Name: 成像膜电位与基因编码荧光电压传感器的两种类型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习使用基因编码电压指示剂成像膜电位变化，比较单荧光蛋白与FRET探针的优缺点。该方法可实现神经活动的实时可视化，但需注意信噪比问题以获得准确结果。

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本工作由韩国国家研究基金会（NRF）的世界级研究所（WCI）项目资助，该项目由韩国教育科技部资助（项目编号：WCI 2009-003），以及韩国科学技术研究院机构项目（项目编号：2E24210）。Sungmoo Lee 获得韩国国家研究基金会（NRF）全球博士生奖学金项目（项目编号：NRF-2013H1A2A1033344）的资助，该项目隶属于韩国教育部（MOE）。

伦理声明：动物实验方案已获得韩国科学技术研究院（KIST）动物护理和使用委员会的批准，批准编号为2014-001。
1. 仪器设置
<ol>
	<li>成像装置设置
	<ol>
		<li>将倒置荧光显微镜放置于防振台上。使用高倍物镜（60倍油镜，数值孔径1.35）以及配备有适用于电压成像所用荧光蛋白的二向色镜和滤光片的滤光立方体。 
		注意：该装置采用倒置显微镜以使用数值孔径（NA）更高的物镜，但也可使用正置显微镜。实际上，倒置显微镜仅用于探针开发，因为较高数值孔径（NA）的物镜比低NA物镜收集更多的光，从而提高记录信号的信噪比（SNR；可定义为峰值光学信号除以基线荧光的标准偏差）。对于非探针开发者，我们推荐在脑片或活体组织成像等应用中使用正置显微镜 体内 记录。</li>
		<li>准备光源， 例如氙弧灯，配备机械快门，用于高效的落射荧光宽场成像。通过光导接口将光线引导至显微镜。光线将穿过激发滤光片，并由滤光立方体中的第一片二向色镜反射。调整光路，使样品在视野范围内获得均匀照明，并实现最大化的光照强度。 21. 
		注意：传统上使用75瓦的弧光灯，因为更高功率的灯泡会产生更大的照明区域，但亮度并不会增加。激光器可以使用，但仅限于单一波长。发光二极管（LEDs）的亮度正在不断提高，可能成为首选光源，因其可提供多种波长，且无需机械快门。</li>
		<li>将两台CCD相机按照图示方式安装到荧光显微镜上 图 2D. 
		注意：第一台CCD相机具有高空间分辨率，用于识别待测细胞质膜上表达GEVI的细胞。为成像膜电位变化，请确保第二台CCD相机具有高帧率，例如每秒1,000帧（fps）。使用双端口相机适配器（图 2D-(3)) 在两个CCD相机之间切换成像光路。在此装置中，使用一个缩小镜将物镜产生的图像适配到第二个CCD相机的CCD芯片上。 </li>
		<li>在第一台（慢速）和第二台（快速）CCD相机之间安装图像分光器，用于基于FRET的GEVI成像。插入一个滤光立方体，内含分色镜（560 nm）和两个发射滤光片（520 nm/40） &amp; 645 nm/75）置于图像分光器中。这将产生两个视野，一个用于供体荧光，另一个用于受体荧光。在对带有单个荧光蛋白的GEVI进行成像时，移除该第二个滤光立方体。 
		注意：本方法中测试的单荧光蛋白（FP）型基因编码电压指示剂为 Bongwoori，该指示剂使用荧光蛋白 super ecliptic pHluorin A227D（SE A227D）。激发滤光片（472 nm/30）、发射滤光片（497 nm/长通）和二向色镜（495 nm）的选择基于其激发和发射光谱 5通常，激发滤光片和发射滤光片应与荧光团光谱的相应部分具有最大的重叠，以获得明亮的图像，同时二向色镜应阻断任何透过发射滤光片的激发光。FRET 配对所用滤光片和二向色镜的选择 11 基于GEVI的记录遵循相同原理，但需要在图像分光器中增加第二个滤光立方体，以同时观察供体和受体的荧光。显微镜滤光盒中放置的第一个滤光立方体需配备激发滤光片（475 nm/23），用于激发Clover。两个荧光蛋白（FP）发出的荧光将通过第一块二向色镜（495 nm）传输至第二个滤光立方体。第二个滤光立方体包含一块二向色镜（560 nm）和两个发射滤光片（520 nm/40用于Clover，645 nm/75用于mRuby2），从而分离来自两种不同荧光蛋白的荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>基于单个荧光蛋白的基因编码电压指示剂 
			(Bongwoori)</td>
			<td>基于FRET配对的基因编码电压指示剂 
			(Nabi 2.42 &amp; Nabi 2.44)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">置于显微镜中的第一个滤光片组</td>
			<td>激发滤光片</td>
			<td>472 nm/30</td>
			<td>475 nm/23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二向色镜</td>
			<td>495 nm</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>发射滤光片</td>
			<td>497 nm/长通</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">置于光束分光器中的第二个滤光片组</td>
			<td>二向色镜</td>
			<td>-</td>
