皮肤微移植生成新解离方法后的组织表征

本项外科技术创新的总体目标是制备出自体皮肤微移植片，可立即在同一手术中用于创面愈合。该方法有助于解答再生医学与皮肤组织工程领域中的关键问题，例如慢性创面愈合、烧伤以及创伤后溃疡等。该技术的主要优势在于操作简便，医生无需特殊技术即可轻松使用，且具有快速、经济的特点。

首先，使用皮肤活检打孔器从患者身上采集皮肤样本。然后去除并弃去表皮层。将每个组织样本与1毫升生理盐水溶液混合，以制备自体微移植组织。

为将生物复合物用于临床应用，将1毫升微移植溶液转移至胶原海绵上。立即将该生物复合物应用于患者的损伤部位。在体外测试该生物复合物的活力。

培养三天后，将0.3%甲醛直接加入生物复合物中，在室温下固定10分钟。使用切片机切取厚度为5 µm的切片，并直接贴附于载玻片上。随后将切片放入15至20 mL二甲苯中处理3分钟。

接下来，将切片依次浸入浓度递减的乙醇中，每级处理一小时，然后放入去离子水中，以脱蜡并使切片重新水化。随后使用1至2毫升浓度为1克/升的苏木精染色液对切片染色1至2分钟，再转移至水中漂洗以去除多余染料。

现在加入1至2毫升1%伊红Y和70%乙醇，用水稀释后对切片染色4至5分钟。然后用流动的自来水冲洗载玻片。将切片依次浸入浓度递增的乙醇中，每种浓度各1小时，最后在二甲苯中孵育1小时。

最后，在样本上滴加封片介质，然后加盖盖玻片。接着在光学显微镜下以100倍放大倍数进行观察。使用皮肤切片机，根据国家关于组织获取的规定，从四位40至55岁多组织捐献者躯干部位分别切取0.6毫米、1毫米或0.2毫米厚的乳头层、角质层或真皮层样本。

将样品放入0.9% NaCl中，置于摇床中轻轻振荡5分钟，以温和清洗组织。使用5毫米活检打孔器，从皮肤组织、表皮或真皮中制备直径均一的样品，并称量所有组织标本。接着，分别将8个、3个或4个均一的皮肤组织、表皮或真皮样品插入组织破碎仪中，加入1.5毫升生理盐水进行分散处理。

按照本表中的说明对所有组织样本进行解离。使用从完整组织样本获得的相应数量的穿孔活检样本作为对照。机械解离后，吸出含有微移植物的生理盐水溶液，并将每个样本分别放入12孔板的单个孔中。

向每个样品中加入1毫升添加了10% FBS和抗生素的RPMI-1640培养基。为评估细胞活力，向每孔加入1毫升含0.5毫克/毫升MTT溶液的培养基，在37°C和5%二氧化碳条件下孵育3小时。孵育结束后，移除MTT培养基，并加入1毫升DMSO替代。

孵育10分钟后，将DMSO中的每个样品转移至比色皿中，并使用分光光度计在570纳米处测定吸光度。将细胞活力计算为570纳米处吸光度与解离前使用的组织重量（克）的比值。接下来，在从皮肤组织中吸除生理盐水溶液后，将来自同一供体的表皮和真皮样品分别置于12孔板的孔中用于细胞活力检测，或置于培养瓶中用于形态学分析。

向12孔板中加入1毫升含10%胎牛血清（FBS）和抗生素的RPMI-1640培养基，或向培养瓶中加入5毫升，分别在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时或七天。在24小时时，使用光学显微镜通过评估细胞悬浮情况来进行形态学分析。第七天重复该步骤。

通过FACS分析，检测真皮样本中的间充质和造血细胞标志物，例如CD146、CD34和CD45。向分离的细胞中加入培养基，然后在37°C下孵育三天。并通过如前所述的微生物学分析评估组织的无菌性。

如图所示，将立即加载于胶原支架上的人体自体微移植片植入腿部病损部位，30天后观察到完全的再上皮化并伴随组织修复。此外，临床随访显示，5个月后受损区域的质地和柔软度良好。

如本表所列，已确定单步处理可处理的活检样本数量阈值分别为8个、4个和3个，并通过在四个不同时间点进行组织解离，以确定最佳解离条件，从而维持良好的细胞活力。本视频展示的机械解离方法在对完整组织进行不同时间点评估时，所有皮肤样本（包括表皮和真皮）的平均细胞活力保持在30%。该图显示，在培养24小时或7天后，与起始时间相比，在均质化处理时皮肤组织样本的细胞活力未观察到显著变化。

然而，与起始时间相比，死细胞样本在培养24小时后活力降低。但在培养七天后，细胞活力得以恢复。真皮组织也观察到类似结果。

如果操作得当，掌握此技术后可在五分钟内完成。在进行该操作时，重要的是要记住去除皮肤的表皮层。完成此操作后，可进一步采用其他方法，如骨组织解离，以研究其他问题，例如骨愈合机制。

该技术问世后，为再生医学和组织工程领域的研究人员探索患者的组织愈合机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何实施这种微移植手术。请务必注意，操作组织时可能存在极高风险。

进行此操作时，应始终采取安全眼镜等防护措施。