形成免疫突触和Kinapse研究的支持平面双层膜

大家好，我是来自 Geral Institute 和纽约大学医学院的 Mike Dustin。今天，我将带您完成形成支持性平面 Biolay 以研究免疫突触的程序。那么让我们开始吧。

为了制备脂质双层，我们在玻璃管中制备适量的 20% 镍、螯合脂质和 80% 磷脂酰胆碱的溶液，加入 1 至 2 毫升氯仿甲醇。第一步是在 30 至 37 摄氏度的温暖水浴中，在氮气流下蒸发溶剂。这通常需要大约 15 分钟。

然后使用冻干机在高真空下去除所有残留的溶剂 90 分钟。接下来，将脂质溶解在 2%N 八方杀葡萄糖剂去污剂相关盐水缓冲液中，至终浓度为 0.4 毫摩尔。这会产生混合洗涤剂磷脂 mycells 的溶液以形成脂质体。

您将该溶液与三种 tri 盐水进行透析，以去除去污剂并形成脂质体。我们通常使用直径为 6 毫米的管材，使用直径为 1 毫米的管材，截止值约为 10 道尔顿，并且在夹紧管材时小心排除任何气泡。我们对这种溶液进行无菌过滤，并在清洁条件下进行透析，并使用 70% 乙醇消毒手套处理。

该溶液应晶莹剔透，并储存在氩气下以防止氧化。如果溶液浑浊，那么您已经产生了多壁囊泡，需要重新开始。为了进行实验，我们需要首先确定在给定浓度的可溶性蛋白下，在镍螯合双层的给定表面积上沉积了多少 ICAM one 和 MHC。

为此，我们以 5 微米直径的玻璃速度沉积双层玻璃。在与用于成像的流动池中的条件下相似的条件下，将玻璃珠与蛋白质溶液一起孵育，然后通过流式免疫荧光测定法读出结合蛋白质的密度。使用每个分子具有已知荧光素数量的 FSI 标记抗体来检测表面结合蛋白，荧光素标准珠用于校准流式微量荧光计。

我们将建立与抗原呈递细胞上的条件相似的条件，每平方微米 200 个分子的 ICAM 1 和每平方 0.2 至 20 个分子。I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 的千分尺，当脂质体与玻璃融合时，会自发形成复杂的平面双层，但前提是要正确清洁以清洁玻璃。我们使用酸性 piana 溶液，这是一种新鲜制备的硫酸和 30% 过氧化氢的混合物，它会破坏所有有机材料，并使玻璃表面非常亲水。

在与食人鱼一起工作时，我们穿着全套防护服，包括防酸围裙和厚重的耐酸手套。废物需要与有机废物仔细分离并妥善处理。要制备酸性食人鱼溶液，请将 75 毫升浓硫酸加入干燥烧杯中，然后小心加入 25 毫升 30% 过氧化氢。

溶液迅速加热至 100 摄氏度以上，然后将干燥的盖玻片浸入溶液中 15 分钟。在食人鱼中孵育后，将盖玻片浸入纯净水中，然后在每面冲洗一分钟。然后使用真空源擦干盖玻片，以排出纯净水。

让食人鱼溶液冷却并添加到食人鱼废物容器中，该容器的盖子松散，在通风橱中标记清楚以形成双层。我们的实验室使用 bi FCS 两个腔室，具有集成加热的优势。FCS two 系统位于不锈钢底座上，该底座将带有 0.5 毫米顶部垫圈的微流体歧管、一个涂有氧化铟锡的微型渡槽滑块夹紧在一起，用于在另一侧进行流体凹槽加热。

一个无尘的 0.25 毫米垫圈，定义了流动室的高度和食人鱼清洁的 40 毫米圆形盖玻片，在其上形成双层以组装流通池并形成平面双层。将歧管朝上放置在平坦的表面上。然后将 0.5 毫米的垫圈放在流体管上，并在流体管上打孔，并确保其平放。

