Name: 放射性标记和磷酸肌醇的细胞水平的定量高效液相色谱耦合流动闪烁 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T14:00:01.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学习使用高效液相色谱耦合流动闪烁技术定量检测细胞中磷酸肌醇水平的方法。该技术通过放射性标记、提取和脱酰化步骤，可准确测量酵母和哺乳动物细胞中所有磷酸肌醇物种的丰度变化。

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C.Y.H. 获得了安大略省政府安大略研究生奖学金的资助。本文的研究工作由 R.J.B. 获得加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大研究主席计划以及怀雅逊大学的资助支持。

注意：以下内容详细描述了一种在酵母中测定磷脂酰肌醇磷酸（PtdInsPs）的方法。该方法提供了用3H-myo-肌醇标记酵母细胞、提取并去酰化脂质，以及通过高效液相色谱（HPLC）洗脱程序分离和定量去酰化PtdInsPs的实验细节。请注意，在哺乳动物细胞中对PtdInsPs进行标记、去酰化、分离和定量需要优化条件，并采用更长的HPLC洗脱梯度。这些细节可参见其他文献，尽管我们将在讨论部分简要介绍其中一些方面。总体而言，本文给出了从酵母中提取脂质、去酰化并提取水溶性甘油肌醇磷酸（Gro-InsPs）的方法，并在图1中进行了图示说明。
1. 酵母中PtdInsPs的标记与分析方案
<ol>
	<li>细胞培养与放射性标记
	<ol>
		<li>在完全合成培养基中，于30 °C恒定振荡条件下培养20 ml酵母菌株SEY6210的液体培养物，至对数中期，即在600 nm处的光密度（OD600）约为0.6–0.7。 
		注意：请勿使用YPD培养基，因其可能影响3H-myo-肌醇的掺入。此培养体积应足以支持2–3次HPLC运行。</li>
		<li>通过在12 ml圆底管中以800 × g离心5分钟，收集总计10–14 OD的酵母细胞（注意：1 ml OD600 = 1的培养液约含~1×107个细胞）。用2 ml无肌醇培养基（IFM）重悬沉淀（IFM成分见表1）。</li>
		<li>重复离心并吸除培养基。用440 µl IFM重悬沉淀，并在室温&#160;孵育15分钟。</li>
		<li>向每个样品中加入60 µl 3H-myo-肌醇（1 µl = 1 µCi），在30 °C培养温度下持续振荡孵育1至3小时。 
		注意：3H-myo-肌醇为放射性物质，须经适当培训后方可操作。此外，所有接触含3H材料的耗材均应妥善处理，并标记为放射性废物。 
		注意：只要所有待比较菌株均在相同温度下培养，生长温度可根据需要调整。</li>
		<li>将500 µl细胞悬液转移至含有500 µl 9%高氯酸和200 µl酸洗玻璃珠的微量离心管中。颠倒混匀，并在冰上孵育5分钟。</li>
		<li>在最高速度下涡旋震荡10分钟，使用加样枪头将裂解液转移至新的微量离心管中，避免转移玻璃珠。</li>
		<li>在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，收集沉淀，并吸除上清液。</li>
		<li>通过水浴超声在1 ml冰冻的100 mM EDTA中重悬沉淀，然后如前再次离心收集沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去酰化与提取
	<ol>
		<li>现配5.0 ml去酰化试剂：将2.3 ml甲醇、1.3 ml 40%甲胺、0.55 ml 1-丁醇和0.80 ml水混合，颠倒混匀。</li>
		<li>吸除EDTA溶液，并将沉淀在50 µl水中进行超声处理。</li>
