在免疫细胞在不同组织与疾病相关的分布和小鼠实验评价性自身免疫性脑脊髓炎的诱导
2016年5月8日
本手稿描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 模型的诱导和评分方法，以及使用流式细胞术和定量 PCR 分别评估淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和 mRNA 细胞因子水平，在不同的疾病阶段。
实验性自身免疫性脑脊髓炎或 EAE 模型的总体目标是促进对多发性硬化症发展的潜在分子机制的研究。这种方法可以帮助回答多发性硬化症领域的关键问题，例如，免疫细胞在疾病的哪个阶段浸润中枢神经系统？该技术的主要优点是 EAE 模型模拟了多发性硬化症的许多主要特征，例如脱髓鞘和免疫细胞浸润。
该技术的意义延伸到多发性硬化症的治疗，因为用这种方法测试的药物已经被批准用于这种疾病。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在诱导 EAE 时必须考虑全面的条件。小鼠必须饲养在无压力的环境中，并且应新鲜制备百日咳毒素。
这种方法的官方演示至关重要，因为仅通过描述很难了解淋巴结的分离和脊髓的提取。首先皮下注射 10 至 13 周龄雌性小鼠 200 μg 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白。在 200 μL 完全弗氏佐剂中乳化，含有 400 μg 结核分枝杆菌。
立即和 24 小时后，腹膜内注射小鼠 0.2 μg 百日咳毒素，溶于 200 μL PBS 中。在 EAE 诱导之前，小鼠必须适应处理和实验环境，以诱导应激，从而防止临床症状的发展。注射后一周，每天检查小鼠的临床症状，如表所示。
为了评估 EAE 诱导的淋巴结免疫细胞群，在诱导后的适当时间点，用 80% 异丙醇润湿切口区域，并小心去除髋部区域的皮肤。使用镊子小心地从脂肪组织中去除腹股沟淋巴结。然后称量节点，并将样品置于冰上的 PBS 中。
为了分析脊髓细胞，用异丙醇润湿动物的背部，然后用手术刀纵向切开脊柱。然后去除皮肤，解剖脊柱的腰部，支配后肢。用装满 PBS 的注射器冲洗脊柱以提取脊髓。
去除大约 1/3 的腰椎脊髓后，称量脊髓碎片，并将组织储存在冰上的 PBS 中。要分析脾免疫细胞群，请打开组织以进入腹部下部。接下来，切除脾脏，切掉大约 1/8 的组织。
称取脾脏碎片，并将组织储存在冰上的 PBS 中。然后使用 2 mL 注射器的柱塞通过 70 微米网筛在 50 毫升试管上浸渍其余组织，然后用 5 毫升 PBS 洗涤过滤器。离心过滤的细胞。
将沉淀重悬于 500 μL 细胞裂解缓冲液中，并将细胞转移到 1.5 mL管中。在室温下 10 分钟后，用 500 μL PBS 洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将沉淀重悬于 100 微升 0.2% BSA 的 PBS 溶液中，并向细胞中加入 2 微升 Fc 受体 1 封闭缓冲液。
在室温下避光 15 分钟后，用 13 μL 抗体混合物在室温下避光再标记细胞 15 分钟。孵育结束时，在 500 μL PBS 中洗涤细胞至少两次，并将最终沉淀重悬于 500 μL 新鲜 PBS 中。然后将细胞转移到冰上的流式细胞仪管中。
最后，为了通过流式细胞术分析样品，在流式细胞术测量之前，向细胞中加入 30 μL 流式细胞术绝对计数标准品以确定绝对细胞计数。然后在流式细胞仪上分析样品。如图所示，在 EAE 诱导的急性期观察到淋巴结内所有免疫细胞群的短暂增加。
然而，在脾脏中，只有巨噬细胞、B 细胞、T 细胞和中性粒细胞表现出浸润增加。在血液中，所有免疫细胞群在临床前阶段都表现出其外周循环的短暂增加，这与疾病急性期腰脊髓的类似疾病依赖性增加相对应，不包括单核细胞群，单核细胞群可能在进入脊髓后分化为巨噬细胞。这里显示了用于评估不同细胞群的门控策略。
细胞数量与分析的组织量或血容量有关，反映了绝对细胞计数。在淋巴结中，IL-23 mRNA 表达在临床前阶段增加，而 IL-6 的表达以疾病依赖性方式增加。在脾脏中，IL-6 和 IL-23 表达在临床前阶段增加，而 IL-1 β mRNA 表达在疾病发作之前不受影响。
在血液中，只有 TNF-α mRNA 的表达上调，并且以疾病依赖性方式。在腰脊髓中，TNF-α、IL-1 β 和干扰素 γ 在急性期被诱导，而 IL-6 仅在疾病的发作期上调。一旦掌握，如果作得当，可以在 8 小时内完成 10 只小鼠的 EAE 模型、随后的细胞分离和效果分析。
按照此程序，可以执行其他方法（如 Western Blot 或 ELISA）来确认 mRNA 表达分析的结果。该技术发展后，为多发性硬化症领域的研究人员探索中枢神经系统脱髓鞘的机制铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何诱导 EAE 模型以及如何分离免疫细胞以获得可重现的流式细胞术结果有很好的了解。
不要忘记，使用完整的弗氏佐剂可能非常危险，并且在执行此程序时应采取预防措施，例如提起小鼠皮肤并确保注射器完全穿透皮肤。
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概述
本手稿描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导和评分方法。它还涵盖了使用流式细胞术和定量PCR评估各种组织中的免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 自身免疫
背景
- EAE模型用于研究多发性硬化症。
- 它模拟了疾病的关键特征，如脱髓鞘。
- 了解免疫细胞浸润对于治疗开发至关重要。
- 适当的条件对于成功诱导EAE至关重要。
研究目的
- 研究多发性硬化症的分子机制。
- 确定免疫细胞在中枢神经系统中浸润的时间。
- 评估多发性硬化症潜在疗法的有效性。
使用的方法
- 实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的诱导。
- 流式细胞术用于免疫细胞分布评估。
- 定量PCR用于测量mRNA细胞因子水平。
- 在不同疾病阶段进行分析。
主要结果
- 淋巴结、脾脏、血液和脊髓中的免疫细胞分布特征。
- 在不同疾病阶段定量细胞因子mRNA水平。
- 对EAE进展期间免疫反应时间的洞察。
- 验证EAE模型作为多发性硬化症研究的可靠工具。
结论
- EAE模型对于研究多发性硬化症机制有效。
- 研究结果有助于理解疾病中的免疫细胞动态。
- 结果可能为多发性硬化症的治疗策略提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
The EAE model provides a mechanistic platform for interrogating autoimmune pathways in multiple sclerosis, enabling target validation through immune cell profiling and cytokine dynamics. By mapping temporal immune infiltration across tissues, the method supports preclinical de-risking of immunomodulatory candidates. This facilitates data-driven go/no-go decisions in neuroinflammatory drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of T-cell, B-cell, and monocyte trafficking to identify drivers of CNS inflammation.