			<td>560 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>发射滤光片 1</td>
			<td>-</td>
			<td>520 nm/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>发射滤光片 2</td>
			<td>-</td>
			<td>645 nm/75</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于单荧光蛋白型GEVI和FRET型GEVI记录的两组不同滤光片
<ol start="2">
	<li>减振隔离
	<ol>
		<li>请勿将任何带有活动部件的设备安装在减振隔离台上。确保连接到非隔离设备的电缆保持松弛，以避免样品产生振动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜片钳记录浴槽
	<ol>
		<li>使用一片薄的#0盖玻片密封膜片钳记录浴槽底部，因为物镜的工作距离相对较小。这是倒置显微镜系统的一个缺点。 
		注意：高数值孔径（NA）物镜的代价是工作距离缩短。为了将样品置于极短的工作距离内，盖玻片和盖片（步骤2）必须尽可能薄。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>温度控制
	<ol>
		<li>确保灌流液流经温度控制器，以在整个实验过程中维持记录细胞的温度在约33 oC。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设备连接
	<ol>
		<li>将膜片钳放大器和光源的机械快门连接至高速CCD相机的Bayonet Neill-Concelman（BNC）指令盒。这将使成像软件能够同时控制放大器、相机和光源。 
		注意：为了实现电活动的同步电学与光学记录，电学与成像组件必须保持同步。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="使用CCD相机的膜片钳记录装置；用于电压分析的荧光成像示意图。" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 使用GEVI进行电压成像的设备设置 沿着光路的工作流程：（A）75 W氙弧灯；（B）来自弧光灯的激发光通过激发滤光片过滤后，由第一片二向色镜反射，再到达样本载物台；右上角插图显示全细胞构型；（C）低速CCD相机用于辅助选择细胞和进行膜片钳操作；（D）图像采集部分：（1）高速CCD相机，（2）适用于FRET对和单荧光蛋白GEVI的图像分光器，（3）缩小镜，用于将图像适配到高速CCD相机的CCD芯片上，（4）双通道相机适配器，用于切换成像光路，以及（5）具有高空间分辨率的低速CCD相机，用于识别待钳制的细胞；（E&amp;F）基于单荧光蛋白的GEVI（E）和基于FRET的GEVI（F）的图像采集示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. GEVIs 的表达
<ol>
	<li>在人胚胎肾293细胞中
	<ol>
		<li>使用添加10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），在37℃下培养人胚胎肾293（HEK 293）细胞 oC 在 CO2 培养箱（5% CO₂）2）。使用直径100 mm、高度20 mm的组织培养皿。以2 × 10²3 - 6 × 103 细胞/厘米²2 并培养至细胞融合度达到80-90%，用于后续转染。</li>
		<li>转染当天，吸除细胞培养基，用杜氏磷酸盐缓冲液轻轻洗涤一次。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化HEK 293细胞1–2分钟，吸除消化液，轻敲培养皿侧壁使细胞脱落。加入新鲜DMEM（10% FBS），吹打混匀以分散成团的细胞。使用血细胞计数板测定细胞浓度。</li>
		<li>将预先涂有聚-L-赖氨酸、厚度为 0.08 – 0.13 mm、直径为 10 mm 的盖玻片放入 24 孔组织培养板中。以 1 × 10⁵ 个细胞/孔的密度将 HEK 293 细胞接种于盖玻片上5 细胞/厘米2 细胞密度 
		注意：由于HEK 293细胞能够相互之间形成间隙连接，接种数量需保证细胞分散、孤立。</li>
		<li>使用脂质体转染试剂，按照制造商说明书将编码GEVI的适当基因构建体瞬时转染至细胞中。 
		注意：本步骤所用的基因构建体以 pcDNA3.1（Bongwoori）和 pUB2.1（Nabi 2.242）作为骨架载体。每张盖玻片使用的 DNA 量为 100 ng；然而，每种待测 GEVI 的转染条件需通过实验经验确定。 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>在分离的小鼠海马原代神经元中
	<ol>
		<li>从胚胎第17天的C57BL6/N小鼠中分离海马组织，然后按照先前所述方法解离海马神经元 22,23.</li>
		<li>将解离的神经元接种到多聚-D-赖氨酸包被的、厚度为0.08–0.13 mm、直径为10 mm的盖玻片上，接种密度为1 × 10⁵个细胞/盖玻片5 细胞/ml 细胞密度。将细胞在 37 oC in CO2 培养箱（5% CO₂）2).</li>
		<li>在分离神经元培养6至7天时进行瞬时转染 体外 （DIV）使用钙磷酸盐转染试剂，按照先前所述方法，转染编码GEVI的基因构建体 24. 
