Name: 交货蛋白质，多肽或细胞不可渗透的小分子进入活细胞被孵化与核内体溶解试剂dfTAT (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习使用dfTAT试剂将蛋白质、多肽及细胞不可渗透的小分子高效递送至活细胞的方法。该技术通过核内体溶解机制实现胞质释放，适用于细胞生物学与神经科学研究。

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本文由美国普通医学科学研究所资助项目 R01GM087227、诺曼·阿克曼高级研究计划以及罗伯特·A·韦尔奇基金会（资助号 A-1769）支持。

1. SPPS：CK(TMR)TATG（fTAT）的合成
注意：dfTAT 的制备分为两步：首先通过固相肽合成法合成单体 fTAT，随后通过二硫键偶联形成二聚体 dfTAT。
<ol>
	<li>在标准50 ml固相肽合成反应器中，将500 mg Rink Amide MBHA树脂用二甲基甲酰胺（DMF）溶胀1小时。</li>
	<li>将Fmoc保护的树脂置于20%哌啶溶液（20%哌啶/DMF，10 ml（0.30 mmol））中孵育，进行Fmoc脱保护。脱保护步骤重复两次（第一次5分钟，第二次15分钟），每次之间用DMF洗涤（洗涤步骤包括用总共约150 ml DMF多次冲洗树脂，并通过减压过滤除去溶剂）。</li>
	<li>在Rink酰胺MBHA树脂上合成CK(TMR)RKKRRQRRRG（fTAT）。使用以下Fmoc保护的氨基酸：Fmoc-Lys(Mtt)-OH（仅用于N端）、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。采用N进行反应2 （20 PSI）以搅动反应。所有反应均在室温下进行。
	<ol>
		<li>每个氨基酸偶联反应进行4小时。每次偶联使用Fmoc保护的氨基酸（1.2 mmol）， N,N,N ′ ，N ′ 四甲基- O- (1 H 六氟磷酸苯并三氮唑-1-基氧基三（二甲氨基）磷（HBTU）（0.44 g，1.1 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（DIEA）（0.51 ml，3.0 mmol）溶于DMF中。在偶联反应4小时后，用DMF洗涤树脂，并按照步骤1.2所述进行Fmoc脱保护。</li>
		<li>重复上述步骤，直至合成fTAT的线性肽链（线性肽链序列：CKRKKRRQRRRG，不含TMR）。</li>
		<li>然后依次用 DMF 和二氯甲烷（DCM）彻底清洗树脂。用 DMF 或 DCM 分多次冲洗树脂，总体积约为 150 ml，然后通过真空抽滤去除溶剂。</li>
		<li>使用 MALDI-TOF 质谱确认所获得的肽段具有正确的分子量。
		<ol>
			<li>将1 mg基质加入由50 µl含0.01%三氟乙酸的水溶液和50 µl乙腈组成的溶液中，配制基质混合液。</li>
			<li>为确认线性肽链质量，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸。对粗肽进行分析型高效液相色谱（HPLC），从纯品峰顶收集50 µl。</li>
			<li>准备用于点样至MALDI靶板的样品：将8 µl肽段加入2 µl基质溶液中，混匀后点样至MALDI靶板，室温下自然干燥或置于37 °C加热板上干燥。 
			注意：已知精氨酸是在固相肽合成（SPPS）中较难偶联的氨基酸。可通过进行凯撒试验（Kaiser test）来确认偶联是否成功。14 (例如， 茚三酮试验）。该试验可用于检测树脂上可能残留的未偶联游离胺。若观察到蓝色（表明存在游离胺），则需重复偶联步骤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 CK(-NH-TMR)TATG（fTAT），使用含1%三氟乙酸（TFA）和2%三异丙基硅烷（TIS）的二氯甲烷（DCM）溶液，裂解 CK(-NH-Mtt)TATG 中赖氨酸（Lys）的α-氨基上Mtt保护基。
