Name: 在免疫细胞在不同组织与疾病相关的分布和小鼠实验评价性自身免疫性脑脊髓炎的诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 了解实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导方法，用于研究多发性硬化症的分子机制。该方案结合流式细胞术和定量PCR技术，可分析小鼠淋巴结、脾脏、血液及脊髓中的免疫细胞分布与细胞因子mRNA表达水平，为神经免疫学研究提供可靠工具。

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本工作由 Else Kröner-Fresenius 基金会（EKFS）转化研究创新-制药（TRIP）研究生项目以及黑森州“科学经济卓越发展计划（LOEWE）”中的“应用导向药物研究”重点方向资助。

伦理声明：我们的实验程序已获得德国达姆施塔特区政府伦理委员会（Regierungspräsidium Darmstadt, Germany）的批准，并符合国家及欧洲的相关法规。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦并减少所用动物数量。
1. EAE 模型
<ol>
	<li>诱导EAE模型
	<ol>
		<li>使用10至13周龄的雌性129S4/SvJae×C57BL/6小鼠进行EAE模型的诱导。</li>
		<li>将致脑炎性MOG35 - 55 （髓鞘少突胶质细胞糖蛋白）肽（200 µg）用含有400 µg Mycobacterium tuberculosis 的200 µl完全弗氏佐剂（CFA）乳化后，皮下注射至小鼠背部的上部和下部。 
		注：作为阴性、非致病性的假处理对照，可使用相同体积、相同途径给予含 Mycobacterium tuberculosis 的不完全弗氏佐剂。</li>
		<li>此后，在24小时后再次给予小鼠腹腔注射百日咳毒素（每次总量0.2 µg，溶于200 µl磷酸盐缓冲液PBS中）。使用未经处理的小鼠作为对照组，以便将患病动物与健康动物进行比较。 
		注：也可使用200 - 300 µg MOG35 - 55 肽、300 - 500 µg Mycobacterium tuberculosis 混入CFA中，并以每针0.1 - 0.2 ml体积给予0.2 - 0.3 µg百日咳毒素来诱导EAE。</li>
		<li>从注射后一周开始，每日观察小鼠的临床症状（见步骤1.2.1）。 
		注：疾病发作的日期在不同实验中可能有所差异，但在本实验室条件下通常约为第11天，因此本文中第14天定义为发病后第3天。本研究中所有小鼠均出现了临床症状。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠评分
	<ol>
		<li>按以下临床评分标准对临床症状进行分类：0）无异常体征；0.5）尾部远端麻痹；1）尾部完全麻痹；1.5）尾部无力伴后肢轻度无力；2）尾部无力伴后肢重度无力；2.5）尾部无力并单侧后肢麻痹；3）尾部无力并双侧后肢麻痹；3.5）双侧后肢麻痹伴单侧前肢无力（达到此评分的小鼠将依据当地伦理指南实施安乐死）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 流式细胞术分析用单细胞的制备
注意：抗体混合物包含 1 µl CD45-Vioblue、2 µl CD8-eFluor650、0.5 µl CD11b-eFluor605、0.5 µl F4/80-PE-Cy7、1 µl CD3-PE-CF594、CD4-V500、0.5 µl CD11c-AlexaFluor700、1 µl CD19-APC-H7 和 1 µl Ly6G-APC-Cy7。&#160;
注意：如果需要采集血液、淋巴结、脾脏和脊髓，则操作步骤如下：使用异氟烷（2% 按每分钟与碳合气混合）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合麻醉小鼠，使其深度麻醉。接着打开胸腔，通过心脏穿刺采集血液，并用冷磷酸盐缓冲液（PBS）进行心脏灌注。然后依次取出淋巴结、脾脏，最后取出脊髓。如果无需进行心脏灌注，则在深度麻醉下通过颈椎脱位法处死小鼠。
<ol>
	<li>脾细胞的分离
	<ol>
		<li>使用异氟烷（2% 每分钟 carbogen 中）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合麻醉小鼠。</li>
		<li>用80%异丙醇润湿切口区域，以避免毛发污染，并用剪刀纵向切开胸腔，注意不要刺破深层组织。</li>
		<li>用冷PBS（pH 7.0）23进行心脏灌注。 
		注：脾脏位于肋骨下方的左上腹部象限。如果仅需研究脾脏，可在灌注前取出该器官，以保留所有感兴趣的细胞类型。</li>
		<li>取出脾脏，切下约1/8并称重。将样品保存在冰上的PBS中。</li>
