Name: 在脑核糖凝视与原子力显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习利用原子力显微镜对哺乳动物脑多核糖体进行高分辨率成像的无标记方法。该技术无需固定或标记即可在近生理条件下观察核糖体组织，为研究翻译调控和基因表达提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由意大利特伦托自治省资助的AXonomIX研究项目支持。

获取小鼠组织的操作方法已获得意大利特伦托大学动物保护机构（OPBA）批准，批准编号为04-2015，依据2014年第26号立法法令第31条。所有小鼠均饲养于意大利特伦托大学综合生物学中心（CIBIO）的模式生物设施内。
注意：为避免样本 RNA 降解，配制所有缓冲液时应使用经 DEPC 处理的水，以最大限度减少 RNase 污染。
1. 从全脑制备多聚核糖体
<ol>
	<li>采集脑组织（15 分钟）
	<ol>
		<li>以 CO₂ 处死野生型 C57BL/6 小鼠品系2 窒息5分钟36小心地将脑组织从颅骨中解剖出来36将组织放入1.5 ml离心管中，立即置于液氮中，随后于-80 °C保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裂解液的制备（30 分钟）
	<ol>
		<li>在液氮中使用研钵和研杵研磨整个脑组织。</li>
		<li>将约25 mg粉末转移至预冷的微量离心管中，并立即（避免粉碎组织解冻）加入0.8 ml裂解缓冲液（见 表1）并通过快速吹打25次使细胞破裂。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 1 分钟，使细胞碎片沉淀。</li>
		<li>将上清液转移至新的微量离心管中，冰上放置15分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 5 分钟，使细胞核和线粒体沉淀。</li>
		<li>将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
		<li>将上清液于 –80 °C 保存，最多可保存 6 个月，或立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蔗糖梯度制备与离心（2小时30分钟）
	<ol>
		<li>用无RNase水（焦碳酸二乙酯处理水（DEPC水）或商用无RNase水）和3% H2O2/DEPC H2O溶液。</li>
		<li>将试管置于冰上，并在每根试管底部加入5.5 ml冰冷的50%蔗糖溶液（参见 表1 对于蔗糖溶液，需将15%蔗糖溶液逐滴缓慢加入，滴加时应靠近界面处，以保持清晰的界面，直至试管完全充满。当试管完全充满后，用橡胶塞封闭管口，以避免气泡形成。</li>
		<li>在低温室内，轻轻将离心管水平放置，并保持该状态2小时。此后，缓慢将离心管恢复至垂直位置，并置于冰上。此时梯度已准备就绪，可直接使用。或者，可使用常规梯度制备器制备15–50%蔗糖梯度。</li>
		<li>在低温房间中，小心地从梯度顶部移除1.0 ml液体，并将细胞质裂解液逐滴加至蔗糖上即， 步骤1.2中获得的上清液</li>
		<li>小心将离心管放入摆桶转子的吊桶中。使用超速离心机在4 °C、180,000 x g条件下离心100分钟。   </li>
		<li>离心后，将离心管保留在离心桶中，在 4 °C 下静置 20 分钟，以使梯度稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蔗糖梯度分离（2 小时）
	<ol>
		<li>小心地从超速离心转子中取出一根超速离心管，并将其安装在密度梯度分级系统收集装置的收集位置上。使用紫外/可见光检测器在260 nm波长下监测吸光度，收集1 ml的组分（参见 图1 上图将收集的组分置于冰上保存。</li>
		<li>准备30–40 μl的目标组分分装样品，分装后置于冰上，随后储存于-80 °C备用。避免使用经过两次以上冻融循环的分装样品或蔗糖组分（参见 图1 下图).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 原子力显微镜样品制备（3 小时）
<ol>
	<li>使用胶带剥离云母片。</li>
	<li>用DEPC水清洗云母片3-4次，并将其放入一个小培养皿中。然后用空气干燥表面。</li>
	<li>在云母表面覆盖200 μl的1 mM NiSO4，室温孵育3分钟。</li>
	<li>移除镍溶液，然后用空气干燥表面。将含有云母的培养皿置于冰上，后续所有步骤均在4 °C下进行。</li>
	<li>将1.4.2步骤中获得的样品分装在冰上解冻，并轻轻将全部样品逐滴加到云母表面。使用100-200 μl的枪头，将样品均匀铺展在整个云母表面。将样品在冰上孵育3分钟。</li>
	<li>逐滴加入200 μl冷的AFM缓冲液（见表1）覆盖云母片，并在冰上孵育1小时。</li>
	<li>液体中成像
	<ol>
		<li>小心移除AFM缓冲液，用200 μl冷的AFM缓冲液清洗云母片3-4次，以去除多余的蔗糖。然后用冷的洗涤液（见表1）清洗云母片3次，使云母表面保留少量微升量的溶液。</li>
		<li>转至第3步（图像采集）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>空气中成像
	<ol>
		<li>小心移除AFM缓冲液，用200 μl冷的AFM缓冲液清洗云母片3-4次，以去除多余的蔗糖。然后用冷的洗涤液（见表1）清洗云母片3次，并用滤纸吸去多余水分。</li>
		<li>将培养皿盖部分打开，置于通风橱内让样品自然干燥。2小时后关闭培养皿，室温保存。样品可在2-3小时后进行测量，且可长期稳定保存数年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像采集（热稳定后每张图像15分钟）
注意：固定在云母表面的多聚核糖体可在空气或液体中使用交流模式进行成像。
<ol>
	<li>使用双面胶带将云母片固定在样品台上。</li>
	<li>按照制造商的说明将样品台插入原子力显微镜（AFM）载物台。若在液体中成像，应尽可能将样品温度维持在低于25 °C，以提高多核糖体随时间的稳定性。</li>
	<li>选择适用于交流（AC）成像的悬臂梁，并按照制造商的说明将其安装到探针 holder 上。此处，在空气中成像时使用力常数为2–20 N/m的悬臂梁，液体中成像时使用力常数约为0.1 N/m的悬臂梁。</li>
	<li>调节激光光斑在悬臂梁上的位置，并将四象限探测器信号归零。</li>
	<li>选择合适的驱动频率，并以10–20 nm的振幅驱动悬臂梁。</li>
	<li>使探针接近样品，直至探针与样品表面接触。</li>
	<li>选择2×2 μm的扫描区域，采集至少512×512像素的图像（像素宽度 &#60; 4 nm），选择实时背景扣除模式和20–25 nm的Z尺度。</li>
	<li>检查图像，寻找在空气中成像时高度为10–15 nm、在液体中成像时高度为25–30 nm、宽度在25–30 nm范围内的圆形物体。调整设定点和反馈参数，直至观察到清晰的物体。在质量良好的样品中，背景应相对平坦，偶见一些高度为2–4 nm的物体（见图2A和B）。</li>
	<li>如果图像质量良好（如步骤3.8所述），则在不同样品区域采集多幅（至少十幅）2×2微米的扫描图像。</li>
	<li>（可选）如有必要，对选定的多核糖体进行高分辨率成像（见图2C）。</li>
	<li>应用软件校正（平面扣除和逐行校正算法）对AFM图像进行处理，以消除任意倾斜和漂移效应。</li>
</ol>
4. 数据分析（每张图像30分钟）
<ol>
