由腺病毒感染正常细胞分离病毒复制车厢富集亚核分数
November 12th, 2015
我们提供了一种从腺病毒 （Ad） 感染的人类细胞中分离病毒复制区室 （RC） 的新策略。这种方法代表了一种无细胞系统，可以帮助阐明调节病毒基因组复制和表达的分子机制，以及在 RC 建立的病毒-宿主相互作用的调节。
该程序的总体目标是获得富含腺病毒感染细胞中形成的复制区室的非核部分，用于详细研究它们的组成、超微结构和相关活性。这种方法可以帮助解决 DNA 病毒学领域的关键问题，例如研究控制病毒基因组复制和表达的分子机制，而这些机制又依赖于复制区室来调节病毒宿主细胞相互作用。该技术的主要优点是它是一个基于速度梯度的简单过程，用于建立一个无细胞系统，该系统适用于研究允许核复制 DNA 病毒控制受感染细胞的机制。
为了进行该测定，首先，按照随附文本方案中的说明准备 5 型腺病毒或 D 5 型腺病毒和人包皮成纤维细胞或 HFF，以每培养皿使用 1 毫升 85 和 DMM，以 30 个病灶形成单位的 MOI 或每个细胞的 FFU 开始感染 10 至第 7 个 HFF，将细胞在加湿的细胞培养箱中孵育 2 小时在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下。每 15 分钟小心摇动一次培养皿，以确保病毒接种物在细胞上均匀分布。孵育后，去除培养基并加入新鲜的 dmem。
补充 10% FBS，然后使用细胞刮刀将细胞孵育 16、24 或 36 小时。感染后轻轻收获感染细胞和对照细胞，并将细胞悬液收集在冰上的无菌离心管中。使用 neubauer 室对细胞进行计数，然后在 4 摄氏度下以 220 倍 G 离心细胞 5 分钟。
接下来，将细胞沉淀重悬于 5 毫升冰冷的 PBS 离心机中，并在 5 毫升冰冷的 PBS 中洗涤细胞 3 次，丢弃洗涤上清液，以去除细胞。复苏，将细胞沉淀悬浮在 700 μL 冰冷的低渗缓冲液中，并含蛋白酶抑制剂，让细胞在冰上膨胀 3 小时。使用 A 型特氟龙杵，向下冲程 10 至 20 次使细胞匀浆。
每 20 次冲程在显微镜下定期检查裂解物，以监测细胞裂解。重复该过程约 80 次，直到所有细胞成功破裂。接下来，将匀浆在 4 摄氏度下以 300 倍 G 离心 5 分钟。
将上清液作为细胞质部分储存在零下 20 摄氏度的试管中，以去除细胞核中的细胞碎片。将沉淀悬浮在 750 微升 0.25 摩尔蔗糖溶液中，一根移液管，750 微升 0.35 摩尔蔗糖溶液，两滴放入离心管中，然后小心地将重悬的匀浆铺在溶液 2 上。将蔗糖垫在 4 摄氏度下以 1400 倍 G 旋转 5 分钟，然后弃去上清液。
将沉淀重新悬浮在 750 微升溶液 2 中以去除虱子。细胞核在超声波浴中对核悬浮液进行超声处理，在两个 5 分钟的脉冲中保持在 4 摄氏度或以下。在脉冲之间在明场显微镜下检查细胞核裂解，并进一步超声处理，直到细胞核完全躺下。
接下来，将 750 微升 0.88 摩尔蔗糖溶液 3 移液到离心管中，将核裂解物溶液叠加在溶液 3 上。将裂解物在 4 摄氏度下以 3000 倍 G 离心 10 分钟。命名的 1.5 毫升 S 是核质组分，储存在零下 70 摄氏度。
然后将沉淀重悬于 700 微升溶液 2 中。这是宿主核的 85 复制区室分数或 RCF，也储存在零下 70 摄氏度。要开始免疫荧光分析，请将 5 微升 RCF 滴添加到盐水包被的载玻片中。
让液滴在室温下风干。然后在该斑点旁边滴入 500 微升 PBS，并倾斜载玻片以使 PBS 流过该斑点。从载玻片中排出 PBS。
接下来，用 500 微升含有 5% 牛血清白蛋白的 PBS 在室温下封闭样品点 2 小时。要去除多余的封闭溶液，将 500 微升 PBS 轻轻添加到载玻片上点样的样品中，不要直接在样品上移液。执行洗涤 3 次。
接下来，在样品点上添加 20 μL 针对病毒 E 2 A DNA 结合蛋白的稀释一抗。盖上玻片以避免蒸发，并在加湿室中室温孵育 2 小时。现在，用含有 0.02% 吐温 20 的 PBS 轻轻洗涤样品三次。
避免在这些洗涤后直接在样品上移液。直接在样品上加入 20 μL 氟 4 偶联小鼠二抗，在 4 摄氏度下孵育 1 小时。在加湿室中，向载玻片中加入 500 微升含 0.02%吐温 20 的 PBS，再次避免直接在样品上移液。
然后加入 2 微升封固液，并在样品上倒置盖玻片。用指甲油密封盖玻片的侧面。在荧光显微镜下用 63 倍物镜在所需的荧光 4 特异性波长下查看载玻片，此处显示了腺病毒 E 2 A DNA 结合蛋白或 DBP 的免疫荧光结果。
含有 DBP 的结构是亚核病毒 rc，请注意 E two A DBP 位于 RC 内并显示为绿色。此外，通过比较感染后 24 小时和 36 小时 RCF 与核质组分或 NPL 的 PCR 证实 RCF 中病毒 DNA 的富集。病毒 GNA 是在 RCF 中选择性发现的，而不是在 NPL 咨询中发现的。
随附的文本，了解 RCF 中腺病毒 MNA 的额外证据：一旦掌握了这项技术，就可以在六天内完成，从收获感染细胞到分离 RCF（如果作得当）。在尝试此程序时，重要的是要记住始终将样品放在冰上，并通过明场显微镜监测均质化核、分离、超声处理和亚核级分分离步骤。遵循此过程。
可以进行其他方法，如 R-T-P-C-R 和透射电子显微镜，以研究与病毒复制区室相关的病毒基因表达的调节以及这些颗粒的超微结构。这项技术有可能为 DNA 肿瘤病毒学领域的研究人员铺平道路，以探索改变细胞周期调节和促进人类细胞中病毒复制的分子机制。观看本视频后，您应该对如何从受感染的细胞核中分离病毒复制区室，以对这些病毒诱导的结构进行形态学、功能和组成研究有很好的了解。
不要忘记，使用 SAN 指示器可能很危险，并且在执行此过程时应始终进行叩诊，例如佩戴耳口。
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概述
本文提出了一种新的策略，用于从腺病毒感染的人类细胞中分离病毒复制隔室。该方法建立了一个无细胞系统，有助于理解病毒基因组复制和宿主相互作用的分子机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- 复制隔室对于病毒基因组复制至关重要。
- 腺病毒作为研究DNA病毒的模型。
- 理解病毒-宿主相互作用对于病毒学研究至关重要。
- 目前研究这些隔室的方法有限。
研究目的
- 从腺病毒感染的细胞中分离复制隔室。
- 调查这些隔室的组成和结构。
- 探索调节病毒复制和表达的分子机制。
使用的方法
- 用腺病毒5型感染人类包皮成纤维细胞。
- 使用速度梯度分离非核分数。
- 分析分离的隔室的结构和活性。
- 研究复制隔室处的病毒-宿主相互作用。
主要结果
- 成功从感染的细胞中分离出复制隔室。
- 表征这些隔室的组成和超微结构。
- 对病毒基因组复制机制的洞察。
- 对病毒-宿主细胞相互作用的深入理解。
结论
- 该方法为研究病毒复制提供了一种简单的方法。
- 它为DNA病毒学的进一步研究开辟了途径。