		<li>加入500 µl去酰化试剂，超声混匀，在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>在53 °C金属浴中加热脂质50分钟。通过真空离心在3小时或过夜（O/N）内将样品完全干燥。
		<ol>
			<li>确保在真空离心机与真空泵之间安装化学捕集装置，以防止蒸气进入空气。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过水浴超声用300 µl水重悬沉淀，在室温下孵育20分钟。通过真空离心干燥样品3小时或过夜（O/N）。重复此步骤一次。</li>
		<li>用450 µl水对沉淀进行超声处理。此为提取过程中的水相。</li>
		<li>现配10 ml提取试剂：加入8.0 ml 1-丁醇、1.6 ml乙醚和0.40 ml甲酸乙酯，颠倒混匀。</li>
		<li>向水相中加入300 µl提取试剂。在最高速度下涡旋震荡5分钟，并以最高速度（18,000 × g）离心2分钟以分离两相。</li>
		<li>收集下层水相至新的微量离心管中，避免接触上层有机相、界面及沉淀。使用新鲜提取试剂对水相再提取两次。</li>
		<li>通过真空离心将收集的水相完全干燥。通过水浴超声将沉淀分散于50 µl水中。</li>
		<li>将每个样品取2 µl加入含4 ml闪烁液的6 ml聚乙烯闪烁瓶中。使用开放窗口的液体闪烁计数法测定各样品的计数（CPM）。</li>
		<li>将样品在-20 °C保存，直至进行HPLC分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过HPLC分离&#160;3H-甘油-肌醇磷酸酯
	<ol>
		<li>通过瓶顶式0.22 µm真空滤器过滤1 L超纯水制备缓冲液A，随后进行脱气处理。</li>
		<li>通过将1 L水溶液中加入1 M磷酸氢二铵（APS，分子量132.06）并用磷酸调节pH至3.8，制备缓冲液B。使用瓶顶式0.22 µm真空滤器过滤磷酸氢二铵溶液，随后进行脱气处理。</li>
		<li>通过在2 ml小瓶中装配弹簧加载的250 µl小体积插入件组装进样瓶。加入1000万CPM样品，并加水至总体积为55 µl。另准备一个含55 µl水的空白对照瓶。</li>
		<li>使用带有PTFE/硅胶隔垫的螺旋盖密封小瓶（红色面朝向瓶内）。将每个小瓶放入HPLC自动进样盘中，起始为空白对照瓶。</li>
		<li>使用可控制缓冲液流速、缓冲液脱气及样品进样的HPLC系统及其配套软件。使用在线流动闪烁检测器及其配套软件调节闪烁液流速并监测3H衰变信号。
		<ol>
			<li>在HPLC系统中使用尺寸为250 mm × 4.6 mm、填料为5 µm硅胶树脂的SAX液相色谱柱。安装柱保护装置，防止污染物进入色谱柱。</li>
			<li>在流动闪烁检测器中安装适用于3H检测的500 µl流通池。 
			注意：分离可使用由Chemstation软件控制的Agilent 1200 infinity系列HPLC系统或其他市售HPLC系统完成。HPLC洗脱液的流动闪烁检测可使用由Laura软件控制的β-RAM流动闪烁检测器或其他市售流动闪烁检测器或兼容软件完成。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将四元泵初始化为1.0 ml/min流速，使用100%缓冲液A。</li>
		<li>在HPLC上设置平衡程序以控制缓冲液A与B的梯度（称为&#34;程序A平衡&#34;）：1%缓冲液B维持5分钟，1–100% B梯度5分钟，100% B维持5分钟，100–1% B梯度5分钟，1% B维持20分钟。设定压力上限为400 bar，流速1.0 ml/min，运行时间30分钟。</li>