	<ol>
		<li>由于去除MTT保护基团会导致黄色出现，因此用20 ml上述溶液孵育树脂5分钟，重复此步骤直至不再观察到黄色。每次处理之间用二氯甲烷（DCM）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂。此外，由于TIS是一种能够清除MTT的捕获剂，当溶液中不再出现黄色时，表明MTT已被有效清除。</li>
		<li>加入额外的含1% TFA的DCM溶液（不含TIS）至树脂中，以确保不再有MTT被去除，且溶液保持澄清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将三种组分：羧基四甲基罗丹明（TMR）、HBTU 和 DIEA（相对于树脂质量（mg）的当量分别为 4、3.9 和 10）溶解于 DMF 中，将此混合液加入树脂，于干燥氮气氛围下过夜反应2 以提供振荡。</li>
	<li>Fmoc 脱保护和氨基酸偶联后，用 DCM 洗涤树脂并使其干燥。为将肽完全从树脂上裂解，加入含有 92.5% TFA、2.5% H2将O、2.5% TIS和2.5%乙二硫醇（EDT）（总体积=4 ml）加入肽树脂中，室温反应3小时，以实现全局脱保护并从树脂上裂解。
	<ol>
		<li>使用预冷的无水乙醚（Et2O），将步骤1.6中的溶液排入40 ml乙醇中2O，在 4 °C、4,000 × g 条件下离心 20–25 分钟。重复此步骤，以用冷的无水乙醇洗涤沉淀。2O.</li>
		<li>将沉淀物重悬于水（5 ml 或至沉淀完全溶解）中并冻干。然后将所得产物重悬于 0.1% 三氟乙酸/乙腈水溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分析型C18色谱柱（5 µm，4 x 150 mm）进行高效液相色谱分析，以检测每种肽。流速为1 ml/min，检测波长为214 nm和550 nm。</li>
	<li>在C18 10 × 250 mm色谱柱上进行半制备型高效液相色谱（HPLC）以纯化肽段。流速为4 ml/min，检测波长为214 nm和550 nm。所有运行均采用线性梯度洗脱，流动相A为含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液，流动相B为含90%乙腈、9.9%水和0.1% TFA的溶液。</li>
	<li>根据制造商方案，采用 MALDI-TOF 验证肽段的正确身份：fTAT，理论质量：2,041.17，实测质量：2,040.66；DEAC-K9，理论质量：1,412.97，实测质量：1,415.59。MALDI-TOF 检测使用 α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质。</li>
</ol>
2. 氧化反应：dfTAT 的生成
<ol>
	<li>将磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）曝气 1 小时（以下反应至少需要 5 ml）。</li>
	<li>将 fTAT（0.3 mg，1.5 × 10-4 mmol）溶解于已曝气的 PBS（pH 7.4，5 ml）中。加入肽后，确保溶液 pH 保持在 7.0–7.5 之间。若 pH 偏低，可逐次少量（1–5 µl）加入氢氧化钠溶液（1 M）调节至 pH 7.4。</li>
	<li>注意：溶解在 PBS 中的氧气可氧化 fTAT 上的巯基，形成二硫键。</li>
	<li>将反应液在室温下旋转孵育过夜（O/N），以确保反应完全（根据 HPLC 分析，产率可达 100%）。采用反相 HPLC 纯化产物，并按照步骤 1.9 的方法进行质谱分析（MALDI-TOF）。预期分子量：4,080.34，实测分子量：4,084.21。</li>
	<li>将纯化的 dfTAT（0.71 × 10-4 mmol）冻干后重悬于 200 µl 水中（纯 dfTAT 浓度为 356.3 µM）。</li>
</ol>
3. 测定 dfTAT 浓度
<ol>
