从人体外周血单个核细胞融合，无诱导多能干细胞的生成方法游离型载体

该程序的总体目标是使用非整合游离体载体从成人外周血单核细胞生成 iPS 细胞。该协议可以帮助干细胞领域的科学家生成用于疾病监测、药物筛选和常规放射医学的 iPS 细胞。我们的重编程方案非常简单，但效率很高。

遵循此程序，可以轻松掌握血细胞重编程技术。血浆的质量对于成功的重编程同样重要。污染物可能会降低重编程效率，因此我们建议使用 Endofree 试剂盒来纯化游离型质粒。

iPS 细胞比其他细胞更脆弱。在基因传递过程中为多个细胞准备细胞可能会诱导大量细胞死亡，尤其是在早期传代时。要开始此过程，请根据随附的手稿准备所有必需的培养基。

然后将 10 mL 新鲜 PB 样品和 10 mL PBS 缓冲液混合到 50 mL 试管中并充分混合。使用前将 PBS 加热至室温或 37 摄氏度。接下来，在试管底部加入 10 mL 的 ficoll。

这个过程应该缓慢进行，以确保 ficoll 层不与 PB 混合。以 400 x g 的离心速度离心混合物 30 分钟，同时保持低速加速和减速。离心后，PB MNC 位于 PB 血浆和 ficoll 之间的白色层中。缓慢吸出 10 mL PB 血浆，而不会干扰 buff ficoll 层。

然后小心地将白色层收集到新的 50 mL 试管中。从白色层收集的细胞总体积应约为 3 至 6 mL。之后，加入 PBS 使总体积达到 30 mL 并充分混合。

然后以 400 x g 离心样品 10 分钟。10 分钟后，去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 20 mL 培养基中。充分混合，并以 400 x g 离心样品 5 分钟，以去除大部分血小板。

随后，去除上清液并将细胞沉淀重悬于 1 至 2 mL IMDM 中。细胞可用于立即培养或冷冻以备后用。对于冻存，添加等量的冻存培养基。

将细胞分装到冷冻管中，并立即将其转移到 80 摄氏度的冰箱中。在此过程中，在 15 mL 试管中制备 5 mL IMDM 培养基。在 37 摄氏度水浴中快速解冻冷冻的 PB MNCs，然后将其转移到装有 IMDM 培养基的试管中。

将样品以 400 x g 离心 5 至 10 分钟。然后，去除上清液并将细胞沉淀重悬于红细胞培养基中。然后使用血细胞计数器在显微镜下计数细胞。

随后，在 37 摄氏度下，在 5% 二氧化碳加湿培养箱中，在非组织培养物处理的六孔板中培养 PB MNC，每孔 2 mL 培养基。第 3 天和第 5 天，直接在每个孔中加入 1 mL 新鲜红细胞培养基，无需更换培养基。第 6 天，收获 PB MNC 进行核转染。

转染前一天，在 37 摄氏度下用 0.1% 明胶预涂经组织培养物处理的六孔板 20 分钟。在 37 摄氏度的水浴中解冻灭活的 MEF 饲养层细胞，并立即将其转移至含有 5 mL MEF 培养基的 15 mL 试管中。然后，以 400 x g 的离心力离心 5 分钟，然后去除上清液。

然后从六孔板中取出明胶，并将细胞沉淀重悬于 MEF 培养基中。之后，将灭活的 MEF 细胞接种在明胶预处理的六孔板的每个孔中的 2 mL MEF 培养基中，并在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳加湿培养箱中培养。在核转染当天，吸出 MEF 培养基并用 1 mL 红细胞培养基替换。

然后在 5% 二氧化碳加湿培养箱中，在 37 摄氏度下将培养板预平衡 10-30 分钟。在 1.5 mL 无菌试管中，向 Sox2 中加入 2 μg PEV OCT4、1 μg PEV MYC、1 μg PEV KLF4 和 0.5 μg PEV Bcl-XL。将试管在 50 摄氏度下加热 5 分钟以防止污染，然后将其冷却至室温。

然后，向样品中加入 57 μL 成核转染缓冲液和 13 μL 补充缓冲液。以 200 x g 离心 7 分钟，将 10 至 6 个培养的 PBMNC 收成 5 mL 试管中的 2 次 10 至 6 个。之后，去除上清液，将质粒和核转染缓冲液混合物添加到细胞沉淀中。

然后用手指轻弹试管充分混合。接下来，将细胞悬液中的 DNA 转移到试剂盒提供的比色皿中，并盖上比色皿。在成核转染设备上选择程序 U-008。

随后，将比色皿插入支架并按 OK。然后，从支架中取出比色皿。向每个比色皿中加入 0.5-1 mL 预热的红细胞培养基，并立即将细胞转移至预平衡的 MEF 板中。对于某些样品，您可能会从一密耳血液中获得数千个菌落。

如果您想挑选单个菌落进行进一步培养，您可能需要额外接种一个只有 100 万个细胞的孔。在将缺氧室放入培养箱之前，轻轻摇动腔室数次，以使细胞在培养孔中均匀分布。然后将板转移到缺氧室中。

用混合气体以每分钟 20 升的速率冲洗腔室 1 至 2 分钟。然后，密封腔室并在 37 摄氏度下培养样品。在核转染后的第二天，向每个孔中直接添加 2 mL iPSC 培养基。

在成核转染后第 4 天，去除 3 mL 培养基并加入 2 mL 新鲜 iPSC 培养基。在这个阶段，大多数活细胞已经附着在饲养层上。核转染后第 6 天后，每两天更换一次培养基，留下 500 μL 用过的培养基，加入 2 mL 补充有 0.25 毫摩尔丁酸钠的新鲜 E8 培养基，直至第 14-18 天。

此处显示的是重编程外周血细胞的方案示意图。这张图片显示了站在碗中的 AP，这张图片显示了 PB MNCs 核转染后第 14 天的典型 ESC 样 iPSC 集落。以下是表达 TRA-1-60 或 SSEA4 的 iPSC 在第 5 代的代表性 FACS 图。

以下是表达 NANOG 和 OCT4 的 iPSC 集落的代表性共聚焦图像。这里的图像显示了地形瘤的 H&E 染色，包括所有三个胚层。看完这个视频，您应该对如何从人外周血单核细胞生成整合自由的 iPS 细胞有一个很好的了解。

一旦掌握，就可以在三周内生成大量的 iPS 细胞，因此手动作时间将少于三个小时。我们开发了一种简单的游离型载体系统，用于高效的血细胞重编程。我们相信这种经济实惠的系统很容易采用，尤其是在资源有限的小型实验室中。

不要忘记，处理人体血液和血浆可能很危险，必须采取预防措施，例如在执行此程序时戴上手套和实验服。