		注意：本步骤所用的基因构建体以 pcDNA3.1（Bongwoori）和 pUB2.1（Nabi 2.244）作为骨架载体。所用 DNA 的量为 1 µg 每次实验需针对每张盖玻片进行。此外，每种测试的GEVI所需的转染条件需通过实验经验确定。 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>在进行电压成像前检测表达水平
	<ol>
		<li>从 CO₂ 培养箱中取出组织培养板2 将转染后的细胞置于培养箱中孵育，并在落射荧光显微镜下观察细胞的荧光。</li>
		<li>在确认膜上的荧光后，将盖玻片转移至灌流记录槽，用于第3节的电压成像。 
		注意：电压成像在转染后16–24小时进行。然而，由于不同的荧光蛋白具有不同的成熟时间，某些基因编码电压指示剂（GEVI）在转染后需要更长的表达时间。例如，本方案中包含mRuby2的FRET对可能需要更长时间表达，因为mRuby2的成熟时间显著长于Clover11应检测供体和受体两者的荧光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 电压成像实验方案
<ol>
	<li>选择一个细胞膜表达良好的健康细胞
	<ol>
		<li>利用显微镜找到一个健康的细胞（图4B），其细胞膜局部荧光应明显强于细胞内荧光。尽量避免对呈圆形的细胞进行膜片钳操作。圆形细胞可能正处于分裂或死亡状态，难以形成稳定封接。施加一个幅度为5.0 mV、持续时间为5.0 msec的测试脉冲，以辅助后续的膜片钳实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备进行电压成像的细胞
	<ol>
		<li>选定待钳制的细胞后，将膜片钳电极移至细胞上方。缓慢下放电极，使其轻轻接触细胞膜。在此步骤中，观察膜片钳软件上显示的膜电阻是否出现1 MΩ - 2 MΩ的上升25。 
		注意：有时仅通过轻触细胞膜即可形成良好的吉欧姆封接。只要吉欧姆封接稳定，即可继续操作。</li>
		<li>通过电极轻轻施加负压，建立吉欧姆封接。将电极电位设定为所需的钳制电位。</li>
		<li>在维持吉欧姆封接的同时，使用高速CCD相机对细胞进行成像，并将焦点对准细胞膜区域。</li>
		<li>通过嘴控或注射器轻柔施加吸力脉冲，击穿细胞膜，形成全细胞记录构型26。</li>
		<li>根据实验设计，使用成像软件在全细胞钳制构型下对已钳制的细胞进行成像
		<ol>
			<li>启动成像软件。点击[ACQUIRE] - [SciMeasure Camera]菜单，打开“CCD ACQUIRE”页面。</li>
			<li>创建一个新的数据文件以保存图像。</li>
			<li>点击[ANALOGUE OUTPUT]，然后选择[Read an ASCII]，以打开脉冲序列协议文件进行成像。如果需要对数据进行平均处理，请勾选“Average the internal repetitions”选项，然后关闭“ANALOGUE OUTPUT”页面。 
			注意：此脉冲序列协议需根据各实验的具体目的提前设计并保存为“.txt”文件。</li>
			<li>在“CCD ACQUIRE”页面中设置特定的采集参数。输入“采集帧数”和“试验次数”的具体数值。 
			注意：采集帧数由采集速度和脉冲序列的时间安排决定。例如，若以1 kHz进行成像，则1,000帧对应1秒的记录时间。</li>
			<li>点击[TAKE DATA (Optics + BNC)]按钮开始记录。在电压成像过程中，持续观察膜片钳软件中的示波器窗口，确保在整个记录期间保持稳定的全细胞构型。 
