通过与内体裂解试剂dfTAT共孵育将蛋白质、多肽或细胞不可渗透的小分子递送至活细胞

以下实验的总体目标是利用二聚体荧光 tat 或 df tat 这种能够高效穿透细胞且不损伤细胞的试剂，将大分子递送至活细胞内。该目标通过两个步骤实现：第一步是生成并纯化递送试剂 dfta。

Dfta 在 37 摄氏度下与细胞共孵育一小时，同时存在目标大分子货物，df tat 可诱导该货物被内吞进入内吞囊泡。这些囊泡逐渐成熟为早期内体，最终发展为晚期内体，在此阶段 DF tat 能够将货物释放至细胞的胞质空间。随后，通过荧光显微镜对细胞成像，以评估 detta 及目标货物的递送效率。

结果显示，DF TT 能够以高效率进入细胞，且无明显细胞毒性。DF tat 可将不同大小的生物大分子递送至细胞的胞质空间，这一点可通过荧光显微镜观察到。与现有的固体递送方法相比，该技术的主要优势在于递送试剂具有高效的递送能力，且对细胞生理状态无明显不良影响。此外，该方法操作简便，仅需简单的共孵育步骤即可完成。

首先，在标准的50毫升SPPS反应容器中，将500毫克R酰胺MBHA树脂溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，室温下溶胀1小时，通入适量氮气使反应液轻微鼓泡。使用文中方案所列的每种FM保护氨基酸1.2毫摩尔，在Rink酰胺MBHA树脂上合成FTA，进行每步氨基酸偶联反应。每次偶联同时加入0.44克HBTU和0.51毫升DIEA（溶于DMF中），每步氨基酸偶联反应持续4小时。完成4小时偶联后，继续后续操作。

用DMF洗涤树脂，并按照文本方案中所述进行FD保护步骤。重复操作，直至合成FTA的线性肽链。接下来，将树脂与20毫升由1%三氟乙酸（TFA）和2%三异丙基硅烷（TIS）溶于二氯甲烷（DCM）组成的溶液孵育5分钟，以裂解MTT保护基团。

由于去除MTT保护基团会导致黄色出现，因此需重复操作直至用DCM和DMF洗涤树脂时不再观察到黄色。向树脂中加入含1% TFA的DCM溶液，以确保无MTT被去除，且溶液保持澄清。

接下来，将T-M-R-H-B-T-U和DIEA溶解于DMF中，并将此混合物加入树脂。在干燥氮气搅拌下，过夜进行反应，完成fmoc保护及氨基酸偶联。用DCM洗涤树脂，并使其干燥，以实现肽链从树脂的完全裂解。

向肽树脂中加入含有92.5% TFA、2.5%水、2.5% TIS和2.5%乙二硫醇的溶液，在室温下反应三小时，以实现全局脱保护并使肽链从树脂上裂解。将制备好的溶液倒入40毫升无水乙醚中，通过冷无水乙醚沉淀粗肽产物。在4°C、4,000 G条件下离心20至25分钟。

重复此步骤，用冷的无水乙醚洗涤沉淀物。将沉淀物悬浮于水中，冻干，然后将所得产物重新悬浮于0.1%的水相三氟乙酸（TFA）ACEDONITE试验溶液中。使用分析型C18柱进行高效液相色谱（HPLC）分析。

分析每种肽时，使用每分钟1毫升的流速，并在214纳米和550纳米处进行检测。接下来，在C 18柱上进行半制备型高效液相色谱（HPLC）以纯化肽。所有运行均使用每分钟4毫升的流速，并在214纳米和550纳米处进行检测。

在进行氧化反应前使用线性梯度。根据制造商的说明书，通过MALDI确认肽段的正确身份。将FTA溶解于通入空气的磷酸盐缓冲液中。

确保 pH 值在 7.0 至 7.5 之间。加入肽后，将反应液在室温下孵育过夜，使其反应完全。使用反相高效液相色谱法（reverse phase HPLC）纯化产物，并如前所述通过质谱分析进行检测。将纯化的 DF tat 冷冻干燥后重悬于 200 微升水中，测定其浓度。

首先，将一份纯化的 DF tat 样品悬浮于 149 微升的 50 毫摩尔 TCEP 溶液中，使样品反应约 20 分钟。在此步骤中，DF tat 被还原为其单体形式 F tat，以消除因 TMR 荧光基团与 DF tat 靠近而引起的吸光度猝灭现象。将所有溶液加入石英比色皿中，并在 556 纳米处测定吸光度。

利用比尔定律，确定溶液的浓度。该浓度对应于 FTA 的浓度。

将 FTA 的浓度除以二，得到 dfta 的浓度。在含 5% CO2 的 37 °C 恒温湿润环境中，使用适当的培养基培养细胞至 80% 至 90% 汇合度，用 200 µL PBS 洗涤细胞三次，并用 NRL 15 洗涤一次。将细胞与五 µM df tat（可选携带货物，如增强型绿色荧光蛋白）在 37 °C 孵育一小时，以诱导内体泄漏。

用含肝素的 L-15 培养基洗涤细胞三次，以去除结合在细胞质膜上的 DF tat。最后一步是使用荧光显微镜，通过红色荧光蛋白（RFP）滤光片观察 DF tat，以评估 F TAT 与 D ftt 之间的差异。将 HeLa 细胞与每种肽段共同孵育，以确定其在细胞内定位的差异。

如图所示，FTA 呈点状分布，这种分布模式与肽段滞留在内体内部的现象一致。相比之下，dfta 的荧光信号在细胞质和细胞核中均呈均匀分布。

在多种不同的细胞系中均观察到DF tat的胞质分布。20倍图像显示，培养皿中绝大多数细胞呈现DF tat的胞质分布，且未见细胞毒性，这通过无Cyt Blue细胞核染色得以证实。该实验旨在确定dfta介导的内体泄漏是否可将大分子蛋白质递送至细胞胞质中。采用EGFP检测正确折叠蛋白质的递送情况。

EGFP 显示出胞质和细胞核内的绿色荧光分布，与在超过90%的细胞中观察到的 DF tat 分布相似，且无明显毒性。在进行该操作时，需注意细胞不应过度融合。此外，在加入 df tap 前，应充分洗涤细胞以去除 FPS。