Name: 成人脂肪细胞生物体的数字调控机制，通过分化与凋亡的动态平衡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学习利用组织学分析和免疫组化技术研究脂肪细胞稳态与分化机制，探索缺氧诱导脂肪细胞凋亡的分子通路。该方法为肥胖和II型糖尿病等代谢疾病研究提供基础实验方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者谨此感谢 J. Luther 博士和 K. Ubieta 在数据准备方面提供的帮助，以及 B. Grötsch 博士对稿件的校对。本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号 BO3811/1-1-Emmy Noether）资助。

<ol><li>Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).</li>
<li>Gong, Z., Muzumdar, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+function%2C+type+2+diabetes%2C+and+metabolism+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging.</a> Int J Endocrinol. , 320482(2012).</li>
<li>Deng, Y., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+as+novel+biomarkers+and+regulators+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome.</a> Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).</li>
<li>Rezaee, F., Dashty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adipose+Tissue+in+Metabolic+System+Disorders+Adipose+Tissue+is+the+Initiator+of+Metabolic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases.</a> J Diabetes Metab. , 008(2013).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+fat+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of fat expansion.</a> J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).</li>
<li>Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+adipocyte+differentiation+in+different+fat+depots%3B+implications+for+pathophysiology+or+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1(2015).</li>
<li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+adipocyte+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metab. 4, 263-273 (2006).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Fra-1+expression+causes+severe+lipodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy.</a> J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fra-2%2FAP-1+controls+adipocyte+differentiation+and+survival+by+regulating+PPARgamma+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia.</a> Cell Death Differ. , (2014).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+O2+homeostasis+by+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).</li>
<li>Kim, W., Kaelin, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+protein%3A+new+insights+into+oxygen+sensing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).</li>
<li>Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensors+at+the+crossroad+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensors at the crossroad of metabolism.</a> Cell Metab. 9, 11-22 (2009).</li>
<li>Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+ameliorates+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction.</a> Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).</li>
<li>Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipogenesis+and+lipolysis+in+the+mouse+upon+selective+ablation+of+the+retinoid+X+receptor+alpha+mediated+by+a+tamoxifen-inducible+chimeric+Cre+recombinase+%28Cre-ERT2%29+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).</li>
<li>Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+hormones+determine+sensitivity+to+central+leptin+and+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin.</a> Diabetes. 55, 978-987 (2006).</li>
<li>Haluzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+%28C57BL%2F6J+versus+FVB%2FN%29+strongly+influences+the+severity+of+diabetes+and+insulin+resistance+in+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Planat-Benard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+human+adipose+lineage+cells+toward+endothelial+cells%3A+physiological+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives.</a> Circulation. 109, 656-663 (2004).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).</li>
<li>Trajcevski, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+lipid+oxidation+and+maintenance+of+muscle+insulin+sensitivity+despite+glucose+intolerance+in+a+diet-induced+obesity+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model.</a> PLoS One. 8, 71747(2013).</li>
<li>Montgomery, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain-dependent+variation+in+obesity+and+glucose+homeostasis+in+response+to+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding.</a> Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).</li>
<li>de Queiroz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+driving+retroperitoneal+adipocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+response+to+a+high-sugar+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet.</a> Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+adipose+tissue+hypoxia+in+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.</a> Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+corticotropin-releasing+hormone+receptor+2+signalling+pathway+partly+mediates+hypoxia-induced+increases+in+lipolysis+via+the+cAMP-protein+kinase+A+signalling+pathway+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue.</a> Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).</li>
<li>Bozec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+size+is+controlled+by+Fra-2+through+LIF%2FLIF-receptor+signalling+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia.</a> Nature. 454, 221-225 (2008).</li>
<li>Varia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimonidazole%3A+a+novel+hypoxia+marker+for+complementary+study+of+tumor+hypoxia+and+cell+proliferation+in+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).</li>
<li>Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+protein+coordinates+dynamic+assembly+of+HIF-1alpha-PHD-VHL+to+regulate+HIF-1alpha+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability.</a> Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).</li>
<li>Tennant, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivating+HIF+prolyl+hydroxylases+under+hypoxia+results+in+metabolic+catastrophe+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death.</a> Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).</li>
<li>Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1alpha+Upregulation+due+to+Depletion+of+the+Free+Ubiquitin+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+medical+science%22%5BJournal%5D)">HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool.</a> Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).</li>
<li>Amelio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+opposes+tumor+angiogenesis+by+promoting+hypoxia-inducible+factor+1alpha+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+remodeling+under+ischemia%3A+death+of+adipocytes+and+activation+of+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells.</a> Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> J Diabetes Res. 2015, 970375(2015).</li>
<li>Keuper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inflammatory+micro-environment+promotes+human+adipocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis.</a> Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).</li>
<li>Sera, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+origin+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+hematology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell origin of adipocytes.</a> Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+from+lipid+storage+compartment+to+endocrine+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.</a> Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