	<li>在 ImageJ 中导出图像（可选：应用比例因子），优先使用无损压缩格式， 例如， TIFF 格式（参见 图3A).</li>
	<li>使用 ImageJ 宏工具集 RiboPick.ijm（需复制到 ImageJ 的 macro/toolset 子目录中）对多聚核糖体中的核糖体进行计数（参见 图3B）并计算样本的统计学特性（参见 图3C).
	<ol>
		<li>开始使用以下方法加载图像 &#60;读取图像&#62; 启动程序的工具。</li>
		<li>使用标准 ImageJ 拾取核糖体中心 &#60;点选择&#62; 工具（按住 Shift 键并单击鼠标左键可多选核糖体）。标记所选的核糖体 &#60;标记核糖体&#62; 工具。核糖体坐标将显示在自定义文本窗口中。</li>
		<li>重复步骤4.2.2中所述操作，向同一多聚核糖体添加更多核糖体。</li>
		<li>使用以下方法去除标记错误的核糖体 &#60;撤销上一次选择&#62; 工具（仅针对当前多聚核糖体，从最后添加的核糖体开始依次向前移除）。</li>
		<li>当多聚核糖体完成时，使用 &#60;新多聚核糖体&#62; 工具。随着多聚核糖体数量作为叠加图像添加到图片上，文本窗口会同步更新。</li>
		<li>使用 &#60;保存结果并关闭&#62; 写入核糖体坐标文件（使用图像的默认单位）以及一张总结所挑选的核糖体和多聚核糖体的 PNG 图像。原始图像在未保存的情况下被关闭。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buttgereit, F., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+ATP-consuming+processes+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells.</a> Biochem J. 312, 163-167 (1995).</li>
<li>Russell, J. B., Cook, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+bacterial+growth%3A+balance+of+anabolic+and+catabolic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+signatures+and+mRNA+concentration+can+explain+two-thirds+of+protein+abundance+variation+in+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line.</a> Mol Syst Biol. 6, 400(2010).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13, 220(2012).</li>
<li>Kondrashov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+specificity+in+Hox+mRNA+translation+and+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning.</a> Cell. 145 (3), 383-397 (2011).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Pircher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA-derived+noncoding+RNA+targets+and+regulates+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome.</a> Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).</li>
<li>Simms, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+role+for+the+ribosome+in+determining+the+fate+of+oxidized+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA.</a> Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).</li>
<li>van Heesch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+localization+of+long+noncoding+RNAs+to+the+cytosol+and+mono-+and+polyribosomal+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes.</a> Genome Biol. 15 (1), R6(2014).</li>
<li>Preissler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not4-dependent+translational+repression+is+important+for+cellular+protein+homeostasis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast.</a> EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).</li>
<li>Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+particulate+component+of+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">A small particulate component of the cytoplasm.</a> J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).</li>
<li>McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+nascent+protein+by+ribosomes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).</li>
<li>Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+aggregate+engaged+in+protein+synthesis%3A+characterization+of+the+ergosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome.</a> Nature. 2 (197), 430-435 (1963).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+organization+of+vertebrate+centromeric+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).</li>