- Operational Value: Standardized immune cell isolation from lymph nodes, spleen, blood, and spinal cord supports reproducible target engagement assays.
- Predictive Value: Cytokine mRNA quantification (IL-6, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IL-1β) across disease phases informs biomarker selection for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Flow cytometry protocols with absolute counting standards enable quantitative immune cell profiling for assay standardization.
- Reproducibility: Defined disease phases (preclinical, onset, acute) provide temporal windows for consistent immune monitoring across compound testing.
- Scalability: Tissue processing workflows (spleen maceration, spinal cord flushing) support batch analysis of immune populations in preclinical studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Immune cell distribution in spinal cord mirrors CNS pathology, enabling correlation of peripheral biomarkers with target engagement.
- Translational Continuity: Cytokine expression kinetics in blood and lymphoid tissues inform predictive modeling of drug effects on immune trafficking.
- Risk Mitigation: Longitudinal immune profiling reduces mechanistic ambiguity in lead optimization for neuroinflammatory indications.
Pipeline & Workflow Integration
The EAE model integrates into discovery workflows by providing immune-mediated phenotype readouts between target validation and lead optimization stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of autoimmune mechanisms via temporal immune cell tracking in secondary lymphoid organs and CNS.
- Screening: Standardized immune cell yields from spleen and lymph nodes support high-throughput flow cytometry screening of immunomodulators.
- Analytics: Absolute cell counts and mRNA cytokine levels deliver quantitative outputs for comparing treatment effects across disease phases.
- Translational Research: Blood-to-spinal cord immune cell correlation supports biomarker-driven progression from discovery to preclinical efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Standard operating procedures for EAE induction and tissue harvesting enable cross-project reuse in autoimmune disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in autoimmune target validation through longitudinal immune profiling.
- Operational Value: Standardized tissue processing and flow cytometry protocols ensure reproducible immune quantification across sites.
- Strategic Value: Early immune biomarker identification improves capital efficiency by de-risking candidates before costly CNS penetration studies.
- Portfolio Impact: Immune kinetics data enable risk-adjusted prioritization of immunomodulators based on target engagement evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, surgical tissue dissection, and flow cytometry to ensure sample integrity.
- Dependent on sterile preparation of complete Freund's adjuvant and pertussis toxin for consistent disease induction.
- Necessitates standardized timing of tissue harvest relative to clinical scoring to align immune data with disease phases.
- Requires flow cytometry infrastructure with absolute counting capabilities for accurate immune cell quantification.
- Limited by inter-animal variability in disease onset, necessitating cohort-based statistical analysis for robust conclusions.