	<li>将纯化的dfTAT分装物（通常为1 µl，具体体积取决于纯化肽的量）重悬于149 µl的50 mM TCEP溶液中。</li>
	<li>注意：在此步骤中，dfTAT被还原为其单体形式fTAT，以消除由于dfTAT中TMR荧光团彼此靠近所导致的吸光度猝灭现象（与还原后的fTAT中TMR的消光系数ε相比，dfTAT中TMR的消光系数ε降低）。</li>
	<li>让样品反应约20分钟（可使用分析型HPLC确认fTAT的生成）。</li>
	<li>将全部溶液加入石英比色皿中，在556 nm处测定吸光度。</li>
	<li>利用比尔定律（A = εcl；其中ε = 91,500 M-1 cm-1）计算fTAT的浓度，由此确定dfTAT的浓度，并将[fTAT]除以二得到[dfTAT]。</li>
</ol>
4. 细胞递送实验
<ol>
	<li>接种细胞（HeLa、HDF， 等等在培养皿中以80–90%汇合度培养（例如， 8孔或24孔培养皿）。在适当的培养基中培养细胞（例如， DMEM 添加 10% FBS 及青霉素/链霉素，于含 5% CO₂ 的 37 °C 恒温湿润环境中培养至 80–90% 汇合度2.</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞三次（每次加入 200 µl PBS，然后弃去）。</li>
	<li>通过将 dfTAT 储存液（溶于水）用 nrL-15 培养基稀释，配制 5 µM 的 dfTAT 工作液（对于 8 孔板，总体积应为 200 µl）。迄今为止测试的大多数细胞类型中，5 µM 的 dfTAT 浓度可实现高效的递送效果（培养板中超过 90% 的细胞具有高水平的胞质递送）图3然而，对于穿透倾向较高或较低的细胞类型，较低或较高的浓度可能更为合适。 
	关于培养基的说明：nrL-15用于dfTAT的递送，因其不含半胱氨酸，可避免还原dfTAT中的二硫键。然而，我们的数据表明，常规L-15（含半胱氨酸）和DMEM均可作为递送培养基。L-15含有还原性氨基酸半胱氨酸，但半胱氨酸在培养基中可能被氧化形成胱氨酸（DMEM中直接添加的是胱氨酸）。因此，dfTAT在这些培养基中仍保持完整，其递送效率与使用nrL-15时相当。</li>
	<li>将细胞与dfTAT（5 µM）在有或无货物分子的条件下孵育例如，EGFP（10 µM），37 °C孵育1小时（孵育时间可缩短，但dfTAT通常需要约30至45分钟以诱导内体泄漏）。</li>
	<li>用含肝素（1 mg/ml）的 L-15 培养基洗涤细胞（建议洗涤 3 次），以去除结合在细胞质膜上的 dfTAT。</li>
	<li>将细胞与不能穿透细胞膜的核染料共同孵育， 例如，Sytox Blue、Sytox Green（在nrL-15中为2 µM），用于根据制造商方案检测细胞质膜是否受损（死细胞会被染色，而活细胞不会）。</li>
	<li>使用荧光显微镜（100倍油镜或20倍物镜）对细胞进行成像。使用RFP滤光片（Ex = 560 ± 20 nm/Em = 630 ± 35 nm）对dfTAT进行成像。 
	注意：成功的递送会导致dfTAT在整个细胞内呈现弥散性荧光（对目标蛋白或肽递送效果的评估取决于具体应用）。fTAT（dfTAT进入胞质后被还原的产物）对核仁的染色可作为荧光信号位于细胞内的证据。fTAT将在数小时内降解，此时降解片段的荧光表现为点状。这种点状荧光不应与dfTAT因浓度过低而未能成功逃逸内体、滞留在内体中所导致的点状分布相混淆。</li>
</ol>
5. 控制递送的 MOI 浓度
<ol>
	<li>确定在所用细胞类型中实现 dfTAT 高效胞质释放所需的“最佳递送”浓度。将细胞与不同浓度梯度的 dfTAT 共孵育，进行荧光显微镜观察。dfTAT 的最佳浓度定义为：在培养细胞中，约 100% 的细胞呈现清晰的胞质“弥散”TMR 荧光信号的最低浓度。</li>
	<li>在共孵育方案中，保持 dfTAT 浓度不变，同时调整 MOI 的使用浓度（例如， 使用 dfTAT 的最佳递送浓度）。将孵育时间改为少于 1 小时，也可作为调节 MOI 递送量的一种选择。</li>
</ol>

