，然后将细胞与Alexa 568标记的T细胞受体FAB片段共同孵育，以便追踪TCR微簇的形成。孵育15分钟后，将细胞按1:10比例稀释。此稀释程度可使H57抗体浓度降至不影响turf M成像的水平，同时由于初始结合的FAB片段会逐渐解离，该稀释比例仍可维持T细胞受体的饱和状态，随后将细胞注入流动池中。我们以三色草坪M模式对免疫突触进行成像。这包括LFA-1与ICAM-1相互作用的形成、TCR簇的形成以及中心突触（C smac）的形成，以及持续形成的TCR微簇，后者可招募GFP标记的ZAP-70。其中部分结果在采集过程中即可明显观察到，而其他结果则需要经过后期处理分析才能充分理解。好的，我们刚刚向您展示了如何利用支持性平面双层膜来研究免疫突触。这些实验能否成功，关键在于T细胞必须处于良好的状态，且PPS缓冲盐溶液不适合长期培养T细胞。因此，您需要将细胞从培养环境中取出，放入该培养基中，并尽快使用。如果需要进行较长时间的实验，可以使用一些优质的无血清培养基配方来替代Hank's平衡盐溶液。这样可以在需要检测较长时间终点指标（如细胞因子产生或T细胞增殖）时，使细胞存活更久。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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