<li>Allen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+measurements+of+nucleosome+cores+assembled+along+defined+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences.</a> Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289 (5481), 905-920 (2000).</li>
<li>Schluenzen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+functionally+activated+small+ribosomal+subunit+at+3.3+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution.</a> Cell. 102 (5), 615-623 (2000).</li>
<li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li>
<li>Anger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+human+and+Drosophila+80S+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the human and Drosophila 80S ribosome.</a> Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).</li>
<li>Brandt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+3D+organization+of+bacterial+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The native 3D organization of bacterial polysomes.</a> Cell. 136, 261-271 (2009).</li>
<li>Myasnikov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+structure+of+the+left-handed+supra-molecular+helix+of+eukaryotic+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes.</a> Nat. Commun. 5, 5294(2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+circular+polyribosomes+on+eukaryotic+mRNA+without+cap-structure+and+poly%28A%29-tail%3A+a+cryo+electron+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+transitions+of+eukaryotic+polyribosomes+during+multi-round+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation.</a> Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).</li>
<li>Viero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+ribosome+assemblies+modulated+by+translation+are+the+building+blocks+of+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes.</a> J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).</li>
<li>Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+polyribosomes+in+intact+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells.</a> Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).</li>
<li>Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+ribosomes+and+initiation+complexes+from+rat+liver+as+revealed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy.</a> Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).</li>
<li>Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+and+atomic+force+microscopic+observation+of+polysomes+on+carbon-coated+grids+prepared+by+surface+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).</li>
<li>Mikamo, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+polysomes+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+liquid+solution+observed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy.</a> J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).</li>
<li>Mikamo-Satoh, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+gene-dependent+translational+progress+in+cellfree+protein+synthesis+by+real-space+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging.</a> Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).</li>
<li>Bernabò, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+translational+control+in+non-model+stressed+organisms+by+polysomal+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling.</a> J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboAbacus%3A+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853(2015).</li>
<li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li>
<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

