使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本实验的总体目标是利用非整合型附加体质粒，从成人外周血单个核细胞中生成诱导多能干细胞（iPS细胞）。该方案可为希望利用iPS细胞进行疾病监测、药物筛选以及常规再生医学研究的干细胞领域科研人员提供帮助。我们的重编程方案操作简便，且效率极高。

通过此操作流程，可轻松掌握血细胞重编程技术。血浆质量对成功重编程至关重要。污染物可能降低重编程效率，因此我们建议使用无内毒素试剂盒纯化附加体质粒。

iPS 细胞比其他细胞更脆弱。在传代过程中同时进行多个基因操作可能会导致大量细胞死亡，尤其是在早期传代时。开始此操作前，请根据随附的手稿准备所有所需的培养基。

然后将10 mL新鲜的PB样本与10 mL PBS缓冲液加入50 mL离心管中，充分混匀。使用前将PBS缓冲液升至室温或37摄氏度。接着，将10 mL Ficoll缓慢加入离心管底部。

此操作应缓慢进行，以确保 ficoll 层不与外周血混合。以 400 × g 离心 30 分钟，加速度和减速度均设为低。离心后，外周血单个核细胞位于外周血血浆层与 ficoll 层之间的白色界面层。缓慢吸除 10 mL 外周血血浆，注意不要扰动白膜层与 ficoll 层。

然后小心地将白色层收集到一个新的50 mL离心管中。从白色层收集的细胞总体积应约为3至6 mL。之后，加入PBS使总体积达到30 mL，并充分混匀。

然后以 400 × g 离心样品 10 分钟。10 分钟后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 20 mL 培养基中。充分混匀后，以 400 × g 再次离心样品 5 分钟，以去除大部分血小板。

随后，去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 至 2 mL 的 IMDM 中。细胞可立即用于培养，或冻存以备后续使用。如需冷冻保存，应加入等体积的冻存液。

将细胞分装至冻存管中，并立即转移至-80摄氏度冰箱。在此步骤中，于15 mL离心管中准备5 mL IMDM培养基。在将冻存的外周血单个核细胞（PB MNCs）转移至含IMDM培养基的离心管前，需将其在37摄氏度水浴中快速解冻。

将样品在400 × g离心5至10分钟。随后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于红系培养基中。然后使用血细胞计数板在显微镜下对细胞进行计数。

随后，将外周血单个核细胞（PB MNCs）接种于未经组织培养处理的六孔板中，每孔加入2 mL培养基，在37°C、5%二氧化碳、湿度饱和的培养箱中培养。在第1、第3和第5天，每孔直接添加1 mL新鲜的红系培养基，不更换原有培养基。第6天收集外周血单个核细胞用于核转染。

转染前一天，用 0.1% 明胶在 37 摄氏度下预包被组织培养处理的六孔板，孵育 20 分钟。在 37 摄氏度水浴中解冻灭活的 MEF 饲养层细胞，并立即转移至含有 5 mL MEF 培养基的 15 mL 离心管中。随后，在 400 × g 条件下离心 5 分钟，并弃去上清液。

然后从六孔板中移除明胶，并将细胞沉淀重悬于MEF培养基中。随后，将失活的MEF细胞以每孔2 mL MEF培养基接种至预先用明胶处理的六孔板中，在37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中培养。在核转染当天，吸除MEF培养基，并更换为1 mL红系培养基。

然后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中预平衡10至30分钟。在1.5 mL无菌离心管中加入2微克PEV OCT4至Sox2，1微克PEV MYC，1微克PEV KLF4，以及0.5微克PEV Bcl-XL。将离心管在50摄氏度加热5分钟以防止污染，随后冷却至室温。

随后，向样品中加入 57 微升核转染缓冲液和 13 微升补充缓冲液。通过在 200 × g 离心 7 分钟，将 2 × 10⁶ 个培养的外周血单个核细胞收集至一个 5 mL 离心管中。之后，弃去上清液，并将质粒与核转染缓冲液的混合物加入细胞沉淀中。

然后用手指轻弹管壁充分混匀。接着将细胞悬液中的 DNA 转移至试剂盒提供的电穿孔杯中，并盖上杯盖。在核转染仪上选择程序 U-008。

随后，将比色皿插入支架中并按下“确定”。之后，将比色皿从支架中取出。向每个比色皿中加入 0.5–1 mL 预先温育的红系培养基，并立即将细胞转移至预先平衡的 MEF 培养板中。对于某些样本，每毫升血液可能获得数千个克隆。

如果需要挑选单个菌落进行后续培养，可能需额外接种一个仅含100万细胞的孔。在将低氧培养箱放入培养箱之前，轻轻摇晃培养箱数次，以使培养孔中的细胞分布均匀。然后将培养板转移至低氧培养箱中。

以每分钟 20 升的流速向培养 chamber 中通入混合气体 1 至 2 分钟。随后密封培养 chamber，并在 37°C 条件下培养样品。核转染后第二天，直接向每个孔中加入 2 mL iPSC 培养基。

转染后第四天，移除 3 mL 培养基，加入 2 mL 新鲜的iPSC培养基。此时，大多数活细胞已贴附于饲养层上。转染后第六天起，每两天更换一次培养基，每次保留 500 微升用过的培养基，并加入 2 mL 新鲜的E8培养基，其中添加 0.25 mmol/L 的丁酸钠，持续至第14–18天。

此处展示的是重编程外周血细胞的实验方案示意图。该图像显示了培养皿中站立的碱性磷酸酶（AP）染色结果，另一张图像则显示了外周血单个核细胞（PB MNCs）经过核转染后第14天典型的类似胚胎干细胞（ESC）的诱导多能干细胞（iPSC）克隆形态。以下是第5代表达TRA-1-60或SSEA4的iPSC的代表性流式细胞术（FACS）分析图。

以下是表达 NANOG 和 OCT4 的诱导性多能干细胞（iPSC）集落的代表性共聚焦图像。这些图像显示了畸胎瘤的 H&E 染色结果，包含所有三个胚层。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人外周血单个核细胞中生成无整合的诱导性多能干细胞。

一旦掌握该技术，可在三周内生成大量诱导多能干细胞（iPS细胞），实际操作时间少于三小时。我们开发了一种简单且高效的基于附加体型载体的血液细胞重编程系统。我们相信，这一经济实惠的系统易于推广，尤其适用于资源有限的小型实验室。

请注意，处理人血和血浆可能存在危险，因此必须采取预防措施，例如在进行本操作时佩戴手套和实验服。