脂肪细胞在表型上以其大小、数量和面积为特征，这些特征揭示了由于营养过剩导致能量过度储存所引发的脂肪细胞增生和肥大5。这些事件导致脂肪酸代谢失调及继发性代谢综合征，但也存在脂肪质量增加而代谢仍保持正常的状态，这种状态也被称为&#34;健康&#34;性脂肪扩张。例如，Kusminski et al.21研究表明，发生显著脂肪扩张的小鼠仍可保持代谢健康，提示脂肪扩张并不必然与代谢综合征相关，需谨慎评估脂肪细胞的特性。脂肪组织（AT）在机体代谢调控中发挥关键作用。AT是人体最大的内分泌器官，可影响血脂异常、动脉粥样硬化、高胰岛素血症和高血糖3。评估AT的稳态及其调控的分子机制，有助于更深入理解代谢系统紊乱。因此，阐明调控脂肪细胞分化、脂肪细胞大小及脂肪垫质量的机制，将有助于开发针对肥胖相关疾病的新型治疗策略。通过体内（in vivo）和体外（in vitro）方法，可确定食物和基因表达对脂肪细胞分化与活性的影响。为评估AT稳态，根据本方案建议，确定脂肪细胞分化、增殖与凋亡之间的平衡，与分析葡萄糖和胰岛素代谢反应同等重要22-24。
对原代脂肪细胞和内脏脂肪组织中参与脂肪生成、脂质合成、脂解、脂肪酸摄取、缺氧、凋亡及增殖相关基因进行表达谱分析，是一种高通量获取脂肪细胞稳态及其潜在功能障碍概况的方法。有研究价值的候选基因应进一步通过蛋白质印迹或免疫组织化学染色在蛋白水平进行分析。为了在使用不对称氰化染料的实时PCR系统中获得最佳结果，应测试1至10 ng的cDNA浓度以及50至900 nM的最佳引物浓度，以最大限度减少非特异性扩增。关键组分是引物；每次实验均需严格控制熔解曲线，以确保扩增特异性并排除引物二聚体的形成。因此，建议使用以H2O代替cDNA的阴性对照。此外，市售的不对称氰化染料通常以预混液形式提供，其中包含被动参比染料（如ROX），用以提供内部参考信号。在数据分析过程中，cDNA信号将被标准化为ROX信号，以校正孔间信号波动。为了建立良好的qPCR系统，另一个需要考虑的因素是内参基因的选择。在每种实验条件下，应使用多个内参基因，例如HPRT、β-actin、GAPDH、β-2-MG或HSP90。
在缺氧条件下稳定的HIF蛋白是决定脂肪细胞存活以及葡萄糖代谢、胰岛素耐受性和脂质代谢等代谢变化的关键调控因子11,25,26。为了确定脂肪垫中的缺氧区域，可通过免疫组织化学方法检测脂肪组织（AT）切片中的HIF-1α表达。由于HIF蛋白在常氧条件下会在5至10分钟内迅速降解，因此组织处理及脂肪垫固定过程必须严格控制，以避免操作延迟。因此，除了通过HIF染色确认缺氧状态外，还使用匹莫尼唑（pimonidazole）来标记AT中的缺氧区域。匹莫尼唑能够扩散进入组织——此前已在骨组织中得到证实27——并在缺氧细胞中特异性地与含硫醇的蛋白质结合，从而有效标记缺氧区域，随后通过特异性抗体结合在组织切片中进行检测28。然而，也可采用其他标志物和方法来分析缺氧信号通路。例如，为了全面了解该通路，还需分析脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase, PHD）的作用，该酶在常氧条件下可催化脯氨酸残基的羟基化；以及冯·希佩尔-林道（von Hippel-Lindau, VHL）蛋白的作用，该蛋白可识别羟基化的脯氨酸残基，并介导HIF的多聚泛素化，从而导致其经由蛋白酶体途径降解29,30。此外，对HIF的广泛性检测还可反映其蛋白稳定性及降解过程，这些过程可能发生改变31,32。