作者在本文中无任何竞争性经济利益，也无可披露的内容。

由于DNA结构被证实对描述转录过程至关重要，而染色质的组织形式推动了我们对基因表达转录调控的理解，因此分析多聚核糖体的结构与组织形式对于深入理解翻译过程及其调控机制具有重要意义。
通过所述方案，可在平面上获得密度适宜且温和固定的多聚核糖体，适用于原子力显微镜（AFM）成像。在这些条件下使用便捷制备的样品，每小时可获取近50个多聚核糖体，可用于进一步分析与表征。此外，室温下保存超过一年的干燥样品经证实仍适用于成像。
要成功利用本方案获得多聚核糖体图像，需注意以下几个关键步骤：使用组织在解剖后立即进行速冻并保存于 -80 °C，以最大限度减少 RNA 降解；裂解缓冲液中应含有环己酰亚胺和 RNase 抑制剂，以防止核糖体从 mRNA 上解离；在样品沉积到云母片上的过程中，所有孵育步骤均需在冰上进行；在准备用于空气中原子力显微镜（AFM）成像的样品时，需在环己酰亚胺存在下，用缓冲液和无 RNase 的水对云母片上的样品进行充分洗涤。最后一点尤为重要。如果图像中出现高度大致正确但宽度在 100–1,000 nm 之间的平滑表面，则明确...

蛋白质的合成是细胞中最消耗能量的过程1,2。因此，蛋白质丰度主要在翻译水平而非转录水平上受到调控，这一点并不令人意外3,4,5。多聚核糖体是将mRNA信息转化为功能性蛋白质产物的基本大分子组分。迄今为止，多聚核糖体被公认为多个翻译调控机制汇聚的大分子复合物6-13。尽管已有数百项关于核糖体结构的研究14-16，但对翻译动态过程及多聚核糖体拓扑结构的分子层面深入理解仍受到有限关注。因此，天然多聚核糖核蛋白复合物的组织方式及其对翻译的潜在影响仍是较为模糊的问题。多聚核糖体可能隐藏着尚未被发现的有序且具有功能性的组织模式，这种模式或许可类比于核小体和表观遗传调控在转录领域所发挥的作用。事实上，验证这一引人入胜的假说需要进一步的研究和新的技术手段。在这方面，结构生物学技术与原子力显微镜有望协同合作，揭示基因表达调控的新机制，正如先前在核小体研究中所取得的成果一样17,18。
自从核糖体被发现以来14-16，其结构在原核生物中已被广泛表征19,20，酵母21 以及最近在人类中的研究22，提供了蛋白质合成基础机制的分子描述。多聚核糖体最初被发现位于内质网膜上，形成典型的二维几何结构14如前所述，多核糖体组装并未像核糖体结构那样持续受到广泛关注。过去，多核糖体主要通过透射电子显微镜（EM）技术进行研究。直到最近，冷冻电镜（cryo-EM）技术才实现了对纯化多核糖体的三维重构 体外 翻译系统23-26，人细胞裂解液27 或在细胞中28这些技术为多聚核糖体中核糖体-核糖体的排列结构提供了更为精细的信息23, 26-28 以及对小麦胚芽多聚核糖体中相邻核糖体接触表面的初步分子描述24因此，冷冻电镜断层成像技术能够以分子分辨率揭示核糖体-核糖体相互作用，但其后续处理与重构分析极为复杂，需要大量计算资源进行数据处理。此外，要获得核糖体-核糖体相互作用的分子细节，必须依赖高分辨率的核糖体参考图谱，而此类高分辨率参考核糖体目前仅在少数物种中获得。重要的是，冷冻电镜断层成像技术无法检测游离RNA。因此，需要开发新的技术手段以全面理解翻译机器的组织结构。
除了冷冻电镜（cryo-EM）外，原子力显微镜（AFM）也被用作直接成像低等真核生物29-33和人类27中多聚核糖体的有力工具。与电镜相比，AFM无需对样品进行固定或标记。此外，AFM可在接近生理条件下进行检测，并能够明确识别核糖体和裸露的RNA链27。单个多聚核糖体的成像可相对快速完成，以纳米级分辨率获取数千幅图像，且后期处理工作量远小于冷冻电镜所需的复杂而繁重的后期处理与重构分析。因此，AFM的数据处理与分析无需昂贵的工作站和高计算能力。该技术可高通量地获取多聚核糖体的形态、形态学特征（如高度、长度和宽度）、核糖体密度、游离RNA的存在情况以及每个多聚核糖体上的核糖体数量等信息27。因此，AFM是一种强大且与电镜技术互补的方法，可用于描绘多聚核糖体的结构27。
本文介绍了一个从纯化到数据分析的完整流程，其中应用原子力显微镜（AFM）对小鼠脑组织中的多聚核糖体进行成像与分析。该方案重点阐述了多聚核糖体的纯化步骤以及将其精确沉积在用于AFM成像的云母基底上的方法。除了可使用AFM领域常用软件轻松实现的传统颗粒分析外，本文还介绍了一种名为RiboPick的ImageJ34插件，用于统计每个多聚核糖体中的核糖体数量27, 35。

