后皮肤微移植生成一个新的方法解聚表征的组织
March 4th, 2016
该协议描述了一种新的方法来分解人体组织和创建自体微移植，与胶原蛋白海绵相结合，引起人体生物复合物准备皮损的治疗使用。另外，该系统保持在机械解聚后不同时间的微移植物的细胞生存力。
这项外科手术发明的总体目标是生产自体皮肤微移植物，可立即用于同一手术中，用于伤口愈合目的。这种方法可以帮助回答再生医学和皮肤组织工程领域关于慢性伤口愈合、烧伤和创伤后溃疡等问题的关键问题。这种技术的主要优点是医生很容易使用，无需预期的技术，而且它同样快速且经济实惠。
首先，使用活检打孔器收集患者的皮肤样本。然后去除并丢弃上皮层。将每个组织样品与 1 毫升生理盐水溶液混合，以生成自体微移植物。
为了制备用于临床应用的生物复合物，将 1 毫升微移植溶液转移到胶原蛋白海绵上。立即将生物复合物涂抹在患者的受伤区域。在体外，测试生物复合物的活力。
培养 3 天后，将 0.3% 福尔马林直接倒入生物复合物上，并在室温下固定 10 分钟。使用切片机切片 5 微米厚的切片，并直接安装在载玻片上。然后将切片放入 15 至 20 毫升二甲苯中 3 分钟。
接下来，将切片浸入等级较低的乙醇中各 1 小时，然后放入去离子水中以使切片脱蜡和再水化。然后使用 1 至 2 毫升每升 1 克苏木精 1 至 2 分钟对切片进行染色。并转移到水中冲洗掉污渍。
现在用 1 到 2 毫升 1% 曙红 Y 和 70% 乙醇用水稀释，对切片染色 4 到 5 分钟。然后用流动的自来水冲洗玻片。将切片浸入浓度递增的乙醇中各 1 小时，然后在二甲苯中孵育 1 小时。
最后，在添加盖玻片之前，将基于的封固剂涂在样品上。然后在光学显微镜下以 100 倍放大倍率观察。使用皮节，按照国家收获规则，从四名 40 至 55 岁的多组织供体的躯干区域分别采集 0.6 毫米、1 毫米或 0.2 毫米厚的状、坏死或真皮样本。
将样品放入 0.9% NaCl 中，置于定轨摇床上 5 分钟，轻轻冲洗组织。使用 5 毫米活检打孔器，从皮肤组织、坏死和真皮中创建直径均匀的样本，并称量所有组织样本。接下来，将 8 个、3 个或 4 个均匀的皮肤组织样品（分别是死的或真皮的）插入组织破坏物中，并加入 1.5 毫升生理盐水溶液进行分解。
如下表所示，对所有组织样品进行解聚。使用来自完整组织样本的相应数量的穿刺活检作为对照。机械解聚后，吸出含有微移植物的盐水溶液，并将每个样品分别放入 12 孔板的单个孔中。
向每个样品中加入 1 毫升补充有 10% FBS 和抗生素的 RPMI-1640 培养基。为了评估细胞活力，向每个孔中加入 1 毫升培养基，每毫升含有 0.5 毫克 MTT 溶液，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 3 小时。孵育后，去除 MTT 培养基并替换为 1 mL DMSO。
孵育 10 分钟后，将 DMSO 中的每个样品转移到比色皿中，并使用分光光度计读取 570 纳米处的光密度。计算细胞活力为 570 纳米处的吸光度与解聚前使用的组织的重量和克数之比。接下来，从单个供体的皮肤组织、死水和真皮样品中吸出盐水溶液后，将每个样品分别放入 12 孔板的孔中进行细胞活力测试或培养瓶进行形态学分析。
将 1 毫升含 10% FBS 和抗生素的 RPMI-1640 添加到 12 孔板中，或向培养瓶中加入 5 毫升，分别在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养 24 小时或 7 天。24 小时时，使用光学显微镜通过评估细胞悬液的存在进行形态学分析。在第 7 天重复。
通过 FACS 分析，分析来自间充质和造血细胞标志物（如 CD146、CD34 和 CD45）的真皮样本。向解离的细胞中加入培养基，然后在 37 摄氏度下孵育 3 天。并通过执行先前描述的微生物分析来评估组织的无菌性。
如图所示，立即装载在胶原蛋白支架上的人类自体微移植物被植入腿部病变中。并在 30 天后观察到与组织修复相关的完全再上皮化。此外，临床随访显示 5 个月后受损区域的质地和柔软度良好。
如下表所示，建立了可在单个步骤中处理的 8 个、4 个和 3 个活检的阈值，并在四个不同的时间对组织进行分解，以确定最佳分解条件，以保持良好的细胞活力。当在不同时间对完整组织进行评估时，本视频中演示的机械分解在所有皮肤样品（死亡和真皮）中保持 30% 细胞活力的平均值。该移植物表明，在培养 24 小时或 7 天后，与开始时间相比，培养物均质化时间未观察到皮肤组织样品中细胞活力的显着变化。
然而，与开始时间相比，观察到培养 24 小时后死亡样品的活力降低。但培养 7 天后细胞活力恢复。在真皮中观察到类似的结果。
掌握后，如果执行得当，这项技术可以在五分钟内完成。在尝试此程序时，请务必记住从皮肤上去除上皮层。按照这个程序，可以执行其他方法，如骨组织分解，以回答其他问题，如骨愈合机制。
该技术开发后，为再生医学和组织工程领域的研究人员探索患者的组织愈合铺平了道路。看完这个视频后，您应该对如何进行这种微移植手术有很好的了解。不要忘记，处理组织可能非常危险。
执行此程序时应始终采取预防措施，例如安全眼镜。
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概述
本文介绍了一种创造自体皮肤微移植的新型手术方法，可立即用于伤口愈合。该技术强调易用性和经济性，使其对从业者来说易于使用。
关键研究组成部分
科学领域
- 再生医学
- 皮肤组织工程
背景
- 慢性伤口愈合
- 烧伤治疗
- 创伤后溃疡
- 移植中细胞活力的重要性
研究目的
- 开发一种即时使用皮肤微移植的方法
- 增强对皮肤再生的理解
- 为伤口愈合提供实用解决方案
使用的方法
- 使用活检器采集皮肤样本
- 去除上皮层
- 将组织样本与生理盐水溶液结合
- 创建自体微移植
主要结果
- 成功分离人体组织
- 在微移植中保持细胞活力
- 快速准备移植以便立即使用
- 在各种伤口愈合场景中的潜在应用
结论
- 该方法对临床医生来说是高效和用户友好的
- 它为皮肤病变治疗提供了一个有前景的方法
- 进一步的研究可能扩大其在再生医学中的应用