		<li>在HPLC上设置洗脱程序（图2），以控制缓冲液A与B的梯度（称为&#34;程序A&#34;）：1% B维持5分钟，1–20% B梯度40分钟，20–100% B梯度10分钟，100% B维持5分钟，100–1% B梯度20分钟，1% B维持10分钟。设定压力上限为400 bar，流速1.0 ml/min，运行时间90分钟。</li>
		<li>在流动闪烁检测器上设置检测程序（称为&#34;程序A检测&#34;），运行60分钟，闪烁液流速为2.5 ml/min，驻留时间为8.57秒。</li>
		<li>在HPLC上编程自动进样序列，起始为水空白对照，运行&#34;程序A平衡&#34;，随后依次运行各放射性标记样品的&#34;程序A&#34;。准备就绪后启动序列。</li>
		<li>在运行仍处于平衡程序期间，在流动闪烁检测器上创建批次，使用&#34;程序A检测&#34;测量所有样品。每个新样品的进样将触发HPLC启动&#34;程序A&#34;，同时启动流动闪烁检测器执行&#34;程序A检测&#34;。</li>
		<li>所有运行结束后，以1.0 ml/min流速用100%缓冲液A冲洗HPLC系统、色谱柱及流动闪烁检测器30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>使用Laura软件或任何可量化色谱图谱的软件进行分析。本节所述步骤见图3。</li>
		<li>点击&#34;文件&#34;、&#34;打开&#34;，选择各样品的原始数据文件以打开。</li>
		<li>在&#34;色谱图&#34;标签页中，放大以拉伸各较小峰（约1000计数[y轴]），同时保持时间分辨率。必要时可单独放大每个峰。</li>
		<li>使用&#34;添加ROI&#34;工具标出各峰用于分析。根据洗脱时间识别各峰：亲本Gro-Ins在10分钟，Gro-Ins3P在18分钟，Gro-Ins4P在20分钟，Gro-Ins(3,5)P2在29分钟，Gro-Ins(4,5)P2在32分钟。</li>
		<li>在&#34;区域表格&#34;标签页中，记录各峰的&#34;面积（计数）&#34;。记录各峰的&#34;起始时间（mm:ss）&#34;和&#34;结束时间（mm:ss）&#34;。</li>
		<li>为进行背景扣除，标出与峰相邻且时间跨度相同的区域，从对应峰的计数中减去该区域的计数。</li>
		<li>将各峰面积相对于亲本Gro-Ins进行归一化（表示为&#34;%总PtdIns&#34;）。然后将各实验条件下的各峰相对于对照条件进行归一化（表示为&#34;相对于对照的n倍增加&#34;）。 
		注意：各峰也可相对于总计数进行归一化，但由于亲本Gro-Ins远比其他所有PtdInsPs丰富，结果通常相似。</li>
		<li>点击&#34;文件&#34;、&#34;另存为…"，选择&#34;CSV（逗号分隔）&#34;文件格式，导出色谱图数据。在电子表格中绘图并按需呈现结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文详细介绍了利用高效液相色谱-流动闪烁计数法测定酵母细胞中磷脂酰肌醇多磷酸（PtdInsPs）水平的实验方案。该方法通过用3H-myo-肌醇对PtdInsPs进行代谢标记，随后进行脂质处理，提取水溶性的3H-甘油肌醇磷酸（Gro-InsPs），再经高效液相色谱（HPLC）分离和分析。利用该方法可定量测定不同条件下细胞中PtdInsPs的相对水平，文中以野生型、vac14D和atg18D酵母细胞中PtdIns(3,5)P2的检测为例进行了展示（图4）。
为优化结果和/或进行故障排除，可采取若干关键步骤和改进措施。实现PtdInsPs可靠定量的最重要参数之一是总放射性信号水平。通常，向高效液相色谱（HPLC）中注入300万至500万计数通常足以可靠地定量较高丰度的PtdInsP种类，例如PtdIns(4,5)P2。然而，对于较低丰度的种类如PtdIns(3,5)P2的定量，可能需要注入高达...