此外，通过Ki67染色检测细胞增殖，通过TUNEL染色检测细胞凋亡 体内 通过AT组织切片染色实现。还通过流式细胞术分析Ki67染色检测细胞增殖，以及TUNEL或Annexin V染色检测细胞凋亡进行定量分析 33增殖当然也可以通过其他技术来测定，例如分析脂肪细胞周期，而Ki67阳性细胞的检测并不能反映这一过程。此外，TUNEL法检测凋亡可结合Annexin V和TO-PRO-3的流式细胞术（FACS）分析，以区分坏死与凋亡性细胞死亡的程度。凋亡是细胞程序性死亡的基本过程，对脂肪组织（AT）稳态具有重要意义。事实上，脂肪细胞凋亡的失调此前已被认为参与了肥胖症和脂肪营养不良等病理过程。 34此外，2011年，Keuper 等 将脂肪组织炎症与脂肪细胞凋亡联系起来。他们发现，巨噬细胞可诱导前脂肪细胞和脂肪细胞发生凋亡，而凋亡的细胞反过来又会招募巨噬细胞。巨噬细胞的募集加剧了炎症反应，进而促进葡萄糖耐受和胰岛素耐受等代谢综合征的发生 35然而，尽管有假说认为诱导脂肪细胞凋亡可能减轻体重，脂肪细胞凋亡仍是一个研究较少的现象。
本实验方案采用免疫组织化学方法研究增殖、凋亡和缺氧等不同现象 体内因此，组织需用4%甲醛固定，这是关键步骤。过长的固定时间会导致表位发生改变，从而使抗体无法接触；而过短的固定时间则会增加表位对试剂的敏感性。推荐的最佳固定时间为24小时。此外，切片厚度也会影响抗体与其表位的结合，最佳厚度为2至5 µm。厚于5 µm的切片会因结合位点增多而产生假阳性结果；相反，薄于2 µm的切片结合位点较少，阳性区域显示不清。其他关键因素还包括抗体本身、孵育时间、浓度甚至温度，这些均会影响抗体与表位特异性结合的质量。因此，针对每种实验条件，均需验证抗体浓度和孵育时间。
为完成本研究，我们提供了一个 体外 脂肪细胞分化方案，可通过不同处理、刺激或共培养进行扩展。通过使用 体外 脂肪细胞培养可用于确定脂肪细胞分化及功能方面的缺陷。为了获得可靠的结果，与所有原代细胞一样，ADSCs和脂肪细胞的健康状态及形态特征至关重要。颗粒增多、胞质空泡化和/或细胞脱落是细胞退化的表现，提示培养基成分不当、微生物污染或原代细胞衰老。本方案采用从脂肪组织脂肪垫中分离的脂肪细胞，但也可使用骨髓来源的间充质干细胞，具体方法可参考其他已发表的实验方案。 36最新的研究包括间质祖细胞，这可能反映了脂肪细胞分化最初阶段出现的额外分化问题，而这些问题可能在我们目前的方案中被遗漏。此外，ADSCs能够快速扩增（一周内超过10倍），经过多次传代的长期培养后，ADSCs仍能保持其间充质多能性 37,38使用ADSCs的另一个优势在于可以轻松过渡到人类应用，因为可通过吸脂术从患者体内获取ADSCs，而吸脂术是一种简单且微创的方法。
由于脂肪组织以内分泌方式影响多个其他器官，因此该方案应扩展至脂肪因子的检测。脂肪细胞分泌的脂肪因子，如瘦素（leptin）、脂联素（adiponectin）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和抵抗素（resistin），已被证实可通过调控脂肪代谢、能量稳态和胰岛素敏感性来影响代谢性疾病39。因此，应进行血清和脂肪细胞分泌组分析。在脂肪组织功能障碍的情况下，脂肪因子和促炎性细胞因子（如IL-6）可能导致肝脏、胰腺以及肌肉功能的失调4。为排除系统性器官功能障碍，可利用动物模型或细胞培养体系检测其对葡萄糖刺激和摄取的反应能力。
本文提供了一种用于分析脂肪组织（AT）及脂肪细胞基础状态的实验方案 体内 和 体外 揭示脂肪细胞稳态与功能的分子机制。

