用于免疫突触与运动突触研究的支撑性平面双层膜的构建

大家好，我是来自格拉尔研究所和纽约大学医学院的 Mike Dustin。今天我将为大家演示如何制备用于免疫突触研究的支撑性平面生物膜。现在我们开始吧。

为了制备脂质双层，我们在玻璃试管中配制含有20%镍螯合脂质和80%磷脂酰胆碱的溶液，溶剂为一到两毫升的氯仿-甲醇混合液。第一步是在30至37摄氏度的温水浴中，用氮气流吹干溶剂。该过程通常需要约15分钟。

然后使用冷冻干燥机在高真空条件下除去残留溶剂，持续90分钟。接着，将脂质溶解于2% N-辛基葡萄糖苷去垢剂溶解的生理盐水缓冲液中，终浓度为0.4毫摩尔。由此形成含有混合去垢剂与磷脂胶束的溶液，以制备脂质体。

将此溶液在三份Tris盐溶液中透析，以去除去垢剂并形成脂质体。我们通常处理的体积约为1毫升，使用直径为6毫米、截留分子量约为10千道尔顿的透析管，并在夹紧透析管时注意排除任何气泡。对该溶液进行无菌过滤，并在洁净条件下进行透析，操作时使用70%乙醇消毒的手套。

该溶液应为澄清透明，并在氩气环境中保存以防止氧化。如果溶液浑浊，则说明已形成多层囊泡，需要重新制备。为了开展实验，我们首先需要确定在特定浓度的可溶性蛋白条件下，有多少ICAM-1和MHC被沉积到给定表面积的镍螯合双层膜上。

为此，我们将双层结构沉积在直径为五微米的玻璃小球表面。在接近成像所用流动池条件的情况下，将玻璃微珠与蛋白质溶液共同孵育，然后通过流动免疫荧光定量分析法读取结合蛋白的密度。使用每分子标记有已知数量荧光素的FSI标记抗体来检测表面结合的蛋白质，并利用荧光素标准微珠对流动微荧光计进行校准。

我们将建立接近抗原呈递细胞表面条件的环境，其中 ICAM-1 的密度为每平方微米 200 个分子，I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 的密度为每平方微米 0.2 至 20 个分子。当脂质体与玻璃融合时，会自发形成复合平面双层膜，但前提是玻璃表面必须经过适当清洁。我们使用酸性 Piranha 溶液（即新配制的浓硫酸与 30% 过氧化氢的混合液），该溶液可彻底破坏所有有机物质，并使玻璃表面具有极强的亲水性。

使用piranha溶液时，我们需穿戴全套防护服，包括防酸围裙和厚重的耐酸手套。废液必须与有机废物严格分开，并妥善处理。配制酸性piranha溶液时，先将75毫升浓硫酸加入一个干燥的烧杯中，然后小心加入25毫升30%的过氧化氢。

溶液会迅速加热至超过100摄氏度，然后将干燥的盖玻片浸入该溶液中15分钟。在Piranha溶液中孵育后，将盖玻片浸入纯水中，随后每面各冲洗一分钟。接着使用真空源干燥盖玻片，以去除纯水。

让洗液冷却后倒入洗液废液容器中，容器盖子保持松动，并在通风橱内明确标记，用于形成双层膜。我们实验室使用双通道FCS腔室，其优点在于具有集成加热功能。FCS two系统安装在不锈钢基座上，通过夹具将微流控歧管与一个0.5毫米厚的顶部垫片、以及一面涂有氧化铟锡用于加热、另一面带有流体沟槽的微流道载玻片固定在一起。

使用无尘的0.25毫米垫片来确定流动池的高度，并使用经piranha溶液清洗过的40毫米圆形盖玻片来组装流动池并形成平面双层膜，其中双层膜在该盖玻片上形成。将带有管路朝上的歧管放置在平坦表面上。然后将带有孔的0.5毫米垫片放置在流体管路上方，确保其孔对准管路，并保证垫片平整就位。