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<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

用于dfTAT递送的细胞不应过于融合&#62;90% 汇合度），因为这可能影响递送效率。细胞也应保持健康状态：培养物中的死亡细胞可能释放出凋亡片段，而 dfTAT 可能与这些片段发生相互作用（例如， 来自降解细胞核的DNA）会干扰递送效率和成像质量。在添加dfTAT前，应充分洗涤细胞以去除胎牛血清（FBS）。FBS中存在的BSA可与dfTAT结合，从而降低dfTAT的递送效率。然而，洗涤操作需谨慎进行，过度剧烈的操作可能导致贴壁细胞从培养皿上脱落，或引起细胞应激，进而降低内吞摄取效率。使用dfTAT递送蛋白或多肽时，蛋白/多肽储备液应具有足够高的浓度，以避免在孵育过程中对nrL-15培养基造成过度稀释。 例如， 建议将5–10 µl样品加入200 µl nrL-15中。
荧光标记的穿膜肽可表现出光诱导的膜破坏活性。15 这在使用高强度光照剂量时会出现在dfTAT中。其表现可能为细胞内细胞器的破裂（例如， 内体、线粒体）、细胞表面出泡及细胞死亡。为尽量减少这些影响，应尽量减少光照暴露（共聚焦或落射荧光成像所需...

将蛋白质、多肽或细胞不可渗透的小分子递送至活细胞，在许多生物或生物技术应用中（如细胞成像、功能检测、细胞重编程）常常是必要的。 等等.)1-4已有多种递送方法被报道，包括显微注射、电穿孔或载体试剂的使用（例如细胞穿膜肽（如TAT）、脂质5-7每种技术通常都有其特定的优缺点，可能使其适用于某些应用，但不适用于其他情况。常见问题包括递送效率低下和/或无法控制递送物质的量8,9毒性或有害生理影响10,11，缺乏时间控制，仅在少数细胞中递送而无法覆盖整个细胞群体（例如，显微注射）12以及复杂的化学偶联或制剂方案11.
最近，我们开发出一种新颖的递送策略，可克服上述局限性。该策略依赖于一种名为dfTAT（二聚荧光TAT）13的肽。dfTAT源自著名的细胞穿透肽（CPP）TAT，包含两个通过二硫键连接的TAT拷贝，并标记有四甲基罗丹明荧光染料。尽管结构相似，TAT与dfTAT在活性上存在显著差异。TAT通常通过内吞作用进入细胞，但该CPP大多被困在内体中（在荧光显微镜下观察时，通常表现为肽在细胞内呈点状分布）。与TAT类似，dfTAT也能被细胞高效内吞。然而，dfTAT不会持续滞留在内体中，而是能以极高效率介导内体泄漏。因此，可利用dfTAT的内体裂解活性，通过简单的孵育实验实现大分子的递送。
目前对递送过程的理解如下。dfTAT 可诱导巨胞饮作用。因此，与 dfTAT 共同孵育的细胞可通过液相内吞作用（见图1）摄取培养基中存在的可溶性蛋白质、肽段或小分子（即目标分子，MOI）。只要 dfTAT 与 MOI 在内吞途径中共同转运，二者之间无需直接相互作用。当 dfTAT 在内吞细胞器腔内达到一定阈值时，便会发挥其内体逃逸活性（其分子机制尚待充分阐明）。随后，这些渗漏细胞器腔内的内容物（包括 MOI）被释放至细胞质中。因此，该方法极为便捷，无需将 MOI 与 dfTAT 进行共价连接或复合制剂化。此外，由于 dfTAT 不会直接修饰 MOI，因此在实现细胞内递送后，也不应干扰 MOI 的功能。同时，dfTAT 的使用浓度与培养基中 MOI 的浓度无关。例如，可在不同实验中保持 dfTAT 浓度恒定，以确保内体逃逸效率的可重复性；而培养基中 MOI 的浓度则可逐步调整，以实现细胞质中所需水平的 MOI 递送量。
dfTAT 实现的高效内涵体泄漏对迄今测试的多种细胞而言显著无害。这一现象令人意外，因为内吞细胞器是细胞的重要组成部分，人们原本预期 dfTAT 介导的显著泄漏会伴随有害的细胞反应。然而，经处理的细胞增殖速率与未处理细胞相同，且其转录组未表现出任何显著变化。此外，递送可在数分钟内重复进行，并保持可重复的递送效率，表明细胞能够耐受或迅速恢复递送过程，而不丧失内吞或内涵体泄漏的能力。在 dfTAT 递送过程中可能产生细微的细胞反应，但这些反应的具体分子机制仍有待探索。然而，鉴于其高效率、操作便捷以及无毒性，该递送方法在多种基于细胞的应用中应能立即发挥实用价值。本文所提供的实验方案旨在使该技术更易于被科研界所采用。