<table><tbody><tr><td>环己酰亚胺</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>裂解液制备</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>裂解液制备</td></tr><tr><td>RiboLock RNase抑制剂</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>裂解液制备</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>裂解液制备</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>裂解液制备</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>裂解液制备</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>裂解液制备</td></tr><tr><td>微量离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>裂解液制备</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>蔗糖梯度制备</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>蔗糖梯度离心</td></tr><tr><td>超速离心机转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>蔗糖梯度离心</td></tr><tr><td>聚丙烯离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>蔗糖梯度离心</td></tr><tr><td>密度梯度分馏系统&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>蔗糖梯度分馏</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>多聚核糖体可视化</td></tr></tbody></table>

利用原子力显微镜观察脑组织多聚核糖体

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

翻译机器 即， 多聚核糖体（polysome）或称多核糖体，是细胞中体积最大、结构最复杂的细胞质分子机器之一。多聚核糖体由核糖体、mRNA、多种蛋白质及非编码RNA共同组成，是实现翻译调控的整合性平台。然而，尽管核糖体已被广泛研究，多聚核糖体的整体组织结构仍缺乏系统性的深入理解。因此，亟需开展大量工作以阐明多聚核糖体的组织模式及其可能蕴含的新型翻译调控机制。原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）是一种扫描探针显微技术，可实现纳米级分辨率的三维成像。与电子显微镜（electron microscopy, EM）技术相比，AFM的主要优势之一在于其可在空气和溶液环境中获取数千幅图像，使样品无需染色和固定处理，即可维持在接近生理状态的条件下进行观察。本文介绍了一种从小鼠脑组织中精确纯化多聚核糖体并将其沉积于云母基底的详细实验方案。该方案支持在空气和液体环境中利用AFM对多聚核糖体进行成像，并实现其三维结构重建。作为冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术的有力补充，该方法可便捷地用于多聚核糖体的系统性分析及其组织结构的研究。

多聚核糖体，翻译调控，原子力显微镜，核糖体，mRNA，三维成像，小鼠脑，云母基底，冷冻电镜

小鼠全脑蔗糖梯度多聚核糖体分析
可以通过多核糖体分析法从细胞裂解液中纯化多核糖体，该方法根据大分子的重量和大小进行分离。通过多核糖体分析，将来自培养细胞或组织（如本示例）的胞质裂解液上样至线性蔗糖梯度中，并通过超速离心处理，根据沉降系数将游离RNA与40S和60S亚基、80S核糖体以及多核糖体分离开来（图1 上图）。通过检测样品在254 nm处的吸光度并收集各组分，可分离出富含核糖体或含有不同数量核糖体的多核糖体的蔗糖组分。收集的组分可用于原子力显微镜（AFM）成像，并分装后于-80 °C保存（图1 下图）。
通过原子力显微镜在空气中观察小鼠脑组织中的天然多核糖体揭示了核糖体之间的紧密相互作用</p...

