在脑核糖凝视与原子力显微镜
2016年3月16日
虽然核糖体结构已经被广泛表征，但多核糖体的组织仍然研究不足。为了克服这种知识的缺乏，我们在这里提出了一种详细的制备方案，用于通过原子力显微镜 （AFM） 在空气和液体中对哺乳动物多核糖体进行准确成像。
该协议的总体目标是为云母上脑多核糖体的准确纯化和沉积提供详细的管道，并在不需要繁重的后处理或 3D 重建分析的情况下获得纳米级分辨率的数千张图像。这种方法可以帮助回答翻译和翻译控制领域的关键问题，例如了解基因表达重新布线过程中多核糖体组织对多核糖体组织的影响。该技术的主要优点是不需要样品固定或标记，并且可以在接近生理的条件下进行测量，以轻松识别核糖体和裸露的 RNA 支架。
虽然这种方法可以深入了解哺乳动物多核糖体的组织，但它也可以应用于其他微生物，如酵母、细菌和昆虫，以及涉及基因表达翻译控制的状态。这种方法的视觉演示至关重要，因为处理多核体样品以吸收云母和洗涤步骤非常棘手，需要处理技巧和经验。演示该程序的是 Paola Bernabo 和 Lorenzo Lunelli。
首先，按照随附的文本协议中的说明收集并冷冻脑组织。然后，从冰箱中取出冷冻组织并将其带到工作台上。将冷冻的脑组织和液氮放入预冷的研钵中，用杵将其粉碎，直至形成粉末。
将约 25 毫克脑粉转移到冷微量离心管中，并立即加入 0.8 毫升裂解缓冲液。快速上下移液混合物 25 次以破坏细胞。接下来，在 4 摄氏度下以 12， 000 x g 的速度离心试管 1 分钟，以沉淀细胞碎片。
将上清液转移到新的微量离心管中，并将管子在冰上放置 15 分钟。然后，将试管离心 5 分钟，使细胞核和线粒体沉淀。接下来，小心地从先前制备的蔗糖梯度顶部去除 1 毫升。
将蔗糖逐滴覆盖在胞质裂解物的上清液上。将样品加载到梯度顶部，小心地将试管和平衡管放入摆动吊篮转子的桶中。将梯度离心 100 分钟。
超速离心后，将试管在桶中以 4 °C 放置 20 分钟，以稳定梯度。然后，小心地取出样品管并将其安装在密度梯度分馏系统的收集器装置上。收集 1 毫升馏分，同时用紫外可见光检测器监测 260 纳米处核酸的吸光度，并将它们放在冰上。
接下来，准备 30-40 微升目标组分的等分试样，并将它们放在冰上。如果样品不会立即使用，请将其储存在 80 摄氏度，并采取措施限制冻融循环的次数。要制备用于 AFM 成像的样品，首先用 200 微升 1 毫摩尔 ii 硫酸镍覆盖洗涤过的云母片，并在室温下孵育片材 3 分钟。
然后去除溶液，用压缩空气干燥表面，并将培养皿放在冰上。接下来，将感兴趣的馏分中的整个等分试样逐滴加入云母上。使用 100 或 200 微升的尖端，将样品铺在云母的整个表面，然后将样品在冰上孵育 3 分钟。
然后，用 200 微升冷缓冲 AFM 逐滴覆盖云母片，并将样品在冰上孵育 1 小时。将样品保持在 40 度并使用在不含 RNase 的水中制备的冷缓冲液对于保持多核糖体组织非常重要。孵育后，小心地去除缓冲液，并用 200 μL 冷缓冲液 AFM 洗涤云母 3 到 4 次，以去除多余的蔗糖。
然后，用冷洗涤液清洗云母 3 次，并用纸沥干云母中多余的水。从吸收剂样品中完全去除蔗糖至关重要，因为您已经切断了多核糖体中的核糖体和裸露的 RNA。将样品放在化学罩下晾干，培养皿顶部部分打开。
两小时后，关闭培养皿。样品现在可以在室温下储存。使用双面胶带将准备好的样品贴在 AFM 的样品架上。
然后，按照制造商的说明将样品架插入 AFM 载物台。校准后，接近样品，直到悬臂尖端与表面啮合。选择 2 x 2 微米的扫描区域，分辨率至少为 512 x 512 像素，选择实时背景减法模式，并选择 20-25 纳米的 Z 比例。
然后，开始图像采集。在空气中采集图像时，检查图像，寻找高度在 10 到 15 纳米之间的圆形物体是否存在。接下来，调整设定点和反馈参数，直到看到尖锐的物体。
在具有大约 2 到 4 纳米高的物体的良好样品中，背景应显得相对平坦。一旦图像看起来不错，就可以在不同样品区域采集几个 2 x 2 微米的扫描。在蔗糖等分试样沉积在云母上后，AFM 提供了单个多核糖体的准确尺寸描述，这些多核糖体表现为紧密堆积的核糖体簇。
使用横截面分析仔细观察其中一个核糖体峰，发现核糖体峰的高度约为 14 纳米。这与之前在风干后观察到的人核糖体和多核糖体的情况相匹配。在右图中，宏用于识别核糖体位置并用红色圆圈标记每个核糖体。
使用此信息，可以分析每个多核糖体的核糖体数量的频率分布。该实验分布拟合了一条高斯曲线，该曲线以每个多核糖体 5.8 个核糖体为中心，标准差为 1.3。一旦掌握，如果作得当，这种从脑粉碎到多核糖体图像采集的技术可以在不到 8 小时内完成。
在尝试此过程时，请务必记住将样品保存在冰上，并使用冷缓冲液将样品沉积在云母上。按照此程序，并使用开发人员的 ImageJ 插件在您的论文中提供，您可以精确计算每个多核糖体的核糖体数量。每次开发后，该技术将为了解多核糖体形成的动力学和识别多核糖体组织的变化及其不同的细胞或组织条件铺平道路。
看完这个视频后，你应该对如何获得成千上万的多核糖体图像有一个很好的了解，以便系统地分析和研究它们的组织。
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概述
本文介绍了一种使用原子力显微镜（AFM）对哺乳动物多核糖体进行成像的详细协议。该方法允许进行高分辨率成像，而无需样品固定或标记。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- 尽管核糖体结构已有广泛的表征，但多核糖体的组织尚未被充分探索。
- 了解核糖体的组织对于洞察基因表达调控至关重要。
- 该方法可应用于各种生物，包括酵母和细菌。
- 由于处理多核糖体样品的复杂性，视觉演示是必不可少的。
研究目的
- 提供一个可靠的大脑多核糖体纯化和成像协议。
- 促进翻译控制和基因表达的研究。
- 在接近生理条件下实现成像。
使用的方法
- 原子力显微镜（AFM）用于成像。
- 在云母上纯化大脑多核糖体。
- 无需重度后处理或3D重建即可进行成像。
- 样品吸收和洗涤的处理技术。
主要结果
- 成功以纳米级分辨率成像多核糖体。
- 在样品中识别核糖体和裸露的RNA链。
- 洞察哺乳动物多核糖体的组织。
- 在不同生物体中研究翻译控制的潜在应用。
结论
- 该协议增强了对多核糖体中核糖体组织的理解。
- 它为研究基因表达的研究人员提供了一个宝贵的工具。
- 该方法适用于各种生物体，扩大了其影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding polysome organization provides mechanistic insights into translational control, a critical layer of gene expression regulation relevant to target validation in neuroscience and metabolic disease programs. The ability to image polysomes in near-physiological conditions without fixation or labeling enables reproducible, quantitative analysis of ribosome dynamics, supporting early-stage hypothesis testing and biological de-risking. This approach