磷脂酰肌醇磷酸盐（PtdInsPs）是一类重要的信号传导磷脂，可调控多种细胞功能，包括信号转导、膜运输和基因表达，从而进一步调节细胞分裂、细胞器特性及代谢活性等高级细胞行为1-3。PtdInsPs共有七种，均由母体磷脂磷脂酰肌醇（PtdIns）的肌醇头部基团在3、4和/或5位点发生磷酸化而生成。重要的是，这七种PtdInsPs在细胞内的分布并不均匀，每种PtdInsP的局部浓度可在特定亚细胞位点动态升高或降低，并与一组特定的效应蛋白结合，共同决定其所在膜结构的身份与功能3,4。此外，每种PtdInsP的水平必须受到严格调控，因为其浓度变化会显著影响PtdInsP所产生的信号强度。每种PtdInsP的定位和水平取决于多种脂质激酶、磷酸酶和磷脂酶的靶向定位与活性，这些酶共同介导了各PtdInsP的合成与降解3,4。因此，PtdInsP调控机制的失调可能干扰细胞正常功能，导致癌症和退行性疾病等疾病的发生2,5,6。为了全面理解PtdInsPs及其调控机制的功能与作用，研究人员已开发出基于显微镜和生物化学的技术，用于追踪和定量检测PtdInsPs。
在许多情况下，磷脂酰肌醇磷酸盐（PtdInsPs）通过特定的蛋白质结构域与其效应蛋白结合7-9。这些蛋白质模块在与完整蛋白质分离表达时，通常仍能保持其正确的折叠构象和脂质识别特性。这一特性促使研究人员将特定的PtdInsP结合蛋白结构域与荧光蛋白（FP）（如绿色荧光蛋白GFP）融合，从而构建出用于显微镜下亚细胞定位检测PtdInsPs的探针。事实上，已有大量研究利用FP融合的PtdInsP结合蛋白模块，通过活细胞成像技术来鉴定特定PtdInsP分子的定位与动态变化1,10。例如，磷脂酶C δ1（PLCδ1）的Pleckstrin同源（PH）结构域与GFP融合后，可特异性识别质膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸[PtdIns(4,5)P2]；而早期核内体抗原1（EEA1）FYVE结构域的串联重复拷贝则被用于追踪核内体上的磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns3P）10-13。总体而言，基于显微镜的技术在可视化PtdInsP的定位和动态方面具有显著优势，但也存在若干局限性，例如PtdInsP结合结构域可能除了目标PtdInsP分子外还与其他因子相互作用，且无法检测FP探针胞质荧光背景以下的信号变化。
薄层色谱、质谱分析和放射性同位素标记等生化技术也可用于表征和定量各种磷脂酰肌醇磷酸（PtdInsP14-16）的水平。这些方法需要先分离脂质，以检测细胞内PtdInsPs的含量。质谱分析可用于分析脂质提取物中的磷脂，并在确定PtdInsPs酰基链组成方面具有重要价值14,17。然而，质谱分析主要是半定量的，且仍难以分辨并同时定量分子量相同的PtdInsP种类14,17。相比之下，对PtdInsPs进行放射性同位素标记，随后结合高效液相色谱（HPLC）与流动闪烁检测的方法，可用于同时分离和定量全部七种PtdInsPs物种18。使用强阴离子交换（SAX）柱的HPLC可根据分子量、电荷和分子形状实现分离，从而能够对即使具有相同分子量和电荷的去酰基PtdInsPs（Gro-InsPs）进行分馏。将HPLC洗脱液与流动闪烁探测器联用后，可为每种Gro-InsPs物种生成基于放射性的信号峰，其相对于原始的甘油-肌醇（Gro-Ins）前体分子18。这最终对应于细胞中PtdInsPs的相对含量。
PtdInsPs 的放射性标记以及与高效液相色谱联用的流式闪烁检测是一种有效的工具，可用于研究磷脂酰肌醇 3,5-二磷酸 [PtdIns(3,5)P2] 的调控机制与生物学功能，该分子仅占全部磷脂酰肌醇约 0.1–0.3%16,19,20。PtdIns(3,5)P2 的合成由一种磷脂酰肌醇 3-磷酸 5-激酶催化，在酵母中称为 Fab1，在哺乳动物中称为 PIKfyve21。该反应可被一种 PtdIns(3,5)P2 5-磷酸酶所拮抗，在酵母中称为 Fig4，在哺乳动物中称为 mFig4/Sac322–24。有趣的是，PIKfyve/Fab1 和 mFig4/Fig4/Sac3 均存在于同一复合物中，并由支架适配蛋白 Vac14（酵母）或 mVac14/ArPIKfyve（哺乳动物）进行调控25,26。在缺失VAC14的酵母细胞中，Fab1 无法有效发挥作用，导致 PtdIns(3,5)P2 水平下降约 90%27,28。另一方面，Atg18 是一种 PtdIns(3,5)P2 的效应蛋白，可能参与调控液泡分裂29。Atg18 同时也是 PtdIns(3,5)P2 的负调控因子，因为敲除其基因ATG18会导致 PtdIns(3,5)P2 水平升高 10 至 20 倍29,30。总体而言，PtdIns(3,5)P2 水平的变化会严重影响酵母液泡和哺乳动物溶酶体的功能，从而影响膜运输、吞噬体成熟、自噬以及离子转运等生物学过程6,19,21,31。
本文描述了在酵母中使用3H-myo-肌醇对磷脂酰肌醇磷酸（PtdInsPs）进行放射性同位素标记的过程，以检测野生型、vac14Δ 和atg18Δ酵母菌株中PtdIns(3,5)P2的相对水平。以此为例，展示了高效液相色谱（HPLC）分离不同PtdInsPs组分的分辨能力，以及流动闪烁检测法对痕量3H-myo-肌醇检测的灵敏度。我们还详细阐述了如何优化从哺乳动物细胞中提取和分离3H标记的PtdInsPs的方法，因为这些细胞含有全部七种PtdInsPs分子，其样品通常更为复杂。

