利用可变角度落射荧光显微镜对植物细胞表面动态进行实时成像

本实验的总体目标是利用变角落射荧光显微镜观察荧光标记蛋白在植物细胞表面的运动。该方法有助于推动植物细胞生物学领域的发展，例如揭示蛋白质在植物细胞表面的作用机制。该技术的主要优势在于，能够在开始实验前使我们实时观察荧光标记蛋白的动态行为。

根据制造商的说明校准显微镜的激光居中和聚焦。然后使用物镜镜头的无遮挡光路定位显微镜室天花板的中心，并用彩色标记贴纸标示该位置。接着，用物镜镜头照射天花板，并将照明区域移动至中心位置。

然后聚焦激光，并微调激光位置至天花板的中心。激光的居中和聚焦对于成功进行变角落射照明显微镜（VAEM）观察至关重要。在开始实验之前，使用者应接受显微镜公司专业人员的培训。

当显微镜准备就绪后，取 30 µL 基础缓冲液滴加至 76 mm × 26 mm 玻璃载玻片的中央。然后使用解剖剪从七天龄的幼苗上切下一枚卷须，并将卷须观察面朝上漂浮于基础缓冲液液滴中。接着，向 18 mm × 18 mm 盖玻片中央加入 30 µL 基础缓冲液。

盖上盖玻片，并将盖玻片翻转朝下。用镊子夹住盖玻片一侧边缘，轻轻操作，依靠表面张力防止液滴脱落。将对侧边缘置于载玻片上，使缓冲液覆盖至共聚焦引线区域。

然后将盖玻片的一边保持在载玻片上，调整液滴的位置，使其正对油样上方，再缓缓放下盖玻片。若无气泡产生，用无绒擦镜纸擦去多余的缓冲液，并立即将样品转移至显微镜下观察。

使用明场照明选择待观察的细胞。接着，确认可观察到荧光蛋白，并使用落射荧光照明将 Z 轴位置设定在细胞表面。为进行 VAEM，使用控制器盒调节激光束的入射角度。

在仔细监测实时图像的同时，逐渐调整。最初，图像会显得模糊。随着激光角度的增加，VAEM 图像的模糊程度将逐渐降低，最终获得清晰的图像。

此时，停止增大激光角度。现在进行精细调节，调整激光入射角度以获得更佳图像，并根据需要调节光学参数和图像传感器参数。

然后使用商用显微镜软件，以多页 TIFF 图像文件格式采集一段视频。此处的视频显示了标记有 GFP 的荧光点在 STA 模型细胞表面闪烁。为了使用 Fiji 量化 GFP 标记的 DOT 停留时间，请进入文件打开菜单，打开所采集的多页 TIFF 文件。

使用直线选择工具在感兴趣的侧面放置一条直线。接着，利用图像堆栈动态重切片插件生成图像化的曲线图。随着直线的变化，曲线图将动态更新。

在“文件”菜单中将图像另存为 TIFF 格式。随后，为进行降噪处理，请进入“处理”→“滤镜”→“高斯模糊”菜单，并对时间序列图像应用高斯滤波器。根据需要调整 sigma 半径参数。

使用图像调整阈值工具，通过阈值分割信号区域，并打开分析>设置测量菜单。接着，在设置测量窗口中勾选边界矩形，选择尽可能小的最小像素数。然后在分析菜单下选择分析粒子选项。

根据Y轴测量目标点的时间，并查看显示结果，将数据添加至管理框中以查看具体数值。最后，在结果表格菜单中选择“文件”、“另存为”，并使用适当的分析软件处理点图像持续时间的数据集。此处展示了通过chm图分析测得的12个独立子细胞中185个GFP巡逻一点在第八代edin中的停留时间，结果如图所示。

拟合的密度函数显示，大多数GFP巡逻点在副细胞中停留的时间介于2到10秒之间，峰值约为3.5秒。这表明副细胞表面的质子泵存在快速的胞吐与内吞作用。通过本视频的学习，您应能充分理解如何利用可变角度落射荧光显微镜对植物细胞表面特定类型蛋白的动力学进行可视化与定量分析。