offers a complementary, label-free method to assess translational states in disease-relevant systems, aiding in the prioritization of targets with strong mechanistic rationale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of ribosome organization to interrogate translational hypotheses and clarify pathway-level effects of genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Provides a reproducible, label-free imaging readout that reduces variability associated with fixation or staining artifacts.
- Predictive Value: Supports assessment of translational state changes as a functional biomarker for target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative polysome imaging data suitable for high-content analysis of ribosome number and distribution.
- Reproducibility: Allows thousands of nanoscale-resolution images to be acquired under consistent conditions, enabling statistical robustness.
- Scalability: Compatible with fractionation workflows that can be adapted to multi-sample screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to brain tissue, enabling direct study of polysome organization in neurodegenerative and neuropsychiatric disease models.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to ex vivo brain systems, supporting mechanistic de-risking before in vivo validation.
- Cross-Species Utility: Can be extended to yeast, bacteria, and insects, allowing conservation studies and target validation across model organisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis validation through mechanistic de-risking, providing biophysical data on translational machinery organization that complements genomic and proteomic approaches.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in polysome structure to translational control during gene expression rewiring.
- Analytics: Enables extraction of quantitative metrics such as ribosome count per polysome and spatial distribution, facilitating comparative analysis across conditions.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability for studying translational dynamics in diverse disease-relevant systems without reagent-dependent labeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in translational control by providing direct nanoscale observation of polysome architecture.
- Operational Value: Eliminates need for fixation, labeling, or heavy post-processing, streamlining workflow and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by offering early, structure-function insights into target-mediated translational effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated translational mechanism in disease-relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polysome purification, density gradient fractionation, and AFM operation.
- Depends on access to ultracentrifugation, AFM instrumentation, and RNase-free buffer preparation.
- Necessitates standardized sample handling to ensure consistent deposition on mica and preservation of native polysome structure.
- Must account for tissue-specific variability in polysome yield and stability, particularly in post-mortem or frozen brain samples.
- Limited by the need for specialized training in sample preparation and AFM imaging techniques, as noted in the procedural demonstration requirement.