尽管核糖体结构已被广泛表征，多聚核糖体的结构组织仍研究较少。为弥补这一知识空白，本文提供了一种详细的制备方案，用于在空气和液体环境中通过原子力显微镜（AFM）对哺乳动物多聚核糖体进行精确成像。

翻译机器，即多聚核糖体或多核糖体，是细胞中最大且最复杂的细胞质结构之一。多聚核糖体，……

本实验方案的总体目标是提供一个详细的流程，用于在云母表面精确纯化并沉积脑组织多聚核糖体，并在无需大量后期处理或三维重构分析的情况下，获得数千张纳米级分辨率的图像。该方法有助于回答翻译及翻译调控领域中的一些关键问题，例如理解基因表达重编程过程中多聚核糖体内部核糖体排列方式的影响。该技术的主要优势在于无需对样品进行固定或标记，且可在接近生理条件下进行检测，从而能够轻松识别核糖体及裸露的RNA链。尽管该方法可为哺乳动物多核糖体的结构提供见解，但也可应用于其他微生物，如酵母、细菌和昆虫，以及涉及基因表达翻译调控的状态。该方法的可视化演示至关重要，因为多核糖体样品在云母吸附及洗涤步骤中的操作较为复杂，需要熟练的操作技巧和经验。本实验操作将由 Paola Bernabo 和 Lorenzo Lunelli 进行演示。首先，按照随附的文字实验方案收集并冷冻脑组织。然后，将冻存的脑组织从冰箱中取出，置于实验台。将冻存的脑组织和液氮放入预冷的研钵中，用研杵研磨，直至形成粉末状。 取约25毫克脑组织粉末转移至预冷的微量离心管中，并立即加入0.8毫升裂解缓冲液。用移液器快速吹打混合液25次，以充分裂解细胞。随后，在4°C条件下以12,000 × g离心1分钟，使细胞碎片沉淀。将上清液转移至新的微量离心管中，冰上放置15分钟。随后离心5分钟，以沉淀细胞核和线粒体。接下来，小心吸取先前制备好的蔗糖梯度液顶部1毫升液体。将细胞溶质裂解物的上清液逐滴覆盖在蔗糖溶液上。样品加载至梯度液顶部后，小心将离心管及配平管放入水平转子的吊桶中。对梯度液进行 100 分钟离心。超速离心后，将离心管保留在离心桶中，在4摄氏度下静置20分钟，使梯度稳定。然后小心取出样品管，安装至密度梯度分级系统收集装置上。在使用紫外可见光检测器于260纳米处监测核酸吸光度的同时，收集每份1毫升的组分，并将其置于冰上。接下来，将感兴趣的组分制备成30-40微升的等份样品，并置于冰上保存。如果样品不能立即使用，请将其储存在-80摄氏度条件下，并尽量减少冻融循环次数。为AFM成像准备样品时，首先在经清洗的云母片表面覆盖200微升1毫摩尔的硫酸镍(II)，然后在室温下孵育3分钟。然后移除溶液，用压缩空气吹干表面，并将培养皿置于冰上。接着，将目标组分中的全部等分试样逐滴轻柔地加到云母表面。使用100或200微升枪头，将样品均匀铺展至云母的整个表面，并在冰上孵育3分钟。然后，逐滴加入 200 微升预冷的 AFM 缓冲液覆盖云母片，并将样品置于冰上孵育 1 小时。保持样品温度为 40 摄氏度，并使用在无 RNase 水中配制的预冷缓冲液，这对于维持多核糖体的结构完整性至关重要。孵育结束后，小心移除缓冲液，并用 200 微升预冷的 AFM 缓冲液对云母片洗涤 3 至 4 次，以去除多余的蔗糖。然后，用冷洗涤液将云母片清洗三次，并用纸巾吸去云母片上的多余水分。由于多聚核糖体中的核糖体和游离RNA已被切断，此时彻底去除吸附样品中的蔗糖至关重要。将培养皿盖部分打开，置于通风橱中让样品自然干燥。两小时后，关闭培养皿。样品现可在室温下保存。使用双面胶带将制备好的样品固定在原子力显微镜（AFM）的样品台上。然后，根据制造商的说明将样品台插入原子力显微镜（AFM）载物台。完成校准后，使样品接近探针悬臂，直至探针尖端与样品表面接触。选择扫描区域为2微米×2微米，分辨率至少为512×512像素，启用实时背景扣除模式，并选择Z轴范围为20–25纳米。然后，开始图像采集。在空气中采集图像时，检查图像中是否存在高度在10至15纳米之间的圆形物体。接着，调整设定点和反馈参数，直至观察到清晰的物体。背景在质量良好的样品中应呈现相对平坦，伴有若干高度为二至四纳米的物体。当图像质量良好时，在样品的不同区域采集多幅二乘二微米的扫描图像。在云母表面沉积蔗糖等分试样后，原子力显微镜可提供单个多聚核糖体的精确尺寸描述，这些多聚核糖体表现为紧密堆积的核糖体簇。使用横截面分析对其中一个核糖体峰进行更仔细的观察，结果显示核糖体峰的高度约为14纳米。这与先前在空气干燥后观察到的人类核糖体和多聚核糖体的结果一致。在右侧图像中，使用了一个宏来识别核糖体的位置，并用红色圆圈标记每个核糖体。利用这些信息，可以分析每个多聚核糖体上核糖体数量的频率分布。该实验分布通过高斯曲线进行拟合，中心值为每个多聚核糖体5.8个核糖体，标准差为1.3。一旦掌握，从脑组织粉碎到多聚核糖体图像采集的整个技术流程，若操作得当，可在八小时之内完成。进行该实验操作时，需始终注意将样品置于冰上，并使用预冷的缓冲液将样品沉积到云母片上。按照本方法操作，并利用开发者提供的 ImageJ 插件在论文中进行分析，可精确计数每个多聚核糖体中的核糖体数目。通过不断优化该技术，将有助于深入理解多聚核糖体形成的动力学过程，并揭示其在不同细胞或组织状态下多聚核糖体结构与组织形式的变化。观看本视频后，您应能充分了解如何获取数千张多聚核糖体图像，以系统性分析和研究其结构组织。