<table><tbody><tr><td>1-丁醇</td><td>Biobasic</td><td>BC1800</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>磷酸氢二铵</td><td>Bioshop</td><td>APD001</td><td>ACS级</td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Biobasic</td><td>ADB0060</td><td>超纯级</td></tr><tr><td>自动进样器</td><td>Agilent</td><td>G1329B</td><td>Agilent 1260 infinity系列</td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Biobasic</td><td>BB0044</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Biobasic</td><td>CT1330</td><td>无水，工业级</td></tr><tr><td>泛酸钙</td><td>Sigma</td><td>C8731</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜(II)</td><td>Sigma</td><td>451657</td><td>无水</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Biobasic</td><td>GB0219</td><td>无水，生物技术级</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Life</td><td>11995-065</td><td>含4.5 g/L葡萄糖、110 mg/L丙酮酸钠、L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>MP biomedicals</td><td>0916429&amp;nbsp;</td><td>含4.5 g/L葡萄糖，不含L-谷氨酰胺，不含肌醇</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biobasic</td><td>EB0107</td><td>无酸，超纯级</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Caledon labs</td><td>1/10/4700</td><td>无水，试剂级</td></tr><tr><td>甲酸乙酯</td><td>Sigma</td><td>112682</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Wisent</td><td>080-450</td><td>美国来源，优质，热灭活</td></tr><tr><td>透析胎牛血清</td><td>Life</td><td>26400044</td><td>美国来源</td></tr><tr><td>FlowLogic U</td><td>LabLogic Systems Ltd</td><td>SG-BXX-05</td><td>用于流式闪烁计数的闪烁液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>叶酸</td><td>Biobasic</td><td>FB0466</td><td>USP级</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Life</td><td>15630080</td><td>1 M溶液</td></tr><tr><td>肌醇, Myo-[2-3H(N)]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET114005MC</td><td>乙醇与水比例为9:1</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺</td><td>Life</td><td>51500056</td><td>100倍浓缩液</td></tr><tr><td>氯化铁(III)</td><td>Sigma</td><td>157740</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>Laura - 色谱数据采集与分析软件</td><td>LabLogic Systems Ltd</td><td>版本 4.2.1.18</td><td>流式闪烁计数软件</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>200&amp;nbsp;mM溶液，经无菌过滤，BioXtra，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>无水</td></tr><tr><td>硫酸锰</td><td>Biobasic</td><td>MB0334</td><td>一水合物，ACS级</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Caledon labs</td><td>6701-7-40</td><td>HPLC级</td></tr><tr><td>甲胺溶液</td><td>Sigma</td><td>426466</td><td>40% (v/v)</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Biobasic</td><td>PB0445</td><td>无水，ACS级</td></tr><tr><td>烟酸</td><td>Biobasic</td><td>NB0660</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>OpenLAB CSD ChemStation&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>版本 C.01.03&amp;nbsp;</td><td>HPLC软件</td></tr><tr><td>对氨基苯甲酸 (PABA)</td><td>Bioshop</td><td>PAB001.100</td><td>游离酸</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100倍浓缩液，液体，稳定化处理，经无菌过滤，细胞培养测试合格</td></tr><tr><td>高氯酸</td><td>Sigma</td><td>244252</td><td>ACS试剂，70%</td></tr><tr><td>PhenoSpher SAX色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>00G-315-E0</td><td>5 &amp;micro;m, 80 &amp;Aring;, 250 x 4.6 mm</td></tr><tr><td>磷酸</td><td>Caledon labs</td><td>1/29/8425</td><td>试剂级</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Biobasic</td><td>PB0440</td><td>ACS级</td></tr><tr><td>碘化钾</td><td>Biobasic</td><td>PB0443</td><td>ACS级</td></tr><tr><td>盐酸吡哆辛</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>四元泵</td><td>Agilent</td><td>G1311C</td><td>Agilent 1260 infinity系列</td></tr><tr><td>核黄素</td><td>Bioshop</td><td>RIB333.100</td><td>USP级</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Biobasic</td><td>DB0483</td><td>生物技术级</td></tr><tr><td>钼酸钠</td><td>Sigma</td><td>243655</td><td></td></tr><tr><td>温控柱温箱</td><td>Agilent</td><td>G1316A</td><td>Agilent 1260 infinity系列</td></tr><tr><td>盐酸硫胺素</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td>试剂级；配制成0.02% (w/v)溶液，形成悬浮液，混合后分装并冷冻</td></tr><tr><td>Ultima Gold</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013321</td><td>用于液体闪烁计数的闪烁液</td></tr><tr><td>硫酸锌</td><td>Biobasic</td><td>ZB2906</td><td>七水合物，试剂级</td></tr><tr><td>&amp;beta;-RAM 4</td><td>IN/US systems</td><td>型号 4</td><td>流式闪烁计数器 - 500 &amp;micro;l流通池；可选Perkin Elmer的Radiomatic流式闪烁分析仪&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