根据世界卫生组织2014年的报告，全球39%的成年人超重，13%为肥胖1。在不久的将来，超重人群将占老年人口的很大比例。肥胖与衰老的一个重要特征是脂肪在发病率和死亡率方面的调节失常2。脂肪因子（adipokines）是由脂肪组织（AT）分泌的蛋白质，可引发肥胖和2型糖尿病等代谢综合征3。代谢性疾病主要由脂肪细胞内脂滴中过度的能量储存引起，从而导致脂肪组织扩张4。因此，明确脂肪组织扩张的原因及其分子机制，对于寻找干预和控制策略具有重要意义。
营养过剩会导致脂肪组织（AT）扩张，这一过程受两个事件调控：一是过量能量储存至脂肪细胞的脂滴中，导致脂肪细胞肥大（即脂肪细胞体积增大）；二是脂肪生成增加，也称为脂肪细胞增生5。脂肪生成是指多能间充质干细胞（MSC）分化为脂肪细胞的过程。首先，在定型阶段，MSC分化为前脂肪细胞；随后，前脂肪细胞进一步分化，获得成熟且具有功能的脂肪细胞特征6。已有多个转录因子被确认为前脂肪细胞决定的关键主调控因子，例如锌指蛋白423（Zfp423）和早期B细胞因子1（Ebf1）。其中Zfp423促进早期定型，而Ebf1则对脂肪细胞前体的生成至关重要6。终末分化过程由一个转录级联反应严格调控，其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是必需的核心转录因子7。其他关键的转录因子还包括CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）家族成员（即 C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ）、Kruppel样因子（KLFs）、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）以及早期生长反应20（Krox20）6。
最近研究表明，激活蛋白-1（AP-1）家族参与了脂肪细胞分化过程 8,9AP-1 家族由 Fos、Jun 和/或激活转录因子（ATF）成员组成的二聚体蛋白复合物构成。Fos 相关抗原 1 和 2（Fra-1 和 Fra-2）能够调控脂肪细胞分化。Fra-1 通过抑制 C/EBPα 来阻碍脂肪细胞分化。 8而 Fra-2 调控脂肪细胞的更新 9因此，Fra-2不仅通过抑制脂肪细胞分化过程中PPARγ2的表达来减少脂肪细胞数量，还通过直接抑制缺氧诱导因子（HIFs）的表达来降低脂肪细胞凋亡。HIF家族是一类异源二聚体转录因子复合物，由HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β组成。该异源二聚体由一个氧敏感的HIF-α蛋白（HIF-1α或HIF-2α）和一个氧不敏感的HIF-1β亚基构成。 10在常氧条件下，HIF-α 蛋白被多聚泛素化，最终由蛋白酶体降解。 11在扩增过程中脂肪组织（AT）内出现的低氧条件下，HIF-α蛋白不再发生羟基化，因而得以稳定并与其持续表达的HIF-1β亚基形成二聚体。由HIF反应元件调控的基因转录激活参与血管生成、代谢及炎症反应的调节。 12事实上，HIF-1α 通过诱导葡萄糖耐受、抑制能量消耗和外周脂质利用，以及升高瘦素水平和加剧高脂饮食诱导的肝脂肪变性，促进脂肪组织功能障碍。 13此外，HIF-1α 调控脂肪细胞凋亡 在体 和 体外9.
本方案描述了研究成年小鼠脂肪组织状态以揭示脂肪细胞稳态分子特征的方法。内容展示了脂肪细胞的凋亡、增殖和分化过程 体内 和 体外 可受低氧调节。为此，我们采用将携带 Fra-2 基因 floxed 等位基因的小鼠与 Fabp4-CreERT 小鼠杂交，获得脂肪细胞特异性敲除 Fra-2 的小鼠模型 9通过使用Fabp4-Cre ERT小鼠，可在脂肪细胞中特异性地诱导敲除，并通过注射他莫昔芬进行诱导 14对于成年模型，从6周龄开始，连续5天进行腹腔注射他莫昔芬。因此，在分析前，小鼠将接受正常饮食或高脂饮食喂养6周。本研究使用的是基于C57Bl6背景的雄性小鼠，以避免雌激素等女性激素对体脂分布的调节作用。 15使用其他遗传背景也可能改变代谢表型，这是由于品系间在脂质代谢方面的差异所致 16.
本方案演示了如何在缺氧条件下通过组织学方法分析脂肪组织，并定量检测脂肪细胞的凋亡、增殖和分化 体内 通过免疫组织化学和基因表达谱分析完成。该研究由 体外 实验，展示如何分析缺氧暴露引起的原代脂肪细胞分化与凋亡的变化。