			注意：为测试GEVI的响应电压范围、ΔF/F值的信号幅度或生理电压范围内的时间分辨率，可采用阶梯式电压脉冲（从-170 mV至130 mV）的脉冲序列进行全细胞电压钳实验。为评估GEVI在分辨培养原代神经元诱发的动作电位方面的性能，应在全细胞电流钳构型下对细胞进行成像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据采集
<ol>
	<li>ΔF/F 的计算
	<ol>
		<li>启动成像软件。点击 [FILE] - [Read Data File] 打开待分析的数据文件。在右侧观察细胞的静息光强度（RLI）图像 
		注意：软件会取前 5 帧的平均值来确定记录中的 RLI。</li>
		<li>点击“Show BNCs”以将测得的电流和电压值显示在屏幕上。</li>
		<li>将页面模式从“RLI frame”更改为“Frame subtraction”，以使用帧减法功能识别具有响应性光学信号的像素。这是成像技术的真正优势所在，因为每个像素均可被检测是否存在荧光变化。</li>
		<li>选择两个时间点（F0 和 F1）进行减法运算，并确定细胞的哪个区域对膜电位变化产生响应信号。 
		注意：通过为每个时间点选择多个帧进行时间平均，可提高帧减法图像的信噪比（SNR）。软件会计算所选帧的平均光强度并进行相减，得出 F1 - F0 值（ΔF）。通常选择一个在钳制电位下获取的时间点，以及另一个在刺激期间获取的时间点。</li>
		<li>使用鼠标拖拽或逐个点击来选定需要分析的像素区域。在软件窗口左侧观察所选像素的平均荧光强度的图形表示。图 4B 和 5B 展示了帧减法分析的代表性图像。</li>
		<li>将相减后的像素值除以 RLI（F0）。点击 [Divide by RLIs] 以获得 ΔF/F 值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导出数据
	<ol>
		<li>计算每个电压步阶下的 ΔF/F 值，以进一步分析 GEVI 的电压感应特性。利用这些值绘制如 ΔF/F 随电压变化的图表，用于后续数据分析。</li>
		<li>取消勾选“Show BNCs”菜单以移除电流和电压图。进入 [OUTPUT] - [Save Traces As Displayed (ASCII)]，将荧光轨迹以 ASCII 文件格式导出，供标准绘图软件进行曲线拟合分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>GEVI 的电压感应特性
	<ol>
		<li>在数据分析程序中，以 ΔF/F 值对电压作图，绘制荧光变化与电压的关系曲线（F-V 曲线）。通过点击 [分析] - [拟合] - [S型拟合] - [打开对话框]，选择 Boltzmann 函数对曲线进行拟合（表 2），以确定光学信号的电压响应范围。 
		注意：对函数进行拟合有助于表征不同电压探针的电压感应特性，或比较其在不同细胞中的性能表现。由于本文中测试的探针所获得的 F-V 曲线呈 S 型，因此可采用 Boltzmann 函数进行拟合。</li>
		<li>利用拟合函数计算得到的初始值和终末值（A1 和 A2）对每个 ΔF/F 值进行归一化处理。 
		注意：在 Boltzmann 方程中，最小值为 A1，最大值为 A2。进行归一化时，可使用电子表格软件将 A1 定义为 0，A2 定义为 1，从而调整 ΔF/F 值。对归一化后的 ΔF/F 值进行平均，并计算标准误以用于统计分析。</li>
		<li>按照第 5.1.1 节所述方法，重新绘制归一化后的 ΔF/F 值与电压的关系曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光学响应速度
	<ol>
		<li>使用数据分析程序打开从步骤 4.2.2) 获得的 ASCII 文件，并绘制 ΔF/F 信号随时间变化的轨迹图。</li>