- 理解这些机制可能导致更好的抗病毒策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating viral replication compartments enables mechanistic de-risking of antiviral target validation by revealing host-pathogen interaction nodes. This cell-free system supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts of viral replication dynamics. The approach aligns with preclinical model development for DNA virus therapeutics by enabling compositional and functional analysis of virus-induced nuclear structures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral replication mechanisms through enrichment of replication compartment-associated proteins and nucleic acids.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible fractionation method to reduce variability in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates enriched subnuclear fractions suitable for biochemical assays measuring viral DNA synthesis or transcription activity.
- Operational Value: Establishes a cell-free platform amenable to high-throughput screening of compounds disrupting replication compartment formation or function.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of host antiviral responses co-opted to replication compartments, informing biomarker discovery for DDR or innate immune pathways.
- Operational Value: Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by enabling ultrastructural and compositional correlation with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing mechanistic insights into viral replication regulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral genome regulation through isolation of functional replication compartments.
- Screening: Enables assay readiness via quantitative outputs such as viral DNA enrichment in the replication compartment fraction.
- Analytics: Delivers compositional and activity-based readouts that allow comparison of infected versus control conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through analysis of host protein recruitment to virus-induced nuclear domains.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fractionation platform applicable to other nuclear-replicating DNA viruses beyond adenovirus.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic insight into viral replication compartment function.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of subcellular fractionation for cross-functional collaboration.
- Strategic Value: Reduced biological risk in antiviral programs via early de-risking of replication-dependent mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on replication compartment disruption potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and subcellular fractionation techniques.
- Dependent on access to ultracentrifugation equipment and gradient preparation capabilities.
- Necessitates standardization of infection timing and MOI across laboratories for reproducible enrichment.
- Adaptation considerations include optimization for different virus strains or cell types based on nuclear architecture.
- Practical limitations include the need for careful sample handling on ice to prevent degradation of labile replication compartment components.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Preparation of the Subnuclear Fraction Enriched in Adenoviral Replication Compartments
5:54
Immunofluorescence Visualization of RCf
8:00
Results: Presence of Adenoviral Components in the Replication Compartment Fraction from Infected Human Foreskin Fibroblasts
8:49
Conclusion
