放射性标记及通过高效液相色谱-流式闪烁法定量细胞内磷脂酰肌醇磷酸酯水平

本实验的总体目标是测定在不同遗传和环境条件下细胞中各型磷脂酰肌醇的含量，以深入了解磷脂酰肌醇的功能及其调控机制。磷脂酰肌醇类脂质调控细胞的多种功能，如细胞迁移、复制以及记忆相关物质的转运。该方法可识别影响磷脂酰肌醇的遗传和环境因素，从而增进我们对其调控机制与生物学功能的认识。

该技术的主要优势在于能够准确定量细胞内所有磷脂酰肌醇的实时水平。尽管该方法可用于研究酵母中磷脂酰肌醇的调控机制，但也同样适用于培养的哺乳动物细胞。由于标记、处理和分析步骤较多，初次使用者可能会遇到困难。

我们建议先在不使用放射性标记的情况下进行练习。首先，在完全合成培养基中，于30摄氏度恒定振荡条件下培养20毫升酿酒酵母菌株SEY6210的液体培养物，直至进入对数中期。接着，将总共10至14 OD的酵母细胞转移至一个12毫升圆底离心管中，并在800 × g条件下离心5分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于 2 毫升无肌醇培养基中。再次离心细胞。

然后将沉淀重悬于440 µL无肌醇培养基中。在室温下孵育细胞15分钟。孵育结束后，加入60 µL氚标记的myo-肌醇，并在30 °C下持续振荡培养细胞额外1至3小时。

将细胞悬液转移至含有500 µL 9%高氯酸和200 µL酸洗玻璃珠的微量离心管中。通过反复倒置试管混匀，然后在冰上孵育5分钟。随后，以最大速度涡旋振荡试管10分钟。

然后使用加样枪头将裂解液转移至新的微量离心管中，避免吸入玻璃珠。接着离心试管并弃去上清液。用1毫升冰预冷的100毫摩尔EDTA重悬沉淀，直至完全分散，再次离心。

离心后，吸除含有放射性标记沉淀的试管中的EDTA。加入50 µL水，超声处理以重新悬浮沉淀。根据文本方案配制新鲜的去酰基化试剂。

然后向试管中加入 500 µL 去酰化试剂，超声混匀。将样品在室温下孵育 20 分钟。接着，将样品转移至 53 °C 的加热块中孵育 50 分钟。

随后，将样品置于真空离心浓缩仪中，干燥至少三小时。用300 µL水通过超声处理重新悬浮沉淀物，并在室温下孵育20分钟。之后，再次将样品置于真空离心浓缩仪中彻底干燥，时间不少于三小时。

干燥后，向离心管中加入 450 微升水，通过超声处理使沉淀重新悬浮，直至完全分散。根据文本方案配制新鲜的提取试剂。加入 300 微升提取试剂，最大速度涡旋振荡 5 分钟。

将离心管在18000 × g条件下离心2分钟，小心吸取下层水相至新离心管中。接着，通过真空离心干燥至少3小时，以干燥最终的水相组分。之后，将沉淀在50 µL水中通过超声处理充分分散，并将样品储存在20 °C条件下。

最后，取两微升样品加入到含有四毫升闪烁液的6毫升聚乙烯闪烁瓶中，使用液体闪烁计数器在开放窗口条件下测定样品的放射性，记录闪烁瓶的每分钟计数（CPM）。为建立用于分离氚标记甘油-肌醇脂的高效液相色谱（HPLC）系统，请根据文本方案预先配制缓冲液A和缓冲液B，并准备色谱柱。

接下来，将样品的1000万CPM加入一个配有弹簧式250微升内衬管的2毫升进样瓶中，并加入水至总体积为55微升。用带有聚四氟乙烯（PTFE）硅胶隔垫的螺旋盖密封小瓶，并将其连同另一个装有水空白对照的类似小瓶一起放入高效液相色谱（HPLC）系统的自动进样盘中。利用HPLC系统上的软件，设定洗脱程序。

1% 缓冲液 B 洗脱 5 分钟，1% 至 20% 缓冲液 B 梯度洗脱 40 分钟，20% 至 100% 缓冲液 B 梯度洗脱 10 分钟，100% 缓冲液 B 洗脱 5 分钟，100% 至 1% 缓冲液 B 洗脱 20 分钟，然后 1% 缓冲液 B 平衡 10 分钟。在 90 分钟内将泵流速设置为 1.0 毫升/分钟，压力限值设为 400 bar。随后在流式闪烁检测器上设置检测程序，运行 60 分钟，闪烁液流速为 2.5 毫升/分钟，驻留时间为 8.57 秒。

接下来，在高效液相色谱仪（HPLC）上设置自动进样程序，首先运行水空白，执行平衡程序，随后对放射性标记的样品执行洗脱程序。在平衡程序完成之前，于流动闪烁检测器上创建批处理序列，使用检测程序测量所有样品，该检测程序由洗脱程序触发。为分析HPLC数据，首先使用色谱定量分析软件打开每个样品的原始数据文件。

在色谱图标签页中，放大以拉伸较小的峰，同时保持时间分辨率。使用添加 ROI 工具标出每个峰以进行分析，然后根据其洗脱时间鉴定各峰。通过区域表标签页定位并记录每个峰的面积。

同时，记录下每个峰的起始时间和结束时间。接下来，通过选中紧邻峰的区域（时间跨度与峰相同）进行背景扣除。使用电子表格软件，将该区域的计数值从相应峰的计数值中减去。

将每个峰面积相对于亲本甘油化肌醇峰进行归一化，并记录为亲本磷脂酰肌醇的百分比。然后将每种实验条件下的各峰相对于对照条件进行归一化，并表示为相对于对照的最终倍数变化。通过点击“文件”，选择“另存为”，并选用CSV格式导出文件。

最后，在电子表格程序中打开 CSV 文件以绘制数据。放射性标记的酵母磷脂酰肌醇通过高效液相色谱法（HPLC）进行分析。由于酵母细胞仅生成四种磷脂酰肌醇，因此可采用一小时双梯度洗脱方法实现分离。

在八到九分钟处出现的甘油化肌醇峰掩盖了其他所有磷酸化物质的信号。因此，在对放射性信号进行积分之前，必须放大包含其他峰的图谱部分。采用该HPLC方法检测了野生型、ATG18基因缺失和VAC14基因缺失的酵母菌株中磷脂酰肌醇3,5-二磷酸的含量变化。

ATG18 缺失突变体被证明产生的磷脂酰肌醇3,5-二磷酸最多，而 VAC14 缺失突变体产生的最少。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四天内完成。在进行该实验时，重要的是要根据特定的酵母菌株或细胞类型优化生长和标记条件。

在完成本实验步骤后，可结合其他方法（如GFP融合型生物传感器）来补充HPLC流动闪烁计数法对磷脂酰肌醇的检测。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对磷脂酰肌醇进行放射性标记、提取，并通过高效液相色谱-流动闪烁计数联用技术进行测定。请务必注意，操作放射性物质和有机溶剂具有极高的危险性，进行本实验时必须采取适当防护措施，例如穿戴个人防护装备并接受正规培训。