从腺病毒感染的正常人细胞中分离富含病毒复制区室的核内组分

本实验的总体目标是获得富含腺病毒感染细胞中形成的复制区室的非核组分，以便对其组成、超微结构及相关活性进行深入研究。该方法有助于解决DNA病毒学领域的关键问题，例如研究调控病毒基因组复制和表达的分子机制，而这些过程又依赖于复制区室对病毒与宿主细胞相互作用的调控。该技术的主要优势在于，它是一种基于速度梯度的简单操作流程，可建立无细胞体系，便于研究核内复制DNA病毒如何掌控感染细胞的分子机制。

为了进行该实验，首先按照随附文本方案准备腺病毒5型（Ad5）和人包皮成纤维细胞（HFF），在100毫米组织培养皿中，用每皿1毫升含85 mmol/L D-甘露醇的DMEM培养基，以每个细胞30个感染形成单位（FFU）的感染复数（MOI），感染107个HFF细胞。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的湿润细胞培养箱中孵育2小时，每15分钟轻轻摇动培养皿一次，以确保病毒接种物在细胞表面均匀分布。孵育结束后，吸除培养基，加入新鲜DMEM培养基。

加入10% FBS后，使用细胞刮棒将细胞孵育16、24或36小时。感染后轻柔收集感染组和对照组细胞，并将细胞悬液收集至预冷的无菌离心管中，置于冰上。使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对细胞进行计数，随后在4°C条件下以220 × g离心5分钟。

接下来，将细胞沉淀重悬于 5 毫升预冷的 PBS 中，离心后用 5 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞三次，每次弃去上清液，以裂解细胞。将细胞沉淀重悬于 700 微升含蛋白酶抑制剂的预冷低渗缓冲液中，冰上孵育 3 小时使细胞肿胀。使用 A 型特氟龙研杵，上下研磨 10 至 20 次以匀浆细胞。

每隔20次 strokes 在显微镜下检查一次裂解液，以监测细胞裂解情况。重复该操作约80次，直至所有细胞完全破裂。随后，将匀浆液在4摄氏度、300 × g条件下离心5分钟。

将上清液储存于 -20 °C 的离心管中，作为细胞质组分，以去除细胞核重悬物中的细胞碎片。将沉淀物重悬于 750 µL 的 0.25 mol/L 蔗糖溶液一中，取 750 µL 的 0.35 mol/L 蔗糖溶液二加入离心管中，然后小心地将重悬的匀浆液层加在溶液二之上。在 4 °C 条件下以 1400 ×g 离心 5 分钟，随后弃去上清液。

将沉淀重悬于750微升的溶液二中。将核悬液置于超声波水浴中进行超声处理，在4摄氏度或更低温度下以两次5分钟脉冲进行。在脉冲间隔期间，在明场显微镜下检查核裂解情况，并继续超声处理直至细胞核完全裂解。

接下来，用移液器将750微升0.88摩尔的蔗糖溶液三加入离心管中，将核裂解液小心铺加在溶液三上层。在4摄氏度下以3000 × g离心10分钟。上层1.5毫升液体即为核质组分，于-70摄氏度保存。

然后将沉淀重悬于700 µL溶液二中。此为宿主细胞核的85复制区室组分（RCF），同样在-70°C保存。开始免疫荧光分析时，取5 µL RCF样品滴加至经盐水包被的玻片上。

让液滴在室温下自然干燥。然后在标记位置旁滴加500微升PBS，倾斜载玻片使PBS流过标记区域。从载玻片上移除PBS。

接下来，在室温下用含有5%牛血清白蛋白的500 µL PBS封闭样品点，封闭2小时。为去除多余的封闭液，向载玻片上的样品点轻轻加入500 µL PBS，避免直接用移液器接触样品点。重复洗涤3次。

接下来，在样本点上加入20 µL针对病毒E2A DNA结合蛋白的稀释后一抗。盖上盖玻片以防止蒸发，并在室温下的湿盒中孵育两小时。随后，用含0.02% Tween 20的PBS轻柔洗涤样本三次。

清洗后避免直接将移液枪头接触样本。直接在样本上加入20 µL荧光标记的二抗（小鼠来源），在4°C孵育1小时。在湿化孵箱中，向切片加入500 µL含0.02% Tween 20的PBS缓冲液，同样避免移液时直接接触样本。

然后加入两微升封片液，并将盖玻片倒置覆盖在样品上。用指甲油密封盖玻片四周。在荧光显微镜下使用63倍物镜，于所用荧光染料的特定波长下观察切片。此处结果显示为腺病毒E2A DNA结合蛋白（DBP）免疫荧光染色的结果。

含有DBP的结构是位于细胞核内的病毒复制中心（rc），请注意E2A DBP定位于复制中心内，并以绿色显示。此外，通过PCR检测感染后24小时和36小时的RCF组分与核质组分（NPL）中病毒DNA的富集情况，进一步证实了病毒DNA在RCF中的富集。病毒GNA选择性地存在于RCF中，而在NPL中未检测到。

有关RCF中腺病毒MNA的附加证据的配套文本，一旦掌握该技术，若操作得当，从收获感染细胞到分离RCF可在六小时内完成。在进行此操作时，务必始终将样品置于冰上，并通过明场显微镜监测匀浆、细胞核分离、超声处理以及核下组分分离等步骤。遵循本操作流程。

还可以采用其他方法，如逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）和透射电子显微镜技术，用于研究与病毒复制区室相关的病毒基因表达调控以及这些颗粒的超微结构。该技术有望为DNA肿瘤病毒学领域的研究人员探索影响细胞周期调控并促进人细胞中病毒复制的分子机制提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从感染细胞的细胞核中分离病毒复制区室，以对这些病毒诱导的结构进行形态学、功能性和组分研究。

请注意，使用 SAN 指示剂可能存在危险，进行此操作时应始终采取预防措施，例如佩戴耳塞。