轻轻地放置微导水管载玻片，使流体通道朝上，并确保其平放，不要施加任何向下的压力，直到验证载玻片上的孔与微流体管对齐。然后将带有矩形切口的无尘 0.25 毫米垫圈铺设在微导槽载玻片的顶部，使通道与流体通道对齐，并且没有主要的空气空间，在微导槽载玻片的表面放置多达五滴 1 微升脂质体悬浮液，以使每滴之间的中心到中心距离为 2.5 毫米。这五种脂质体滴剂可能具有不同的成分，但在这种情况下，我们只会形成两个双层，一个没有镍螯合脂质，一个具有 10% 镍螯合脂质。

一旦这些液滴就位，小心地将盖玻片放在表面上，以一个动作，尽快夹在底座上。脂质体滴剂应与盖玻片接触。这种接触不应该被打破，因为双层可能已经形成，任何破坏都可能导致双层有缺陷。

此时，重要的是要记住在载玻片上用一些小墨水点标记双层的位置，以帮助在显微镜上定位盖玻片。等待 20 分钟，确保系统平衡转移所有溶液，使用连接到约 20 厘米软管的 20 毫升注射器和三通旋塞。然后，通过一小段管路将旋塞阀的另一个端口连接到流通池，以最大限度地减少旋塞阀和流通池之间的死体积。

在注射器中加入含有氯化镁、氯化钙、葡萄糖和人血清白蛋白的 heis 缓冲盐水。灌注管路和旋塞，以免产生气泡。然后将其连接到流动池，一次推入 5 mL，同时观察以确保没有气泡通过双层。

现在，您将拥有将 hiss 标记的蛋白质引入双层。它必须首先用酪蛋白封闭并用镍充电。用酪蛋白镍离子溶液填充 1 毫升注射器，并将其连接到侧端口，而不会捕获任何气泡。

注射溶液后，等待 20 分钟以完全封闭。然后用 H-B-S-H-S-A 从 20 毫升注射器中洗出封闭溶液。现在注入 0.5 毫升含有多元组离子标记的 ICAM one 和 IEK 的 H-B-S-H-S-A 溶液。

在这个实验中，ICAM one 用 SCI 5 标记。因此，LFA one ICAM one 相互作用之后可以通过对双层中的 ICAM one 重排进行成像，让蛋白质在蛋白质粘附在双层上时结合带镍电荷的双层 30 分钟。使用定制的载物台插件将流通池固定到倒置显微镜上。

然后连接加热电子元件，使系统在 37 摄氏度时达到平衡。使用之前所做的标记定位流通池，使物镜与其中一个双层对齐，并使用干涉反射显微镜通过聚焦场光阑的反射光图像来定位焦平面。最后，从流动槽中洗出未结合的 ICAM 一。

在 Turf M 和宽场模式下获取 ICAM 单通道中双层的荧光图像。这是为了确认 ICAM one 相对于无镍双层在镀镍双层上的结合。流通池现在已准备好接收细胞。

为了进行本演示，我们将使用已用逆转录病毒 ENC 涂层 GFPs P zap 70 转导的 ND T 细胞受体转基因 T 细胞，用 H-B-S-H-S-A 洗涤细胞一次，然后将细胞与 Alexa 5 68 标记的 FAB 孵育到 T 细胞受体，以便我们可以跟踪 TCR 微簇。15 分钟后，将细胞稀释 1 至 10。这样可以充分稀释 H 57 抗体，使其不会干扰草坪 M 成像，但在最初结合的 fab 开始解离时保持 T 细胞受体的饱和度，然后将其注射到流动池中。

我们以三色草坪 M 模式对免疫突触进行成像。这包括 LFA one、ICAM one 相互作用的形成、TCR 簇和 C smac 的形成以及 TCR 微簇的持续形成，这些微簇招募了 GFP ZAP 70。其中一些结果在采集过程中很明显，而另一些则需要后处理分析才能充分理解。

好的，我们刚刚向您展示了如何使用支持的平面双层来研究免疫突触。这些实验要有效，T 细胞处于非常好的状态非常重要，而 PPS 缓冲盐水溶液不太适合长期 T 细胞培养。所以你想把细胞从培养物中取出，把它们放到这种培养基中，然后非常快速地使用它们。

如果您发现自己想进行长期实验，有一些非常好的无血清培养基配方可以替代 he 片缓冲盐水。如果您想进行更长的终末终点，例如细胞因子的产生或 T 细胞的增殖，这将使细胞存活更长时间。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。