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在脑核糖凝视与原子力显微镜

来源：Williams, S. M. et al. 利用新型基于原子力显微镜的生物淘选技术分离肌萎缩侧索硬化症中TDP-43变体的形态特异性试剂。J. Vis. Exp.

原子力显微镜观察噬菌体-抗原相互作用

在本视频中，我们演示了利用静态原子力显微镜观察组装好的核小体。这种高分辨率成像技术可用于研究核小体的结构。...

利用静态原子力显微镜观察和表征组装的核小体

来源： Lunelli, L., et. al. 原子力显微镜观察脑多聚核糖体J. Vis.

使用原子力显微镜对小鼠脑组织中分离的多聚核糖体进行成像

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。...

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

本文描述了一种利用原子力显微镜（AFM）研究蛋白质光感受器结构的方法。峰值力定量纳米力学性能成像（PF-QNM）可揭示云母表面完整存在的蛋白质二聚体。...

使用峰值力定量纳米力学性能成像对红光光感受器进行原子力显微镜观察

我们描述了使用原子力显微镜测量单个蛋白质分子力学性质及其机械解折叠路径的详细步骤与策略。同时，我们展示了代表性结果，以作为筛选和判断高质量单个蛋白质分子记录的参考依据。...

使用原子力显微镜对单个蛋白质分子进行力谱分析

本文介绍了一种利用静态和时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术在单分子水平上表征核小体颗粒的实验方案。所述的表面功能化方法可实现对核小体结构及其动态行为在纳米尺度下的高分辨率捕捉。...

利用原子力显微镜成像研究核小体的结构与动力学

我们提出了一种用于免疫学研究的原子力显微镜（AFM）悬臂梁功能化方案，可在其上固定单个T细胞和微粒。本文展示了利用AFM探测单对T细胞-树突状细胞结合的步骤，以及结合荧光成像技术，利用AFM实时监测巨噬细胞对单个固体微粒的细胞反应的方法。...

原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个T细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

哺乳动物大脑的发育需要在翻译水平上对基因表达进行精确调控。本文介绍了一种多聚核糖体分析系统，该系统配备易于组装的蔗糖梯度制备与分级分离平台，可用于评估发育中大脑内mRNA的翻译状态。...

利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。...

无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

本文介绍了一种通过简单且创新的二次谐波产生显微成像方法，在微管蛋白病模型中检测微管负载的少突胶质细胞的实验方案。...

无标记非线性光学技术用于研究中枢髓鞘中微管蛋白依赖性缺陷

学习利用原子力显微镜对哺乳动物脑多核糖体进行高分辨率成像的无标记方法。该技术无需固定或标记即可在近生理条件下观察核糖体组织，为研究翻译调控和基因表达提供重要工具。

利用原子力显微镜观察脑组织多聚核糖体

探索更多视频