成像膜电位与基因编码荧光电压传感器的两种类型
February 4th, 2016
描述了一种使用基因编码电压指示器对膜电位变化进行成像的方法。
该程序的总体目标是使用基因编码的电压指示器以光学方式报告膜电位变化。该方法将描述使用不同基因编码的电压荧光探针进行成像的优缺点。例如，基于 FRET 的探针将提供比率成像的优势，但会提供较低的信号。
这种技术的主要优点是我们可以实时可视化神经活动。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为信噪比不是很大，而且有几个噪声源和多个步骤可能会出错。新用户经常感到困惑，干扰被视为真正的信号。
这种方法的视觉演示对于确定所用探针的有效性及其实际指示的内容至关重要。对于设置，在慢速和快速 CCD 相机之间安装了一个图像分配器，用于对基于 FRET 的 GEVI 进行成像。在实验之前，在图像分流器中插入一个带有二向色镜和两个发射滤光片的滤光片立方体。
当用单个荧光蛋白对 GEVI 进行成像时，去除第二个滤光片立方体。要开始实验，请找到一个健康的 HEK293 细胞，与内部荧光相比，该细胞显示出强烈的局部膜荧光，并避免在圆形细胞分裂或死亡时修补它们。然后施加测试脉冲以检查当前响应。
然后，将膜片钳移液器降低到细胞表面的正上方。然后，慢慢降低移液管，直到它轻轻接触细胞膜。膜电阻应增加到 1 到 2 兆欧。
之后，通过移液管轻轻施加负压来建立千兆密封。一旦达到千兆级密封，将移液器电位设置为所需的保持电位。接下来，将高速 CCD 相机聚焦在细胞体上。
对于基于 FRET 的 GEVI 记录，使用图像分流器上的旋钮调整分流图像的大小，以为每个发射波长产生均匀分布的视图。然后通过施加负压破坏细胞膜，以形成整个细胞构型。现在，打开成像软件。
然后单击 acquire SciMeasure 相机菜单以打开 CCD 采集页面。接下来，创建一个新的数据文件以保存录音。单击模拟输出，然后读取 ASCII 以打开脉冲协议文件，以便进行成像。
接下来，单击 average the internal repetitions 以平均试验次数。然后关闭模拟输出页面。在 CCD 采集页面上设置特定的采集参数。
之后，输入用于采集的帧数和试验次数的特定值。然后，单击 take data optics plus BNC 按钮开始录制。在进行电压成像时，监控示波器，以确保在整个记录过程中稳定的全池配置。
要计算荧光分数，请更改 file，然后单击 read data file 以打开上一步中记录的数据文件。静息光强度下的细胞图像应该在右侧看到。接下来，单击 show BNC's 以显示当前结束电压值。
将页面模式从 RLI 帧更改为帧减法，以便利用帧减法功能来识别具有响应式光信号的像素。接下来，选择两个时间点进行减法，并确定显示响应膜电位变化的信号的细胞区域。接下来，通过拖动或单击每个像素来指定需要分析的像素。
所选像素的平均荧光强度的图形表示应出现在软件窗口的左侧。通过单击 divide by RLI 的按钮，将减去的像素与静止光强度除以获取分数荧光变化值。要导出数据，请取消单击 show BNC 的菜单来删除当前结束电压图。
转到输出，将迹线保存为显示的 ASCII，以 ASCII 文件格式导出荧光迹线，用于曲线拟合分析。在此过程中，通过在数据分析程序中绘制响应电压的荧光分数变化来绘制荧光变化与电压的关系图。之后，将曲线拟合到玻尔兹曼函数，以便通过单击分析、拟合、S 形拟合然后打开对话框来确定光信号的电压范围。
使用数据分析程序重新绘制响应电压的归一化分数荧光变化。要计算光学响应的速度，请打开 ASCII 文件并绘制荧光分数变化轨迹与时间的关系图。然后单击数据分析软件中的数据选择器，选择一个对应于步进电压脉冲开始的时间点和光信号达到稳态的第二个时间点。
通过单击 analysis、fitting、exponential fit，然后打开对话框并报告更好的拟合，将此范围拟合到单指数和双指数衰减函数。该图显示了表达单个基于 FP 的 GEVI Bongwoori 的 HEK 细胞的荧光变化。这是响应步进电压脉冲的典型荧光变化。
在这里，HEK293 细胞用高速 CCD 相机成像。该图像显示了表达 Bongwoori 的细胞的静止光强度。这是一个帧减法图像，指示观察到荧光变化的像素。
这里显示的是表达 Bongwoori 的小鼠海马原代神经元诱导的动作电位的光学记录。动作电位是在全细胞电流钳制模式下诱发的。从与 soma 相关的像素中选择分数荧光变化轨迹。
在该图中，表达基于 FRET 的 GEVI 的 HEK 细胞的荧光变化显示了对两个波长的阶跃电压脉冲的响应。使用高速 CCD 相机以 1 kHz 的频率录制。在尝试此程序时，请务必记住测试可变的荧光水平，因为荧光的过表达会影响细胞的健康。
按照这个程序，可以执行其他方法，如切片器编码，以回答涉及各种回路神经元活动的其他问题。观看此视频后，您应该对如何使用不同类型的探针对膜电位进行成像有很好的了解。
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概述
本文描述了一种使用基因编码电压指示剂成像膜电位变化的方法。该技术允许实时可视化神经活动，尽管由于噪声和信号解释问题，对新用户来说存在挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 成像技术
背景
- 基因编码电压指示剂用于监测膜电位变化。
- 不同的荧光探针有不同的优缺点。
- 基于FRET的探针允许比值成像，但可能产生较低的信号。
- 理解信噪比对于准确解释至关重要。
研究目的
- 光学报告膜电位变化。
- 评估各种基因编码荧光探针的有效性。
- 提供对实时神经活动可视化的洞察。
所用方法
- 利用基因编码电压指示剂。
- 比较不同的成像技术。
- 分析信噪比。
- 评估用户在解释信号时面临的挑战。
主要结果
- 实时可视化神经活动是可行的。
- 基于FRET的探针尽管信号较低但具有优势。
- 新用户因噪声干扰而面临困难。
- 适当的培训对于区分真实信号和噪声至关重要。
结论
- 基因编码电压指示剂对神经科学研究很有价值。
- 理解不同探针的局限性至关重要。
- 培训和经验可以改善信号解释。
常见问题
Executive Industry Relevance
Imaging membrane potential with genetically encoded voltage indicators (GEVIs) enables real-time visualization of cellular electrophysiology, supporting early-stage target validation in neuroscience drug discovery. The method provides quantitative, dynamic readouts of neuronal activity, aiding mechanistic de-risking by linking compound effects to functional membrane potential changes. This capability improves predictive confidence in lead identification by offering direct, optical reporting of target engagement in live cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by optically reporting membrane potential dynamics in response to pharmacological modulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct, real-time measurement of voltage changes in live cells expressing GEVIs.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement by providing ratiometric or intensity-based fluorescence readouts correlated to voltage shifts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated cellular systems (e.g., HEK293) for downstream compound screening via stable GEVI expression and whole-cell patch clamp integration.
