使用两种基因编码的荧光电压传感器进行膜电位成像

本实验的总体目标是利用基因编码的电压指示剂，光学报告膜电位的变化。该方法将阐述使用不同基因编码的荧光电压探针进行成像时的优势与局限。例如，基于FRET的探针具有可进行比率成像的优点，但信号强度较低。

该技术的主要优势在于能够实时观察神经活动。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为信号与噪声的比值较小，且存在多种噪声来源以及多个可能出错的步骤。初学者常常感到困惑，容易将干扰误认为真实信号。

该方法的可视化演示对于确定所用探针的有效性及其实际指示的内容至关重要。在实验装置中，需在慢速和快速CCD相机之间安装一个图像分光器，用于基于FRET的GEVI成像。实验前，在图像分光器中插入一个包含二向色镜和两个发射滤光片的滤光片盒。

在对带有单个荧光蛋白的GEVI进行成像时，移除第二个滤光立方体。实验开始时，寻找一个健康的HEK293细胞，该细胞的膜荧光应明显强于胞内荧光，并避免对呈圆形的细胞进行膜片钳制，因为这些细胞可能正在分裂或已濒死。随后施加测试脉冲以检测电流反应。

随后，将膜片钳电极移至细胞表面正上方。然后，缓慢降低电极，直至其轻轻接触细胞膜。此时膜电阻应上升至1到2兆欧。

随后，通过移液管轻轻施加负压以形成吉欧姆封接。一旦达到吉欧姆封接，将移液管电位设定在所需的保持电位。接下来，将高速CCD相机对准细胞体。

对于基于FRET的GEVI记录，使用图像分光器上的旋钮调节分光图像的大小，使每个发射波长呈现均匀间隔的视图。然后施加负压以破裂细胞膜，形成全细胞构型。现在，打开成像软件。

然后单击 SciMeasure 相机菜单中的采集按钮，打开 CCD 采集页面。接着，创建一个新的数据文件以保存记录。单击模拟输出，然后读取 ASCII 文件，以打开脉冲协议文件，从而进行成像。

接下来，单击平均内部重复次数以平均试验次数。然后关闭模拟输出页面。在CCD采集页面上设置特定的采集参数。

随后输入采集的帧数和试验次数的具体数值。然后，单击“采集数据光学信号及BNC”按钮以开始记录。在进行电压成像时，需监测示波器，以确保整个记录过程中全细胞构型保持稳定。

要计算荧光强度的相对变化，请点击“文件”，然后选择“读取数据文件”，以打开上一步记录的数据文件。右侧应显示细胞在静息状态下的光强度图像。接下来，点击“显示BNC”以查看当前的末端电压值。

将页面模式从 RLI 帧切换为帧间差分，以利用帧间差分功能识别具有响应性光学信号的像素。接着，选择两个时间点进行差分运算，并确定在膜电位变化时产生信号的细胞区域。随后，通过拖动或单击每个像素，选定需要分析的像素区域。

所选像素的平均荧光强度的图形表示应出现在软件窗口的左侧。通过单击“除以RLI”按钮，将减去背景荧光后的像素值除以静息光强度，以获得荧光强度变化的相对值。如需导出数据，请取消勾选“显示BNC”菜单，以移除当前的末端电压图。

转到输出界面，将轨迹保存为显示的ASCII格式，以ASCII文件格式导出荧光轨迹，用于曲线拟合分析。在此步骤中，使用数据分析程序绘制荧光变化相对于电压的图形，即绘制荧光信号对电压响应的相对荧光变化。随后，通过点击“分析”、“拟合”、“S型拟合”，然后打开对话框，将曲线拟合至Boltzmann函数，以确定光学信号的电压范围。

使用数据分析程序，根据数据重新绘制响应电压的归一化荧光变化分数曲线。为计算光学响应速度，打开ASCII文件，绘制荧光变化分数随时间变化的曲线。然后在数据分析软件中点击数据选择器，选择一个对应于阶跃电压脉冲起始时刻的时间点，以及另一个对应于光学信号达到稳态的时间点。

通过点击分析、拟合、指数拟合，然后打开对话框，将该范围分别拟合为单指数衰减函数和双指数衰减函数，并报告拟合更优的结果。该图显示了表达基于单个荧光蛋白的GEVI Bongwoori的HEK细胞的荧光变化。这是对阶跃电压脉冲响应的典型荧光变化。

此处使用高速CCD相机对HEK293细胞进行了成像。该图像显示了表达Bongwoori的细胞在静息状态下的光强度。此图为帧差图像，指示出观察到荧光变化的像素位置。

图中显示的是表达 Bongwoori 的小鼠海马体原代神经元中诱导产生的动作电位的光学记录。动作电位在全细胞电流钳模式下诱发。荧光变化分数迹线选自与胞体相关像素的信号。

在此图中，表达基于FRET的GEVI的HEK细胞的荧光变化显示了其对阶梯式电压脉冲在两个波长下的响应。数据使用高速CCD相机以每秒一千帧的速率记录。在进行该操作时，需注意检测可变的荧光水平，因为荧光蛋白的过表达可能影响细胞的健康状态。

在完成此操作后，可进一步采用其他方法（如 slicer 编码）来回答涉及不同神经回路神经元活动的更多问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用不同类型的探针进行膜电位成像。