<table><tbody><tr><td>RNA保存液 RNAlater 溶液</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>RNA 稳定溶液</td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select 主混合液</td><td>4472908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯化小鼠抗人 Ki-67 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>克隆株 B56 (RUO)</td></tr><tr><td>纯化小鼠抗人 Ki-67 克隆株 B56 (RUO)</td><td>550609</td><td>增殖标志物</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记 Annexin V</td><td>BioLegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>裂解型 Caspase-3 兔单克隆抗体</td><td>Cell signalling</td><td>9664S</td><td>克隆株 5A1E</td></tr><tr><td>裂解型 Caspase-3 (Asp175) (5A1E) 兔单克隆抗体</td><td>9664</td><td>凋亡标志物</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000 转染试剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 碘化物</td><td>T3605</td><td>细胞核复染剂，单体花青类核酸染料，激发波长&amp;frasl;发射波长：642&amp;frasl;661 nm</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s 苏木精染液</td><td>Merck</td><td>109249</td><td>苏木精</td></tr><tr><td>pegGOLD TriFast</td><td>Peqlab</td><td>30-2030</td><td>TRIzol，含硫氰酸胍与苯酚的单相溶液</td></tr><tr><td>Precellys 陶瓷研磨套件 1.4&amp;nbsp;mm</td><td>91-PCS-CK14</td><td>含陶瓷珠（1.4 mm）的研磨管</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>91-PCS24</td><td>组织匀浆器</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alpha 抗体</td><td>Pierce</td><td>PA1-16601</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alpha 抗体，16H4L13</td><td>700505</td><td>缺氧标志物</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt; 细胞死亡检测试剂盒，荧光素标记</td><td>Roche</td><td>11 684 795 001</td><td>TdT 介导的 dUTP 生物素缺口末端标记法 (TUNEL)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma</td><td>318906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 溶液（1&amp;nbsp;单位/&amp;micro;l）</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>BA-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC 试剂盒</td><td>PK-4000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片介质</td><td>H-1200</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过分化与凋亡稳态调节成年生物体脂肪细胞数量的机制

