具有可变角度荧光显微镜植物细胞表面动力学的实时成像

该程序的总体目标是使用可变角度落射荧光显微镜观察荧光标记蛋白在植物细胞表面的运动。这个容器可以帮助我们在植物细胞生物学领域取得进展，例如蛋白质如何在板细胞表面工作。这项技术的主要优点是它允许我们在开始程序之前可视化荧光攻击蛋白的实时动态。

根据制造商的说明校准显微镜的激光对中和聚焦。然后使用无物镜光路定位显微镜室天花板的中心，并用彩色密封标记位置。接下来，用物镜照亮天花板，并将被照亮的区域移动到中心位置。

然后聚焦激光并将激光的位置微调到天花板的中心。激光器的对中和聚焦对于成功的可变角度落射气味显微镜或 VAEM 观察非常重要。在开始实验之前，用户应由显微镜公司的专业人员进行培训。

显微镜准备就绪后，将 30 μL 基础缓冲液分配到 76 x 26 毫米载玻片的中心。然后用解剖剪刀从 7 天大的幼苗中去除 co 导联蛋白，并将 co 导联蛋白与观察面朝上漂浮在基础缓冲液滴上。接下来，在 18 x 18 毫米的中心添加 30 微升基础缓冲液。

盖上玻璃并倒置盖玻片。轻轻的表面张力将防止液滴掉落，用镊子夹住盖玻片的一侧边缘。将相反的边缘放在载玻片上，使缓冲液位于共导入物上方。

然后将盖玻片的边缘保持在载玻片上。调整液滴的位置，使其位于油精样品的正上方，然后放下盖玻片。如果没有气泡，请使用无绒纸巾擦去多余的缓冲液，并立即将制备物转移到显微镜中。

使用明场照明，选择要观察的单元格。接下来，确认可以观察到荧光蛋白，并使用落射荧光照明设置细胞表面的 Z 轴位置。要执行 VAEM，请使用控制器盒倾斜激光束的入射角。

逐渐地，同时仔细监控实时图像。最初，图像会显得模糊。随着激光角度的增加，VAEM 图像将变得不那么模糊，最终产生清晰的图像。

此时，停止增加激光角度。现在好了。调整激光入射角度以获得更好的图像，并根据需要调整光学和图像传感器参数。

然后使用商用显微镜软件，将电影采集为多页 TIFF 图像文件。在这里，视频显示了 GFP 标记的点在 STA 模型单元的表面闪烁。要使用斐济量化 GFP 标记的 DOT 停留时间，请转到文件打开菜单，然后打开获取的多页提示文件。

使用直线选择工具在感兴趣的一侧放置一条线。接下来，使用 image stacks dynamic res slice 插件生成图形图像。随着线条的变化，图形图像将动态变化。

将图像另存为 TIFF 文件，在文件下另存为 tiff 菜单。然后要执行降噪，请转到处理滤镜 Gaussian blur 菜单，并将 Gaussian 滤镜应用于计时码表图像。应根据需要调整 sigma radius 参数。

使用图像调整阈值工具，通过阈值对信号区域进行分段，然后打开 analyze set measurements 菜单。接下来，检查 set measurements （设置测量） 窗口中的边界矩形，选择可能的最小像素数。然后在 analyze， analyze particles （分析，分析粒子） 菜单下。

根据 Y 轴测量感兴趣点的时间，并选中 display results 和 add to manager 框以查看数据值。最后，在结果表菜单下，选择文件，另存为并使用适当的分析软件处理点阵图像持续时间的数据集。在这里，通过 chm 图形分析测量的 185 个 GFP 巡逻 1 点来自 8th edin 的 12 个独立子单元的停留时间如图所示。

拟合密度函数显示，大多数 GFP 巡逻 1 点在子单元中驻留 2 到 10 秒，峰值约为 3.5 秒。这表明子细胞表面质子泵的快速胞吐内吞作用。看完这个视频后，您应该对如何使用可变角度落射荧光显微镜在植物细胞表面可视化和量化 ary 型蛋白质动力学有很好的了解。