- Quantitative Output: Enables ratiometric imaging with FRET-based GEVIs, improving signal reliability and reducing artifacts from expression variability or photobleaching.
- Scalability: Compatible with high-speed CCD acquisition and automated pulse protocols, supporting repeated trials and dose-response analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to neuronal models (e.g., hippocampal primary neurons) to assess compound effects in disease-relevant electrophysiological contexts.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo potential by establishing single-cell imaging competence as a prerequisite for complex tissue studies.
- Mechanistic De-risking: Allows discrimination of compound-specific voltage effects from nonspecific noise through frame subtraction and baseline normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target interrogation to lead optimization, where functional voltage readouts inform compound selection prior to preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating optical signals with voltage-clamp stimuli to validate probe response and cellular health.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible measurements through standardized whole-cell configuration and baseline fluorescence normalization.
- Analytics: Provides fractional fluorescence change and kinetic analysis (exponential fitting) to quantify signal amplitude and response speed.
- Translational Research: Enables progression from single-cell HEK293 models to primary neurons, supporting assessment of translational relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for ion channel modulation studies across multiple target classes and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time optical reporting of membrane potential changes as a functional biomarker of neuronal activity.
- Operational Value: Promotes standardization via defined patch clamp protocols, image splitter calibration, and standardized analysis steps (frame subtraction, RLI normalization).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of off-target electrophysiological effects, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying compound-induced voltage shifts with defined thresholds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology (whole-cell patch clamp), fluorescence microscopy, and GEVI handling.
- Dependent on high-speed CCD cameras, image splitters, and filter cubes for dual-wavelength FRET detection.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for consistent data acquisition.
- Adaptation considerations include GEVI type (single FP vs. FRET-based), expression levels, and cell line suitability (e.g., avoiding dividing/dying HEK293 cells).
- Practical limitations include low signal-to-noise ratio, susceptibility to overexpression artifacts, and user-dependent interpretation of optical signals versus noise.