		<li>在数据分析软件中点击“数据选择器”，选择一个对应于阶跃电压脉冲起始时刻的时间点，以及另一个对应于光学信号达到稳态的时间点。通过点击 [分析] - [拟合] - [指数拟合] - [打开对话框]，选择单指数或双指数衰减函数对该区间进行拟合，并报告拟合效果更优的结果。 
		注意：通过单指数或双指数衰减函数拟合，可获得以 τ 表示的量化时间常数。这有助于实验人员比较使用不同电压指示剂所测得数据的动力学特征。荧光轨迹可能包含快相和慢相成分，此时可用双指数衰减函数进行描述。在这种情况下，拟合结果将产生两个具有不同振幅的时间常数。</li>
		<li>计算加权 τ 常数，以便将具有两个时间成分的探针动力学特性与仅具单一成分的探针进行比较。 
		注意：加权 τ 的计算公式为 τ1 乘以其相对振幅 A1 与 τ2 乘以其相对振幅 A2 之和，具体定义如下公式所示；<img alt="加权平均寿命方程，光子学实验中的公式，瞬态吸收分析。" src="/files/ftp_upload/53566/53566eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

神经系统以多种不同方式利用电压，其中抑制作用会引起轻微的超极化，突触输入会引起轻微的去极化，而动作电位则导致相对较大的电压变化。通过基因编码电压指示剂（GEVIs）测量膜电位变化的能力，为同时分析神经元回路的多个组分提供了广阔前景。在本报告中，我们展示了一种利用基因编码电压指示剂成像膜电位变化的基本方法。
对电压变化进行成像的一个关键因素是GEVI在质膜上的高效表达。细胞内表达会产生无响应的荧光，从而降低探针的信噪比（SNR）。优化转染条件可显著提高光学测量结果的一致性。实际上，在测试一种新型GEVI时，建议同时测试一种已知的探针，以确保光学活性的差异完全源于新探针本身，而非细胞实验条件所致。
图6展示了内部荧光对电压成像灵敏度（ΔF/F值）的降低作用。图6B显示了表达基于单荧光蛋白的基因编码电压指示剂Bongwoori的HEK细胞的ΔF值。迹线2来自区域2（蓝色），该区域在图6A中显示出相对较亮的内部荧光。该迹线的ΔF值水平...

本文的主要目的是展示膜电位变化的光学成像 体外 使用基因编码的荧光蛋白。对膜电位变化进行成像为研究神经元环路的活动提供了令人振奋的可能性。当膜电位的变化引起荧光强度的改变时，相机的每个像素都可作为替代电极，实现对神经元活动的非侵入性测量。四十多年来，有机电压敏感性染料已被广泛用于观察膜电位的变化。 1-4然而，这些染料缺乏细胞特异性，此外，某些细胞类型难以染色。基因编码的电压指示剂（GEVIs）通过使待研究的细胞特异性表达荧光电压敏感探针，克服了这些局限性。
基因编码电压指示剂（GEVI）分为三类。第一类GEVI利用电压敏感磷酸酶的电压感应结构域，与单一荧光蛋白（FP）5-9或 Förster 偿能共振转移（FRET）荧光对10-12结合使用。第二类传感器直接利用微生物视紫红质作为荧光指示剂13-15，或通过电致变色FRET机制实现16,17。第三类系统包含两个组分：一个为锚定于细胞膜的荧光蛋白基因组分，另一个为膜结合的淬灭染料组分18-20。尽管第二类和第三类传感器适用于体外（in vitro）和脑片实验19,20，但目前仅有第一类传感器可用于活体（in vivo）分析6。
在本报告中，我们将演示利用第一类基因编码电压指示剂（GEVIs）对膜电位进行成像图1) 体外第一类电压传感器是最容易实现过渡的 体内 成像。由于利用与荧光蛋白融合的电压感应结构域的基因编码电压指示剂（GEVI）的亮度比视紫红质类传感器高约50倍，因此可使用弧光灯照明进行成像，而无需使用极高功率的激光器。亮度差异的另一个结果是，第一类GEVI的信号可轻易超过脑组织的自发荧光背景，而基于视紫红质的探针则无法做到。第三类传感器的亮度与第一类相当，但需要添加一种化学淬灭剂，而该淬灭剂难以递送。 体内.