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

考虑到脂肪组织（AT）是一种内分泌器官，它能够影响全身代谢。过度的能量储存会导致脂肪细胞功能失调，进而引发脂肪因子分泌异常，触发肥胖、血脂异常、高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢综合征。因此，研究脂肪细胞功能失调背后的分子机制，有助于开发新的治疗策略。本方案描述了用于评估成年小鼠脂肪组织在缺氧条件下受影响的分子机制的方法，该条件与脂肪细胞凋亡相关。本方案介绍了如何分析脂肪组织 体内 通过基因表达谱分析以及缺氧暴露期间脂肪细胞分化、增殖和凋亡的组织学分析（通过缺氧细胞染色或HIF-1α蛋白检测确认），进一步 体外 脂肪细胞分化及其对各种刺激反应的分析，完善了对可能导致代谢综合征的脂肪细胞功能障碍相关分子通路的表征。

我们展示了如何测定脂肪细胞稳态 体内 和 体外 以 Fra-2 为例fl/fl 与野生型同窝小鼠相比，Fabp4-CreERT 小鼠中缺氧诱导的 HIF 表达升高与脂肪细胞功能障碍相关，表现为脂肪细胞凋亡增加。本方案明确了这一关联机制。
高脂饮食（HFD）处理小鼠的脂肪细胞体积和面积增加
营养过剩等因素会导致脂肪细胞肥大，其原因是脂滴中过度储存能量所致。脂肪细胞的大小和面积是判断肥大的指标。正常饮食（ND；图6a）和高脂饮食（HFD；图6b）小鼠脂肪组织切片以及脂肪细胞大小和面积的定量分析结果清楚显示，经过6周高脂饮食后出现明显的脂肪细胞肥大，表现为高脂饮食处理小鼠的脂肪细胞尺寸显著增大（图6c 和 d）。
成年 Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 小鼠脂肪组织（AT）中缺氧程度增加，导致 HIF-1α 水平升高以及脂肪细胞凋亡
为确定脂肪组织（AT）中缺氧的体内状态，对12周龄时经Fra-2缺失处理6周的Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT小鼠进行分析，并与野生型同窝小鼠进行比较。通过腹腔注射给予小鼠匹莫尼唑，作为一种有效的缺氧标志物；该物质无毒且能够分布至脂肪组织。脂肪组织中体内的缺氧脂肪细胞通过免疫组化抗体染色进行鉴定（图7a）。此外，小鼠脂肪组织缺氧状态的增强伴随着HIF-1α阳性脂肪细胞数量的增加，免疫组化染色结果（图7b）显示了这一点，并通过HIF-1α表达水平及其靶基因的定量分析得到证实9。另外，对Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT小鼠及其对照同窝小鼠的脂肪组织切片进行TUNEL染色（图7c）显示，脂肪细胞凋亡的增加与缺氧及HIF-1α表达的存在相关。
通过缺氧诱导脂肪细胞凋亡，增加原代脂肪细胞中HIF-1α的表达
分析脂肪细胞凋亡 体外我们采用如其他文献所述方法，由皮下脂肪垫生成的脂肪细胞 20. 与预期一致，脂肪细胞中HIF-1α的表达在缺氧24小时后增加（图8a）。为了进一步分析HIF-1α的活性，通过qPCR定量检测HIF靶基因（如Inos（诱导型一氧化氮合酶））的RNA水平。 图8b 表明在缺氧条件下HIF-1α表达升高可导致iNOS mRNA水平上升。由于我们已经证明 体内 (图8) 脂肪细胞中HIF-1α表达升高与脂肪细胞凋亡增加相关，同时也对凋亡进行了定量分析 体外 在缺氧条件下通过Annexin V染色检测细胞培养。结果与 体内 数据（图7），缺氧条件下 HIF-1α 水平升高伴随着脂肪细胞凋亡的增加图8b此外，为了证明缺氧诱导的凋亡依赖于HIF，采用RNA干扰技术在来自野生型或Fra-2缺陷型小鼠的脂肪细胞中沉默HIF-1α或HIF-2α。通过Annexin V染色显示，沉默HIF-1α或HIF-2α可恢复增高的脂肪细胞凋亡水平 图8b，证明低氧感应器HIF-α调控脂肪细胞凋亡。
<img alt="脂肪细胞组织学及大小分析；显微镜图像与图表比较正常饮食与高脂饮食的影响。" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
图6：高脂饮食（HFD）小鼠脂肪细胞大小和面积增加。（a，b）雄性野生型小鼠摄取正常饮食（ND）（a）或高脂饮食（HFD）（b）6周后，取其睾周脂肪组织切片进行H&amp;E染色。标尺代表500 μm。（c，d）野生型小鼠摄取ND（a）或HFD（b）6周后，睾周脂肪组织中脂肪细胞大小（c）和面积（d）的定量分析。n = 10。数据以均值±标准误表示。统计学分析采用Student's t-检验。***p &lt;0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="缺氧、HIF1α、TUNEL 检测示意图显示 Fra-2 ΔAdip 的影响；20x、40x 放大倍数下的显微图像。" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 7"> 
图 7：成年 Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 小鼠脂肪细胞中 HIF-1α 水平升高及细胞凋亡增加。雄性 Fra-2fl/fl Fabp4-creERT 小鼠及其对照 littermates 在注射他莫昔芬后 6 周，脂肪组织（AT）中的缺氧（a）和 HIF-1α（b）染色结果。放大倍数为 20X，插图为 40X。黑色箭头指示缺氧区域和 HIF-1α 阳性细胞。（c）Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 小鼠及其对照 littermates 在注射他莫昔芬后 6 周的脂肪组织 TUNEL 染色结果。放大倍数为 20X，插图为 40X。黑色箭头指示 TUNEL 阳性细胞。本图经 Luther et al. 9 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Hif1α 和 Inos 表达的柱状图；Annexin V 凋亡检测结果，氧气变化。" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 8"> 
图 8： 缺氧诱导的原代脂肪细胞中 HIF-1α 表达增加及脂肪细胞凋亡。 （a）将原代脂肪细胞置于缺氧环境中，在指定时间点检测 HIF-1α 及其靶基因 Inos 的 mRNA 水平的实时 PCR 分析结果。 （b）通过 Annexin V FACS 染色定量分析来自 Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 小鼠或野生型对照小鼠的原代脂肪细胞的凋亡情况，这些细胞转染了对照 shRNA 或针对 HIF-1α 或 HIF-2α 的 shRNA 质粒，并在低氧条件（1% O2）下培养 24 小时。该图改编自 Luther et al. 9。数据以均值 ± 标准差表示。统计学分析采用 Student's t-检验。*P &lt;0.05 和 **P &lt;0.01 被认为具有显著性差异。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