<table><tbody><tr><td>肝素&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX 蓝染料</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX 绿染料</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&amp;ndash;) 半胱氨酸</td><td>Hyclone</td><td></td><td>特殊订购</td></tr><tr><td>Fmoc-保护的氨基酸</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>可根据要求提供样品（联系邮箱：pellois@tamu.edu）</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>型号 IXB1</td><td>配备加热载物台，维持在 37 &amp;deg;C，并配有 Rolera-MGI Plus 背照式电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机（Qimaging）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 恒温、加湿、含 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多肽合成仪或用于手动多肽合成的容器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过与内体裂解试剂dftat共孵育将蛋白质、多肽或细胞不可渗透的小分子递送至活细胞

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

大分子递送策略通常利用内吞途径作为进入细胞的路径。然而，内体滞留严重限制了大分子进入细胞胞质空间的效率。近期，我们通过鉴定一种名为 dfTAT 的试剂克服了这一问题，该试剂是经荧光素四甲基罗丹明标记的 TAT 肽段的二硫键二聚体。我们构建了一种典型的穿膜肽（CPP）TAT 的荧光标记二聚体 dfTAT，该分子能够高效穿透活细胞并进入细胞的胞质空间。dfTAT 的胞质递送已在多种细胞系（包括原代细胞）中实现。此外，该递送过程对细胞活力、增殖或基因表达无明显影响。dfTAT 可递送小分子、多肽、抗体、具有生物活性的酶以及转录因子。在本报告中，我们描述了 dfTAT 的合成及其细胞递送的相关实验方案。文稿还阐述了如何通过调节细胞外施加的蛋白量来控制进入细胞胞质空间的蛋白量。最后，本文讨论了该新技术目前的局限性以及验证递送效果所需的操作步骤。所述实验方案对于基于细胞的检测，以及细胞的离体（ex vivo）操控与重编程，均具有极高的应用价值。

为了评估 fTAT 与 dfTAT 之间的差异，将 HeLa 细胞分别与每种肽段孵育 1 小时，以确定它们在细胞内定位的差别。通过荧光显微镜检测两种穿膜肽的内化情况。图 2 显示，fTAT（20 µM）呈现斑点状分布，这种分布模式表明该肽段仍被困在内体中。相比之下，dfTAT（5 µM）的荧光信号在整个细胞质和细胞核中呈现均匀分布。图 3 显示，dfTAT 的细胞质分布可在多种不同细胞系中观察到，包括 COLO 316、NIH 3T3、HaCaT、转染难度较高的 Neuro-2a、MCH58、原代细胞系 HDF、DRG-F11 以及 NCL-H1299。20 倍图像显示，培养皿中绝大多数细胞（>80%）表现出 dfTAT 的细胞质分布，且无细胞毒性（无 Sytox 蓝染色的细胞核信号）。
为了确定dfTAT介导的内涵体泄漏是否能将大分子蛋白质递送至细胞的细胞质中，选择EGFP（26 kDa）作为模型蛋白，因其荧光特性可用于通过观察绿色荧光的定位（在正确折叠条件下）来检测其是否进入细胞。在本实验中，将EGFP与dTA...