因此，我们将演示获取带有单个荧光蛋白（Bongwoori）8的探针，以及由FRET对（Nabi 2）12组成的探针。本报告中的FRET构建体为VSFP-CR（电压敏感型荧光蛋白 - Clover-mRuby2）11的蝴蝶型版本，包含绿色荧光供体Clover和红色荧光受体mRuby2，分别命名为Nabi 2.242和Nabi 2.24412。对这类记录方法的介绍将帮助研究人员更深入地理解基因编码电压指示剂（GEVIs）所能提供的信息类型。
<img alt="用于荧光分析的电压感应结构域示意图，包含FRET供体-受体装置。" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 本报告中成像的两种基因编码电压指示剂（GEVIs）（A）基于单一荧光蛋白的GEVI，包含一个跨膜电压感应结构域和一个荧光蛋白。（B）基于FRET的GEVI，由一个跨膜电压感应结构域、一个FRET供体和一个受体组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60倍物镜（数值孔径 = 1.35）</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>激发滤光片</td><td>Semrock</td><td>&amp;nbsp;FF02-472/30</td><td>用于Bongwoori中超级电击pHluorin的电压成像</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75 W 氙弧灯</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Illuminator</td><td>LED和激光也是有效的光源</td></tr><tr><td>低速CCD相机</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>双端口相机适配器</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>高速CCD相机</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>图像分光器</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>激发滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>用于基于Clover和mRuby2组成的FRET对的GEVI电压成像</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>防振系统</td><td>Kinetic systems</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳记录室</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 显微盖玻片（22 × 40 mm）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0（0.08 ~ 0.13 mm）- 直径10 mm 玻璃盖玻片</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>脂质体转染试剂</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钙转染试剂</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB放大器</td><td></td></tr><tr><td>多通道数据采集软件</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>图像采集与分析软件</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>电子表格应用软件</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>减倍镜</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem标准相机耦合器 0.38x SC38 J夹</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R共聚焦显微镜</td><td></td></tr><tr><td>抗荧光淬灭试剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

使用两种基因编码的荧光电压传感器进行膜电位成像

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

基因编码的电压指示剂（GEVIs）已得到显著改进，目前已逐步可用于 体内 记录。虽然最终目标是成像神经元活动 体内，必须能够对单个细胞的活动进行成像，以确保体内实验准备的成功。本实验方案将介绍如何对单个细胞的膜电位进行成像，为最终实现活体成像提供基础 体内在此，我们描述了成像基因编码电压指示剂（GEVIs）的方法，该指示剂由一个电压感应结构域与单个荧光蛋白（FP）或一对可进行荧光共振能量转移（FRET）的荧光蛋白融合而成。 体外使用图像分光器可将由两种不同波长产生的图像同时投射到同一个电荷耦合器件（CCD）相机上。图像分光器在光路中放置第二个滤光立方体，该立方体包含一个二向色镜和两个发射滤光片，用于根据GEVI所用的荧光蛋白（FPs）分离供体和受体的荧光波长。此配置可在通过全细胞膜片钳技术操控膜电位的同时，实现对受体和供体荧光信号的同步记录。当使用的GEVI仅包含单一荧光蛋白时，可移除第二个滤光立方体，使图像分光器内的镜面将单一图像投射至CCD相机。

瞬时转染的细胞在荧光强度和细胞质膜表达程度上可能表现出显著差异。即使在同一盖玻片上，不同细胞的胞内荧光水平也可能各不相同。这很可能与细胞吸收的转染试剂的量有关。偶尔，过量表达会导致细胞发生未折叠蛋白反应，从而引发细胞凋亡27（表现为明亮、圆形且胞内荧光强烈的细胞）。因此，实验人员应谨慎地同时检测荧光强的细胞和荧光弱的细胞，并尽可能选择胞内荧光最少的细胞，因为胞内表达会产生非响应性荧光，降低信噪比（SNR）。
另一个需要考虑的因素是发色团的成熟速率。图3展示了受体发色团（mRuby2）与供体发色团（Clover）之间荧光强度的差异，其中mRuby2的成熟时间比Clover更长。
<img alt="使用Clover和mRuby2标记细胞的荧光显微镜图像，显示合并图像。" src=...