脂肪组织（AT）可影响机体全身的稳态，因此了解脂肪细胞分化与功能的分子机制具有重要意义。本文提供了一种实验方案，通过分析脂肪细胞的稳态、分化过程以及缺氧暴露（作为诱导脂肪细胞凋亡的模型），以深入理解这些生物学过程。

考虑到脂肪组织（AT）是一种内分泌器官，它能够影响全身代谢。过量的能量储存会导致……

这些实验的总体目标是分析脂肪细胞的稳态与分化，并探究缺氧及脂肪细胞凋亡的机制。该方法有助于回答代谢领域中的关键问题，例如肥胖和2型糖尿病。该技术的主要优势在于其为基础且成本低廉，可对特定研究模型中的脂肪细胞生物学进行分析。我实验室的博士生 Nicole Hannemann 将演示该实验步骤。为了在活体中定量缺氧情况，首先确定小鼠的体重，然后按每公斤体重 60 mg 的剂量腹腔注射盐酸匹莫硝唑（pimonidazole hyrochloride）。45分钟后固定动物的四肢，打开腹腔。从腹腔中取出左侧和右侧围生殖腺脂肪垫，并将生殖腺组织从脂肪垫中剥离。然后称量组织重量，以确定脂肪垫重量与体重的比值（单位：克）。为进行脂肪细胞稳态的组织学分析，首先用二甲苯洗涤脂肪组织切片三次，每次五分钟，随后用100%乙醇再水化两次，每次两分钟，再用96%乙醇再水化两次，每次两分钟。然后将切片在蒸馏水中洗涤五分钟，并在室温下用苏木精染色10分钟。染色孵育结束后，将切片再次用水洗涤五分钟，随后用伊红溶液染色30秒。按照上述方法清洗切片，然后将切片依次浸入96%乙醇和100%乙醇中各两次，每次两分钟进行脱水。随后进行三次二甲苯孵育，每次五分钟。然后使用无水封片剂对切片进行封片。对于组织的免疫组织化学分析，将切片按上述方法脱蜡后，用蛋白酶K工作液在37摄氏度下消化30分钟。消化结束后，用PBS缓冲液冲洗组织，并用含3%过氧化氢的PBS溶液阻断内源性过氧化物酶，孵育10分钟。在 PBS 中连续进行两次五分钟的洗涤后，用含 10% 血清的 PBS 封闭非特异性抗体结合位点。然后将组织与目的抗体在 4°C 下孵育过夜。次日早晨，用 PBS 进行三次、每次五分钟的漂洗。 然后在室温下用相应的生物素化二抗孵育组织1小时。在二抗标记阶段的最后30分钟内，每张切片用50微升亲和素溶液与50微升生物素化辣根过氧化物酶H在室温下平衡30分钟。随后用PBS洗涤切片两次，每次5分钟，并在室温下用100微升亲和素-生物素-ABC复合物处理组织。孵育45分钟后，用PBS洗涤切片两次，然后将组织置于过氧化物酶底物溶液中孵育，直至染色达到适当的强度。随后用蒸馏水洗涤切片5分钟，并在室温下用苏木精对细胞复染10分钟。复染后再次用水洗涤组织。然后将切片脱水，并使用无水封片剂将样本用盖玻片封片。随后可在明场显微镜下观察切片。首先将成年雄性小鼠大腿上部、腰部和 flank 部位的皮肤剥离，并在剥离过程中用大头针固定皮肤。然后收获位于后肢基部的腹股沟淋巴结周围的后侧皮下脂肪组织，用于脂肪细胞的培养。为分析脂肪生成分化，将已分化的脂肪细胞培养物置于通风橱内，用 PBS 轻柔洗涤细胞。接着用 2 mL 10% 福尔马林固定细胞 60 分钟。固定结束后，用清水洗涤细胞，然后向培养物中加入2毫升60%异丙醇处理5分钟，随后加入2毫升油红O工作液。5分钟后，用自来水冲洗细胞，直至水流清澈为止。然后按照刚刚演示的方法用苏木精对细胞进行复染。随后可在相差显微镜下以100倍放大倍数观察细胞。脂肪细胞中的脂质呈红色，细胞核呈蓝色。此处展示了正常饮食和高脂饮食小鼠脂肪垫的切片。脂肪细胞大小和面积的定量分析明确显示，经过六周高脂饮食后，实验动物脂肪细胞体积增大，表明出现了脂肪细胞肥大。在用缺氧标记物匹莫尼达唑处理的小鼠中，脂肪组织缺氧状态的增强伴随着HIF1α阳性脂肪细胞数量的增加。此外，对基因敲除小鼠及其对照组 litter mates 的脂肪组织切片进行TUNEL染色表明，脂肪细胞凋亡的增加与缺氧及缺氧诱导因子1α表达的存在相关。与预期一致，脂肪细胞中 Hif1a 的表达在缺氧 24 小时后增加。此外，通过 QPCR 对 Hif 靶基因进行定量分析表明，缺氧条件下 Hif1a 表达的升高导致 Inos mRNA 表达增加。然而，在缺氧条件下，通过 RNA 干扰沉默 Hif1 或 Hif2 alpha 可使脂肪细胞免于发生凋亡，从而证实了 Hif alpha 在脂肪细胞凋亡中的缺氧感应调控作用。通过这些实验步骤，可以开展各种检测，如测定葡萄糖水平和胰岛素抵抗，以进一步探讨代谢变化和脂肪细胞功能障碍的相关问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何进行脂肪细胞凋亡和缺氧研究的组织学分析。