我们介绍了一种通过与可使内吞细胞器产生通透性的试剂共孵育的简单方法，将蛋白质和细胞不可渗透的小分子递送至培养的哺乳动物细胞中。

通过与内体裂解试剂dfTAT共孵育将蛋白质、多肽或细胞不可渗透的小分子递送至活细胞

大分子递送策略通常利用内吞途径作为细胞进入的路径。然而，内体滞留严重限制了……

以下实验的总体目标是利用二聚体荧光 tat 或 df tat 这种能够高效穿透细胞且不损伤细胞的试剂，将大分子递送至活细胞内。该目标通过两个步骤实现：第一步是生成并纯化递送试剂 dfta。Dfta 在 37 摄氏度下与细胞共孵育一小时，同时存在目标大分子货物，df tat 可诱导该货物被内吞进入内吞囊泡。这些囊泡逐渐成熟为早期内体，最终发展为晚期内体，在此阶段 DF tat 能够将货物释放至细胞的胞质空间。随后，通过荧光显微镜对细胞成像，以评估 detta 及目标货物的递送效率。结果显示，DF TT 能够以高效率进入细胞，且无明显细胞毒性。DF tat 可将不同大小的生物大分子递送至细胞的胞质空间，这一点可通过荧光显微镜观察到。与现有的固体递送方法相比，该技术的主要优势在于递送试剂具有高效的递送能力，且对细胞生理状态无明显不良影响。此外，该方法操作简便，仅需简单的共孵育步骤即可完成。首先，在标准的50毫升SPPS反应容器中，将500毫克R酰胺MBHA树脂溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，室温下溶胀1小时，通入适量氮气使反应液轻微鼓泡。使用文中方案所列的每种FM保护氨基酸1.2毫摩尔，在Rink酰胺MBHA树脂上合成FTA，进行每步氨基酸偶联反应。每次偶联同时加入0.44克HBTU和0.51毫升DIEA（溶于DMF中），每步氨基酸偶联反应持续4小时。完成4小时偶联后，继续后续操作。用DMF洗涤树脂，并按照文本方案中所述进行FD保护步骤。重复操作，直至合成FTA的线性肽链。接下来，将树脂与20毫升由1%三氟乙酸（TFA）和2%三异丙基硅烷（TIS）溶于二氯甲烷（DCM）组成的溶液孵育5分钟，以裂解MTT保护基团。由于去除MTT保护基团会导致黄色出现，因此需重复操作直至用DCM和DMF洗涤树脂时不再观察到黄色。向树脂中加入含1% TFA的DCM溶液，以确保无MTT被去除，且溶液保持澄清。接下来，将T-M-R-H-B-T-U和DIEA溶解于DMF中，并将此混合物加入树脂。在干燥氮气搅拌下，过夜进行反应，完成fmoc保护及氨基酸偶联。用DCM洗涤树脂，并使其干燥，以实现肽链从树脂的完全裂解。向肽树脂中加入含有92.5% TFA、2.5%水、2.5% TIS和2.5%乙二硫醇的溶液，在室温下反应三小时，以实现全局脱保护并使肽链从树脂上裂解。将制备好的溶液倒入40毫升无水乙醚中，通过冷无水乙醚沉淀粗肽产物。在4°C、4,000 G条件下离心20至25分钟。重复此步骤，用冷的无水乙醚洗涤沉淀物。将沉淀物悬浮于水中，冻干，然后将所得产物重新悬浮于0.1%的水相三氟乙酸（TFA）ACEDONITE试验溶液中。使用分析型C18柱进行高效液相色谱（HPLC）分析。分析每种肽时，使用每分钟1毫升的流速，并在214纳米和550纳米处进行检测。接下来，在C 18柱上进行半制备型高效液相色谱（HPLC）以纯化肽。所有运行均使用每分钟4毫升的流速，并在214纳米和550纳米处进行检测。在进行氧化反应前使用线性梯度。根据制造商的说明书，通过MALDI确认肽段的正确身份。将FTA溶解于通入空气的磷酸盐缓冲液中。确保 pH 值在 7.0 至 7.5 之间。加入肽后，将反应液在室温下孵育过夜，使其反应完全。使用反相高效液相色谱法（reverse phase HPLC）纯化产物，并如前所述通过质谱分析进行检测。