放射性标记及通过高效液相色谱-流式闪烁法定量细胞内磷脂酰肌醇磷酸酯水平

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

磷脂酰肌醇（PtdInsPs）是一类重要的信号脂质，能够招募特定的效应分子，并赋予细胞器分子特异性和功能。七种不同的PtdInsPs在分布和丰度上各不相同，其水平由特定的激酶和磷酸酶严格调控。PtdInsPs的含量可在多种信号事件发生或调控机制受到干扰时迅速发生变化。为了理解这些事件如何引起PtdInsPs含量的变化及其后续影响，量化信号事件前后或正常与异常条件之间PtdInsPs的水平显得尤为重要。然而，由于PtdInsPs含量极低且结构相似，准确测定每种PtdInsPs的相对含量具有挑战性。本文介绍了一种通过代谢标记法量化PtdInsPs水平的方法：利用3H-myo-肌醇对细胞进行标记，该同位素可被整合入PtdInsPs中。随后沉淀磷脂并进行去酰化处理，生成可溶性的3H-甘油-肌醇衍生物，进一步提取后通过高效液相色谱法（HPLC）分离，并利用流动闪烁检测法进行检测。文中详细描述了酵母样品的标记与处理流程，以及HPLC和流动闪烁检测仪的仪器设置。尽管该方法会丢失有关酰基链组成的信息，但其灵敏度高，且可优化以同时定量细胞中全部七种PtdInsPs。

采用该方法，利用3H-myo-肌醇对酵母磷脂酰肌醇磷酸酯（PtdInsPs）进行代谢标记。标记完成后，用高氯酸沉淀磷酸脂，随后进行磷酸脂去酰基化，并提取水溶性的甘油肌醇磷酸酯（Gro-InsPs）（图1）。在此阶段，必须通过液体闪烁计数对提取出的Gro-InsPs所携带的总放射性信号进行定量，以确保极低丰度的PtdInsPs（如PtdIns(3,5)P2）具有足够的信噪比；总放射性计数应为500万至1000万CPM，方可进样。由于酵母细胞中仅存在四种PtdInsPs，因此采用1小时洗脱法即可实现有效分离（图2）。
本研究中标记并处理了野生型、atg18Δ 和 vac14Δ 酵母突变体，以分析 PtdIns(3,5)P2 的变化情况，后者是酵母中含量最少的磷脂酰肌醇磷酸...

