成人脂肪细胞生物体的数字调控机制，通过分化与凋亡的动态平衡

这些实验的总体目标是分析脂肪细胞稳态和分化，并研究缺氧和脂肪细胞凋亡的机制。这种方法可以帮助回答代谢学领域的关键问题，例如肥胖和 II 型糖尿病。这种技术的主要优点是它们是基本且廉价的程序，可以在您的特定研究模型中分析脂肪细胞生物学。

我实验室的博士生 Nicole Hannemann 将演示这些程序。要量化体内缺氧，首先确定小鼠的体重。然后腹膜内注射每公斤体重 60 毫克固体吡莫硝唑羟氯物。

45 分钟后，固定动物的四肢并打开腹膜腔。从腔中收获左侧和右侧性腺周围脂肪垫，并从垫上去除性腺组织。然后称量组织以确定脂肪垫每体重的比率（以克为单位）。

为了对脂肪细胞稳态进行组织学分析，首先用二甲苯洗涤 3 次 5 分钟，对脂肪组织切片进行脱蜡，然后在 100% 乙醇中洗涤两次 2 分钟，在 96% 乙醇中再水化两次 2 分钟。然后在蒸馏水中洗涤切片 5 分钟，并在室温下用苏木精染色 10 分钟。孵育结束时，将切片再用水洗涤 5 分钟，然后用伊红溶液染色 30 秒。

如刚才所示清洗切片。然后将切片在 96% 乙醇和 100% 乙醇中脱水 2 次，每次 2 分钟。然后是 3 次 5 分钟的二甲苯孵育。

然后用无水封片剂封片。对于组织的免疫组织化学分析，如前所述，对切片进行脱蜡处理，然后在 37 摄氏度下用蛋白酶 K 工作溶液消化 30 分钟。消化结束时，用 PBS 冲洗组织，并用 3% 过氧化氢的 PBS 溶液封闭内源性过氧化物酶 10 分钟。

随后在 PBS 中洗涤两次 5 分钟后，任何非特异性抗体与 PBS 中的 10% 血清结合。然后将组织和目标抗体在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，用 PBS 洗涤 3 次 5 分钟来冲洗切片。

然后将组织与适当的生物素化二抗在室温下孵育 1 小时。在二抗标记期的最后 30 分钟内，每个切片平衡 50 μL 亲和素溶液和 50 μL 生物素化过氧化物酶 H，在室温下放置 30 分钟。然后在 PBS 中洗涤切片 2 次，每次 5 分钟，并在室温下用 100 μL 亲和素生物素 ABC 复合物处理组织。

45 分钟后，在 PBS 中洗涤切片 2 次，并在过氧化物酶底物溶液中孵育组织，直至染色达到适当的强度水平。现在用蒸馏水洗涤切片 5 分钟，并在室温下用苏木精对细胞进行复染 10 分钟。复染后，再次用水洗涤组织。

然后将切片脱水并使用无水封片剂用盖玻片封固样品。然后可以在明场显微镜下评估切片。首先将成年雄性小鼠的皮肤从大腿、腰部和侧腹上取下，并在去除皮肤时固定皮肤。

然后收集位于后腿底部的腹股沟淋巴结周围的后皮下脂肪组织，用于脂肪细胞的培养。为了分析成脂分化，将分化的脂肪细胞培养物置于通风橱下，并用 PBS 轻轻洗涤细胞。接下来，将细胞固定在 2 mL 10% 甲醛中 60 分钟。

固定结束时，用水洗涤细胞，用 2 毫升 60% 异丙醇处理培养物 5 分钟，然后用 2 毫升油红 O 工作溶液处理。5 分钟后，用自来水冲洗细胞，直到水变清。并用苏木精对细胞进行复染，如刚才所示。

然后可以在相差显微镜下以 100 倍的放大倍率评估细胞。脂肪细胞的脂质会呈红色，细胞核会呈蓝色。这里显示了正常和高脂肪饮食小鼠的脂肪垫部分。

脂肪细胞大小和面积的定量清楚地表明，高脂肪饮食 6 周后脂肪细胞肥大，高脂肪饮食处理动物脂肪细胞大小增加证明了这一点。在用缺氧标志物哌莫硝唑治疗的小鼠中，脂肪组织的缺氧状态增加伴随着 HIF1 α 阳性脂肪细胞的增加。此外，来自敲除和对照窝配对的脂肪切片的隧道染色表明，脂肪细胞凋亡的增加与缺氧和缺氧诱导因子 1 α 表达的存在相关。

正如预期的那样，缺氧 24 小时后脂肪细胞中的 Hif1a 表达增加。此外，通过 QPCR 对 Hif 靶基因的定量表明，在低氧条件下 Hif1a 表达增加导致 Inos mRNA 表达增加。然而，RNA 干扰使 Hif1 或 2 α 沉默，在缺氧条件下使脂肪细胞免于凋亡，证实了 Hif α 在脂肪细胞凋亡中的缺氧感觉调节作用。

按照这些程序，可以进行所有分析，例如确定葡萄糖和胰岛素抵抗，以回答有关代谢变化和脂肪细胞功能障碍的其他问题。观看此视频后，您应该对如何进行脂肪细胞凋亡和缺氧研究的组织学分析有很好的了解。