将纯化的 DF tat 冷冻干燥后重悬于 200 微升水中，测定其浓度。首先，将一份纯化的 DF tat 样品悬浮于 149 微升的 50 毫摩尔 TCEP 溶液中，使样品反应约 20 分钟。在此步骤中，DF tat 被还原为其单体形式 F tat，以消除因 TMR 荧光基团与 DF tat 靠近而引起的吸光度猝灭现象。将所有溶液加入石英比色皿中，并在 556 纳米处测定吸光度。利用比尔定律，确定溶液的浓度。该浓度对应于 FTA 的浓度。将 FTA 的浓度除以二，得到 dfta 的浓度。在含 5% CO2 的 37 °C 恒温湿润环境中，使用适当的培养基培养细胞至 80% 至 90% 汇合度，用 200 µL PBS 洗涤细胞三次，并用 NRL 15 洗涤一次。将细胞与五 µM df tat（可选携带货物，如增强型绿色荧光蛋白）在 37 °C 孵育一小时，以诱导内体泄漏。用含肝素的 L-15 培养基洗涤细胞三次，以去除结合在细胞质膜上的 DF tat。最后一步是使用荧光显微镜，通过红色荧光蛋白（RFP）滤光片观察 DF tat，以评估 F TAT 与 D ftt 之间的差异。将 HeLa 细胞与每种肽段共同孵育，以确定其在细胞内定位的差异。如图所示，FTA 呈点状分布，这种分布模式与肽段滞留在内体内部的现象一致。相比之下，dfta 的荧光信号在细胞质和细胞核中均呈均匀分布。在多种不同的细胞系中均观察到DF tat的胞质分布。20倍图像显示，培养皿中绝大多数细胞呈现DF tat的胞质分布，且未见细胞毒性，这通过无Cyt Blue细胞核染色得以证实。该实验旨在确定dfta介导的内体泄漏是否可将大分子蛋白质递送至细胞胞质中。采用EGFP检测正确折叠蛋白质的递送情况。EGFP 显示出胞质和细胞核内的绿色荧光分布，与在超过90%的细胞中观察到的 DF tat 分布相似，且无明显毒性。在进行该操作时，需注意细胞不应过度融合。此外，在加入 df tap 前，应充分洗涤细胞以去除 FPS。

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交货蛋白质，多肽或细胞不可渗透的小分子进入活细胞被孵化与核内体溶解试剂dfTAT

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可穿透细胞的蛋白质的构建

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本实验方案基于生物素-亲和素沉淀系统，并结合细胞穿透序列，用于研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用。其主要优势在于目标序列与活细胞共同孵育，而非细胞裂解物，因此相互作用可在细胞生理环境下发生。...

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原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

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弹性蛋白样蛋白的定向组装形成特定超分子结构及体外货物包封

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学习使用dfTAT试剂将蛋白质、多肽及细胞不可渗透的小分子高效递送至活细胞的方法。该技术通过核内体溶解机制实现胞质释放，适用于细胞生物学与神经科学研究。

通过与内体裂解试剂dfTAT共孵育将蛋白质、多肽或细胞不可渗透的小分子递送至活细胞

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