磷脂酰肌醇是一类信号脂质，其相对丰度会因各种刺激而迅速发生变化。本文介绍了一种通过代谢标记法使用3H-myo-肌醇标记细胞，随后进行提取和去酰化，以测定磷脂酰肌醇丰度的方法。提取的甘油-肌醇脂质随后通过高效液相色谱分离，并通过流动闪烁法进行定量。

磷脂酰肌醇（PtdInsPs）是一类重要的信号脂质，负责招募特定效应分子，并赋予细胞器以分子特异性……

本实验的总体目标是在不同的遗传和环境条件下测定细胞中各种磷脂酰肌醇分子的含量，以理解磷脂酰肌醇的功能及其调控机制。磷脂酰肌醇类脂质调控细胞的多种功能，如细胞迁移、复制以及记忆相关物质的转运。本方法可鉴定影响磷脂酰肌醇的遗传和环境因素，从而增进我们对其调控机制与生物学功能的认识。该技术的主要优势在于能够准确实时地同时测量细胞内所有磷脂酰肌醇。尽管该方法可为酵母中磷脂酰肌醇的调控研究提供见解，也可应用于培养的哺乳动物细胞。由于标记、处理和分析步骤繁多，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难。我们建议先不使用放射性标记进行练习。首先，在30°C下，于完全合成培养基中振荡培养20毫升的酵母菌株SEY6210液体培养物，直至进入对数中期。接着，将总共10至14 OD的酵母细胞转移至一个12毫升的圆底离心管中，并在800 × g下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 2 毫升无肌醇培养基中，再次离心细胞。然后将沉淀重悬于 440 µL 无肌醇培养基中。在室温下孵育细胞 15 分钟。孵育结束后，加入 60 µL ³H 标记的 myo-肌醇，并在 30 °C 下持续振荡培养细胞额外 1 至 3 小时。将细胞悬液转移至含有500 µL 9%高氯酸和200 µL酸洗玻璃珠的微量离心管中。通过反复倒置试管混匀，然后在冰上孵育5分钟。随后，以最大速度涡旋振荡试管10分钟。然后使用加样枪头将裂解液转移至新的微量离心管中，避免吸入玻璃珠。接着离心试管并弃去上清液。用1毫升冰预冷的100毫摩尔EDTA重悬沉淀，直至完全分散，再次离心。离心后，吸除含有放射性标记沉淀的试管中的EDTA。加入50 µL水，超声处理以重新悬浮沉淀。根据文本方案配制新鲜的去酰基化试剂。然后向管中加入 500 µL 去酰基化试剂，超声混匀。将样品在室温下孵育 20 分钟。接着，将样品转移至 53 °C 的加热块中，加热 50 分钟。随后，将样品放入真空离心机中，干燥至少三小时。用 300 微升水超声重悬沉淀，并在室温下孵育 20 分钟。之后，再次将样品在真空离心机中彻底干燥，至少三小时。干燥后，向离心管中加入 450 微升水，通过超声处理使沉淀重新悬浮，直至完全分散。根据文本方案配制新鲜的提取试剂。加入 300 微升提取试剂，最大速度涡旋振荡 5 分钟。将离心管在18000 × g条件下离心2分钟，小心吸取下层水相至新离心管中。接着，通过真空离心干燥至少3小时，以获得最终的水相组分。随后，在50 µL水中通过超声处理充分分散沉淀物，并将样品储存在20 °C条件下。最后，取两微升样品加入到含有四毫升闪烁液的6毫升聚乙烯闪烁瓶中，使用液体闪烁计数器在开放窗口条件下测定样品的放射活性，并记录闪烁瓶的每分钟计数（CPM）。为建立用于分离氚标记甘油-肌醇脂质的高效液相色谱系统，请根据文本方案预先配制缓冲液A和缓冲液B，并准备色谱柱。接下来，将样品的 1000 万 CPM 加入一个配有弹簧式 250 微升衬管的 2 毫升进样瓶中，并加入水使总体积达到 55 微升。用带有聚四氟乙烯硅胶隔垫的螺旋盖密封小瓶，并将其连同装有水空白的类似小瓶一起放入 HPLC 系统的自动进样盘中。使用 HPLC 系统的软件，设定洗脱程序。1% 缓冲液 B 处理 5 分钟，1% 至 20% 缓冲液 B 处理 40 分钟，20% 至 100% 缓冲液 B 处理 10 分钟，100% 缓冲液 B 处理 5 分钟，100% 至 1% 缓冲液 B 处理 20 分钟，随后 1% 缓冲液 B 处理 10 分钟。设定泵流速为 1.0 毫升/分钟，持续 90 分钟，压力限值设为 400 bar。随后设置流式闪烁检测程序，运行 60 分钟，闪烁液流速为 2.5 毫升/分钟，停留时间为 8.57 秒。接下来，在高效液相色谱仪上编程设置自动进样序列，首先运行水空白并执行平衡程序，随后对放射性标记样品执行洗脱程序。