介绍了一种利用基因编码的电压指示剂对膜电位变化进行成像的方法。

基因编码的电压指示剂（GEVIs）已得到显著改进，目前已逐步适用于活体记录。尽管最终……

本实验的总体目标是利用基因编码的电压指示剂，光学报告膜电位的变化。该方法将描述使用不同基因编码的荧光电压探针进行成像的优缺点。例如，基于FRET的探针具有可进行比率成像的优点，但信号强度较低。该技术的主要优势在于能够实时观察神经活动。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为信号与噪声的比值较低，且存在多种噪声来源以及多个可能出错的步骤。新手常常会感到困惑，将干扰误认为是真实信号。对该方法进行可视化演示对于确认所用探针的有效性及其实际指示的内容至关重要。在实验装置中，需在慢速和快速 CCD 相机之间安装一个图像分光器，用于基于 FRET 的 GEVI 成像。实验前，在图像分光器中插入一个包含二向色镜和两个发射滤光片的滤光片盒。在对带有单个荧光蛋白的GEVI进行成像时，移除第二个滤光立方体。实验开始时，寻找一个健康的HEK293细胞，其膜荧光相对于内部荧光应表现出强且定位清晰的信号，并避免对呈圆形的细胞进行膜片钳制，因为这些细胞可能正在分裂或已处于死亡状态。随后施加测试脉冲以检测电流反应。随后，将膜片钳电极移至细胞表面正上方。然后，缓慢降低电极，直至其轻轻接触细胞膜。此时膜电阻应上升至1到2兆欧。随后，通过移液管轻轻施加负压以形成吉欧姆封接。一旦达到吉欧姆封接，将移液管电位设定在所需的钳制电位。接下来，将高速CCD相机对准细胞体。对于基于FRET的GEVI记录，使用图像分光器上的旋钮调节分光图像的大小，使每个发射波长呈现均匀间隔的视图。然后施加负压破裂细胞膜，以形成全细胞记录构型。接着，打开成像软件。然后点击 SciMeasure 相机菜单中的采集选项，打开 CCD 采集页面。接着，创建一个新的数据文件以保存记录。点击模拟输出，然后读取 ASCII 文件，以打开脉冲协议文件，从而进行成像。接下来，单击平均内部重复次数以平均试验次数。然后关闭模拟输出页面。在CCD采集页面上设置特定的采集参数。随后输入采集的帧数和试验次数的具体数值。然后，单击“采集数据光学信号及BNC”按钮以开始记录。在进行电压成像时，需监测示波器，以确保整个记录过程中全细胞构型保持稳定。要计算荧光强度的相对变化，请点击文件，然后选择读取数据文件，以打开上一步记录的数据文件。右侧应显示细胞在静息光强度下的图像。接下来，点击显示BNC以查看当前的末端电压值。将页面模式从RLI帧切换为帧间减影，以利用帧间减影功能识别具有响应性光学信号的像素。接下来，选择两个时间点进行减影，确定在膜电位变化时产生信号的细胞区域。随后，通过拖动或单击每个像素，选定需要分析的像素区域。所选像素的平均荧光强度的图形化表示应出现在软件窗口的左侧。通过单击“除以RLI”按钮，将减去背景信号后的像素值除以静息光强度，以获得荧光强度的相对变化值。如需导出数据，请取消勾选“显示BNC”菜单，以移除当前的末端电压图。转到输出界面，将轨迹保存为显示的ASCII格式，以ASCII文件格式导出荧光轨迹，用于曲线拟合分析。在此步骤中，使用数据分析程序绘制荧光变化相对于电压的图形，即根据电压引起的荧光相对变化量作图。随后，通过点击“分析”、“拟合”、“S型拟合”，然后打开对话框，将曲线拟合至Boltzmann函数，以确定光学信号的电压范围。使用数据分析程序，根据数据重新绘制响应电压的归一化荧光变化分数。为计算光学响应速度，打开 ASCII 文件，并绘制荧光变化分数随时间变化的曲线。然后在数据分析软件中点击数据选择器，选择一个对应于阶跃电压脉冲起始时刻的时间点，以及另一个光学信号达到稳态时的时间点。通过点击分析、拟合、指数拟合，然后打开对话框，将该范围分别拟合为单指数衰减函数和双指数衰减函数，并报告拟合更优的结果。该图显示了表达基于单个荧光蛋白的GEVI Bongwoori的HEK细胞的荧光变化。这是对阶梯式电压脉冲响应的典型荧光变化。此处使用高速CCD相机对HEK293细胞进行了成像。该图像显示了表达Bongwoori的细胞的静息光强度。此图为帧差图像，指示出观察到荧光变化的像素位置。图中显示的是表达Bongwoori的小鼠海马体原代神经元中诱导产生的动作电位的光学记录。动作电位在全细胞电流钳模式下诱发。荧光变化分数迹线选自与胞体相关像素。在此图中，表达基于FRET的GEVI的HEK细胞的荧光变化显示了其对阶梯式电压脉冲在两个波长下的响应。数据使用高速CCD相机以每秒一千帧的速率记录。在进行该操作时，需注意检测荧光水平的变化，因为荧光蛋白的过表达可能影响细胞的健康状态。完成此操作后，可进行其他方法，如切片编码，以回答涉及不同神经回路神经元活动的更多问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用不同类型的探针进行膜电位成像。

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