将微流控载玻片轻轻放置，使流体通道朝上，并确保其平放，不要施加任何向下的压力，直到确认载玻片上的孔与微流控管对齐。然后将无尘的0.25毫米厚垫片（带矩形切口）放置在微流控载玻片上方，使通道与流体通道对齐，且无明显气隙。在微流控载玻片表面以中心间距为2.5毫米的模式滴加最多五个1微升的脂质体悬液液滴。这五个脂质体液滴的组成可以不同，但在本实验中仅形成两个双层膜：一个不含镍螯合脂质，另一个含10%镍螯合脂质。

一旦这些液滴到位，应小心地一次性将盖玻片平放于表面，并尽快将其夹紧固定在基座上。脂质体液滴应与盖玻片接触。此接触不得中断，因为双层膜很可能已经形成，任何扰动都可能导致双层膜结构缺陷。

此时，重要的是要记住在载玻片上用几个小墨点标记双层膜的位置，以帮助在显微镜下准确定位盖玻片。等待20分钟，确保系统已达到平衡。使用连接了约20厘米长柔性管和三通阀的20毫升注射器转移所有溶液。三通阀的另一个接口通过一段短管连接到流动池，以尽量减少三通阀与流动池之间的死体积。

用含有氯化镁、氯化钙、葡萄糖和人血清白蛋白的heis缓冲盐水填充注射器。对管路和旋塞进行预充，确保无气泡。然后将其连接至流动池，一次性推动5 mL液体通过，同时观察以确保无气泡经过双层膜。

现在，您已制备好双层膜，可用于将带有组氨酸标签的蛋白质引入双层膜中。首先必须用酪蛋白封闭并用镍离子活化。用一毫升注射器吸取酪蛋白-镍离子溶液，并连接至侧端口，注意避免产生气泡。

注入溶液后，等待20分钟以确保完全封闭。然后用20毫升注射器中的H-B-S-H-S-A洗去封闭溶液。现在注入含有polyhis标记的ICAM-1和IEK的0.5毫升H-B-S-H-S-A溶液。

在本实验中，ICAM-1 用 SCI-5 进行标记。因此，可通过成像双层膜中 ICAM-1 的重排来追踪 LFA-1 与 ICAM-1 的相互作用。让蛋白结合至带镍的双层膜，孵育 30 分钟。在蛋白黏附至双层膜的同时，使用定制的载物台插件将流动池固定在倒置显微镜上。

然后连接加热电子设备，使系统在 37 摄氏度下达到平衡。利用先前做的标记来定位流动池，使物镜与其中一个双层膜对齐，并使用干涉反射显微镜通过聚焦视场光阑的反射光图像来确定焦平面。最后，用缓冲液冲洗流动池以去除未结合的 ICAM-1。

在 ICAM-1 通道中，以草坪模式（turf M）和宽场模式采集双层膜的荧光图像，以确认 ICAM-1 在镍涂层双层膜上相对于无镍双层膜的结合情况。此时，流动池已准备好用于接收细胞。

在此演示中，我们将使用一种ND T细胞受体转基因T细胞，该细胞已通过逆转录病毒转导表达ENC包被的GFPs P zap 70。首先用H-B-S-H-S-A缓冲液洗涤细胞一次，然后将细胞与Alexa 568标记的T细胞受体FAB片段共同孵育，以便追踪TCR微簇的形成。孵育15分钟后，将细胞按1:10比例稀释。此稀释程度可使H57抗体浓度降至不影响turf M成像的水平，同时由于初始结合的FAB片段会逐渐解离，该稀释比例仍可维持T细胞受体的饱和状态，随后将细胞注入流动池中。

我们以三色草坪M模式对免疫突触进行成像。这包括LFA-1与ICAM-1相互作用的形成、TCR簇的形成以及中心突触（C smac）的形成，以及持续形成的TCR微簇，后者可招募GFP标记的ZAP-70。其中部分结果在采集过程中即可明显观察到，而其他结果则需要经过后期处理分析才能充分理解。

好的，我们刚刚向您展示了如何利用支持性平面双层膜来研究免疫突触。这些实验能否成功，关键在于T细胞必须处于良好的状态，且PPS缓冲盐溶液不适合长期培养T细胞。因此，您需要将细胞从培养环境中取出，放入该培养基中，并尽快使用。

如果需要进行较长时间的实验，可以使用一些优质的无血清培养基配方来替代Hank's平衡盐溶液。这样可以在需要检测较长时间终点指标（如细胞因子产生或T细胞增殖）时，使细胞存活更久。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。