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, autologous micro-graft production for immediate clinical use in wound healing, addressing unmet needs in chronic lesion management. By preserving cell viability and sterility, it supports predictive confidence in regenerative applications. The approach offers a scalable, cost-effective solution for skin tissue engineering workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular composition in disaggregated skin tissue, including mesenchymal stem cell identification for therapeutic hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a standardized, rapid disaggregation protocol that reduces variability in primary cell isolation for target validation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates viable, heterogeneous cell suspensions suitable for phenotypic screening and functional assays in dermal regeneration models.
- Operational Value: Produces standardized micro-grafts compatible with collagen scaffolds, enabling reproducible assay preparation for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cell viability and sterility over seven days in culture, supporting longitudinal preclinical evaluation of graft integration and tissue repair mechanisms.
- Operational Value: Delivers ready-to-use autologous bio-complexes that bridge discovery and preclinical validation in wound healing models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid generation of characterized skin-derived cellular systems for mechanistic and translational studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell viability and multipotency in disaggregated skin tissue through flow cytometry and viability assays.
- Screening: Enables standardized preparation of micro-grafts for consistent compound evaluation in dermal regeneration assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs including cell viability metrics (OD570 normalization) and sterility confirmation for data-driven decision-making.
- Translational Research: Maintains biological fidelity of human skin-derived cells over culture time, supporting preclinical continuity in wound healing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable disaggregation workflow applicable to multiple tissue types (skin, dermis, de-epidermized dermis) for platform-based R&D.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintained cell viability and sterility, reducing mechanistic ambiguity in regenerative outcomes.
- Operational Value: Standardized, rapid (5-minute) disaggregation process with minimal technical expertise required, enhancing lab throughput.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in wound healing programs by delivering immediate-use grafts with characterized biological properties.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative candidates via reliable, scalable micro-graft production.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic tissue handling and epithelial layer removal to ensure sample integrity.
- Depends on access to tissue disruptor, centrifuge, spectrophotometer, and flow cytometry for viability and sterility assessment.
- Necessitates standardization of disaggregation time and biopsy volume across user sites to maintain consistent cell yields.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different tissue densities or donor sources.
- Limited by the need for immediate post-disaggregation processing to preserve viability, as delays may affect downstream assay consistency.