mechanism-regulation-adipocyte-numbers-adult-organisms-through

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

成人脂肪细胞生物体的数字调控机制，通过分化与凋亡的动态平衡

从小鼠白色脂肪组织中分离得到的原代白色前脂肪细胞可分化为米色/褐色样细胞。本文介绍了一种可靠的细胞模型系统，用于研究白色脂肪“褐变”的分子调控机制。...

基质血管细胞的分离与向米色/褐色样细胞的分化

本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。...

通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

膜成熟脂肪细胞聚集体培养（MAAC）是一种培养成熟人脂肪细胞的新方法。本文详细介绍了如何从人脂肪组织中分离脂肪细胞，以及如何建立MAAC培养体系。...

利用膜成熟脂肪细胞聚集体培养法（MAAC）分离与培养人成熟脂肪细胞

本报告描述了一种从新生小鼠中同时分离原代棕色和白色前脂肪细胞的实验方案。分离得到的细胞可在体外培养，并可诱导其分化为完全成熟的白色和棕色脂肪细胞。该方法可用于在培养条件下对原代脂肪细胞进行遗传学、分子水平及功能特性分析。...

从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞

该方案可从诱导性多能干细胞（iPSCs）中获得纯化的脂肪细胞群体。首先使用视黄酸将iPSCs分化为间充质干细胞（MSCs），再利用这些MSCs生成脂肪细胞。随后，通过尼罗红染色结合分选方法，获得纯化的脂肪细胞。...

稳健地将人iPSCs分化为纯脂肪细胞群体以研究脂肪细胞相关疾病

本方案描述了从小鼠皮下脂肪中分离前脂肪细胞、将其分化为成熟脂肪细胞以及诱导胰岛素抵抗的方法。通过蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路中相关蛋白的磷酸化/活化水平，以评估胰岛素作用。该方法可直接测定原代脂肪细胞中的胰岛素抵抗/敏感性。...

原代培养中分化的鼠脂肪细胞：胰岛素抵抗模型

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。...

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

成熟脂肪细胞的尺寸和脆弱性限制了可用于其研究和分离的技术与工具。本文介绍了一种分离成熟小鼠脂肪细胞的方案，该方案可轻松适用于不同的脂肪组织库和小鼠饮食模型。...

从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

学习利用组织学分析和免疫组化技术研究脂肪细胞稳态与分化机制，探索缺氧诱导脂肪细胞凋亡的分子通路。该方法为肥胖和II型糖尿病等代谢疾病研究提供基础实验方案。

通过分化与凋亡稳态调节成年生物体脂肪细胞数量的机制

探索更多视频