放射性标记和磷酸肌醇的细胞水平的定量高效液相色谱耦合流动闪烁

该程序的总体目标是在各种遗传和环境条件下测量细胞中每种磷酸肌醇种类的量，以了解磷酸肌醇的功能和调节。磷酸肌醇脂质控制细胞功能，如迁移、复制和内存运输。这种方法确定了影响磷酸肌醇的遗传和环境条件，并增加了我们对它们的调节和功能的了解。

该技术的主要优点是它允许准确、同时测量细胞内的所有磷酸肌醇。虽然这种方法可以深入了解酵母中磷酸肌醇的调节，但它也可以应用于培养的哺乳动物细胞。由于标记、处理和分析需要许多步骤，因此不熟悉这种方法的人会遇到困难。

我们建议先在没有放射性标签的情况下练习。首先，在 30 摄氏度的完全合成培养基中培养 20 毫升酵母菌株SEY6210液体培养物，并不断摇动至对数中期。接下来，将总共 10 至 14 OD 的酵母细胞转移到 12 毫升圆底离心管中，并以 800 倍 G 离心 5 分钟。

倒出培养基。并将沉淀重悬于 2 毫升不含肌醇的培养基中。再次离心细胞。

然后将沉淀重新悬浮在 440 μL 无肌醇培养基中。将细胞在室温下孵育 15 分钟。孵育后，加入 60 微升氚标记的肌醇，并在 30 摄氏度下不断摇晃，使细胞再生长 1 到 3 小时。

将细胞悬液转移至含有 500 微升 9% 高氯酸和 200 微升酸洗玻璃珠的微量离心管中。通过反复倒置试管进行混匀，然后在冰上孵育 5 分钟。然后，以最大速度涡旋试管 10 分钟。

然后使用凝胶上样尖端将裂解物转移到新的微量离心管中，以避免吸出玻璃珠。接下来，离心管并丢弃上清液。在一毫升冰冷的 100 毫摩尔 EDTA 中对沉淀进行超声处理，直至其完全分散，然后再次离心。

离心后，从含有放射性标记沉淀的试管中吸出 EDTA。加入 50 微升水并超声处理以重新悬浮沉淀。根据文本方案制备新鲜的脱酰化试剂。

然后向试管中加入 500 μL 脱酰化试剂，并超声处理以混合。将样品在室温下孵育 20 分钟。接下来，将样品转移到 53 摄氏度的加热块中 50 分钟。

然后，将样品放入真空离心机中，并让其干燥至少三个小时。在 300 μL 水中超声处理，重新悬浮沉淀，并在室温下孵育 20 分钟。然后，在真空离心机中将样品完全干燥至少 3 小时。

干燥后，向试管中加入 450 μL 水，并通过超声处理重新悬浮沉淀，直至其完全分散。根据文本方案制备新鲜的提取试剂。加入 300 μL 提取试剂，以最大速度涡旋 5 分钟。

试管以 18000 倍 G 离心 2 分钟，然后小心地将底部水层移液到新试管中。接下来，通过真空离心干燥最终的水馏分至少 3 小时。然后，通过在 50 微升水中超声处理来完全分散沉淀，并将样品储存在 20 摄氏度。

最后，通过在 6 毫升聚乙烯闪烁瓶中加入 2 微升至 4 毫升闪烁液来确定样品的放射性。使用开窗的液体闪烁计数器记录样品瓶的 CPM。要设置HPLC系统以分离氚标记的甘油-肌醇，首先根据文本方案制备缓冲液A和B以及色谱柱。

接下来，将 1000 万 CPM 的样品装入一个装有弹簧加载的 250 μL 插入管的 2 mL 进样瓶中，并加水，总体积为 55 μL。用装有 PTFE 硅胶隔垫的螺旋盖盖住样品瓶，然后将其与类似样品瓶中的空白水一起放入 HPLC 系统的自动进样托盘中。使用 HPLC 系统上的软件，编写洗脱方案。

1% 缓冲液 B 5 分钟，1% 至 20% B 40 分钟，20% 至 100% B 10 分钟，100% B 5 分钟，100% 至 1% B 20 分钟，然后 1% B 10 分钟。将泵流速设置为 90 分钟内每分钟 1.0 毫升，压力极限为 400 bar。随后，在流动闪烁体上设置检测方案，使其运行 60 分钟，闪烁流体流速为每分钟 2.5 次，停留时间为 8.57 秒。

接下来，在 HPLC 上编程自动进样序列，从运行平衡方案的水空白开始，然后是洗脱方案中的放射性标记样品。在平衡方案完成之前，在流动闪烁体上创建一个批次序列，以使用由洗脱方案触发的检测方案测量所有样品。要分析 HPLC 数据，首先使用色谱仪定量软件打开每个样品的原始数据文件。

在 Chromatograms （色谱图） 选项卡中，放大以拉伸较小的峰，同时保持时间分辨率。使用添加 ROI 工具突出显示每个峰进行分析，然后根据其洗脱时间识别峰。使用 regions 表选项卡查找并记录每个峰的面积。

同时，记下每个峰值的开始和结束时间。接下来，通过突出显示与峰相邻的区域（跨越相同的时间）来对每个峰执行背景减法。使用电子表格软件，从相应峰的计数中减去该区域的计数数。

根据亲本甘油肌醇峰对每个峰的面积进行归一化，并记录为亲本磷脂酰肌醇的百分比。然后根据对照条件对每个实验条件中的每个峰进行归一化，并表示为与对照相比末端折叠增加。通过单击 文件（File） 和 另存为 （Save As），然后选择 CSV 格式来导出文件。

最后，在电子表格程序中打开 CSV 文件以绘制数据。放射性标记的酵母磷酸肌醇的分析采用 HPLC 进行。由于酵母细胞仅产生 4 个磷酸肌醇，因此可以通过 1 小时的双梯度洗脱法实现分离。

8 到 9 分钟的甘油肌醇峰掩盖了所有其他磷酸化物质的信号。因此，在积分放射性信号之前，有必要放大包含其他峰的迹线部分。使用这种 HPLC 方法测定野生型、ATG18 缺失和 VAC14 缺失酵母菌株的磷脂酰肌醇 3,5-二磷酸的变化。

ATG18 缺失突变体产生最多的磷脂酰肌醇 3,5-二磷酸，而 VAC14 缺失突变体产生最少。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在四天内完成。在尝试此程序时，请务必记住根据特定的酵母菌株或细胞类型优化生长和标记条件。

按照此程序，其他方法（如 GFP 熔融生物传感器）可用于补充 HPLC 流动闪烁以检测磷酸肌醇。观看本视频后，您应该对如何通过 HPLC 耦合流闪烁进行无线电标记、提取和测量磷酸肌醇有了很好的了解。不要忘记，使用放射性和有机溶剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备和进行适当的培训。