在平衡程序完成之前，在流式闪烁计数器上创建批处理序列，使用检测程序测量所有样品，该检测程序由洗脱程序触发。为分析高效液相色谱数据，首先使用色谱定量软件打开每个样品的原始数据文件。在色谱图选项卡中，放大以拉伸较小的峰，同时保持时间分辨率。使用添加 ROI 工具标出每个峰以进行分析，然后根据其洗脱时间鉴定各峰。使用区域表选项卡定位并记录每个峰的面积。同时，记录每个峰的起始时间和结束时间。接下来，通过选中紧邻峰且时间跨度相同的区域，对每个峰进行背景扣除。使用电子表格软件，将该区域的计数值从相应峰的计数值中减去。将每个峰面积相对于亲本甘油化肌醇峰进行归一化，并记录为亲本磷脂酰肌醇的百分比。然后将每种实验条件下的各峰相对于对照条件进行归一化，并表示为相对于对照的最终倍数变化。通过点击文件、另存为，并选择CSV格式来导出文件。最后，在电子表格程序中打开CSV文件以绘制数据。放射性标记的酵母磷脂酰肌醇分析采用高效液相色谱法（HPLC）进行。由于酵母细胞仅生成四种磷脂酰肌醇，可通过一小时双梯度洗脱方法实现分离。在八到九分钟处出现的甘油化肌醇峰掩盖了其他所有磷酸化物质的信号。因此，在对放射性信号进行积分之前，必须放大包含其他峰的图谱部分。采用该高效液相色谱法检测了野生型、ATG18基因缺失和VAC14基因缺失的酵母菌株中磷脂酰肌醇3,5-二磷酸的含量变化。ATG18 缺失突变体产生的磷脂酰肌醇3,5-二磷酸最多，而 VAC14 缺失突变体产生的最少。只要掌握得当，正确操作可在四天内完成该技术。在进行该实验时，重要的是要根据特定的酵母菌株或细胞类型优化生长和标记条件。在完成本实验步骤后，可结合其他方法（如GFP融合型生物传感器）来补充HPLC流动闪烁检测法对磷脂酰肌醇类物质的检测。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过放射性标记、提取并利用HPLC耦合流动闪烁法测定磷脂酰肌醇类物质。请注意，操作放射性物质和有机溶剂具有极高危险性，实验过程中必须始终采取相应防护措施，例如穿戴个人防护装备并接受适当的培训。

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科研

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化学

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定量流式细胞术研究标记蛋白与磷脂囊泡相互作用

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磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，质膜，单分子成像，超分辨率显微镜，荧光探针

本文介绍了一种基于微流控平台的支撑脂双层，用于通过基于pH调节的无标记方法研究蛋白质与磷脂酰肌醇之间的相互作用。...

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通过亲和层析联合蛋白质印迹或质谱法鉴定肌醇磷酸或磷脂酰肌醇相互作用蛋白

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基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法

本文描述了一种用于对哺乳动物细胞提取物中的肌醇焦磷酸盐进行绝对定量的毛细管电泳-电喷雾电离质谱分析方法。...

毛细管电泳电喷雾电离质谱法对肌醇焦磷酸的绝对定量

本文介绍了一组用于表征蛋白质与细胞或微囊泡膜相互作用的方法。...

使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用

学习使用高效液相色谱耦合流动闪烁技术定量检测细胞中磷酸肌醇水平的方法。该技术通过放射性标记、提取和脱酰化步骤，可准确测量酵母和哺乳动物细胞中所有磷酸肌醇物种的丰度变化。

放射性标记及通过高效液相色谱-流式闪烁法定量细胞内磷脂酰肌醇磷酸酯水平

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