		<li>用2 ml注射器的推杆将脾组织通过置于50 ml离心管上的70 µm细胞筛过滤。</li>
		<li>用5 ml PBS冲洗细胞筛。在1,800 × g下离心3分钟。将沉淀重悬于500 µl裂解液中。 
		注：在此阶段，如果后续使用不依赖微珠的替代FACS分析方法（见第3节），可能需要进行差异细胞计数。</li>
		<li>室温（RT）孵育10分钟，加入500 µl PBS，在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。</li>
		<li>用500 µl PBS重复洗涤步骤。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 µl 0.2%牛血清白蛋白（BSA）/PBS中，加入2 µl Fc受体-1（FcRI）封闭缓冲液，在室温（RT）避光孵育15分钟。</li>
		<li>加入13 µl抗体混合物，在室温（RT）避光孵育15分钟，加入500 µl PBS，并在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。弃去上清液。 
		注：制造商的染色程序推荐单次洗涤，但可选择性地额外重复洗涤一至两次，以进一步降低背景染色。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于500 µl PBS（或用于蛋白分离的运行缓冲液，以潜在减少细胞聚集），转移至流式细胞术检测管中。将细胞保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>淋巴结细胞的分离
	<ol>
		<li>使用异氟烷（2% 每分钟 carbogen 中）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合麻醉小鼠。</li>
		<li>用80%异丙醇润湿切口区域，用剪刀纵向切开胸腔。用冷PBS（pH 7.0）23进行心脏灌注。</li>
		<li>为分离腹股沟淋巴结，小心去除髋部区域的皮肤，用镊子从脂肪组织中仔细取出淋巴结。称量腹股沟淋巴结，并将样品保存在冰上的PBS中。 
		注：我们在研究中使用了腹股沟淋巴结，因为O`Connor 等发现，在EAE诱导后，腹股沟淋巴结中存在大量活化的单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞24。</li>
		<li>用2 ml注射器的推杆将淋巴结通过置于50 ml离心管上的70 µm细胞筛过滤。</li>
		<li>用5 ml PBS冲洗细胞筛。在2,400 × g下离心8分钟。将细胞沉淀重悬于100 µl 0.2% BSA/PBS中，加入2 µl FcRI封闭缓冲液，在室温（RT）避光孵育15分钟。</li>
		<li>加入13 µl抗体混合物，在室温（RT）避光孵育15分钟，加入500 µl PBS，并在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于300 µl PBS（或合适的运行缓冲液）中，转移至流式细胞术检测管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血液细胞的分离
	<ol>
		<li>向50 µl血液（以EDTA稳定）中加入50 µl 20 mM HEPES，再加入500 µl裂解液。室温（RT）孵育10分钟，加入500 µl PBS。在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。弃去上清液，并重复洗涤步骤。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于100 µl 0.2% BSA/PBS中，加入2 µl FcRI封闭缓冲液，在室温（RT）避光孵育15分钟。</li>
		<li>加入13 µl抗体混合物，在室温（RT）避光孵育15分钟，加入500 µl PBS，并在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于300 µl PBS中，转移至流式细胞术检测管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脊髓细胞的分离
	<ol>
		<li>使用异氟烷（2% 每分钟 carbogen 中）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合麻醉小鼠。</li>
		<li>用80%异丙醇润湿切口区域，用剪刀纵向切开胸腔。用冷PBS（pH 7.0）23进行心脏灌注。</li>
		<li>润湿背部切口区域，再次用手术刀做纵向切口并去除皮肤。</li>
		<li>切除支配后肢的腰段脊柱，并用装有PBS的注射器冲洗以提取脊髓。切下约1/3的腰段脊髓，称重后将样品保存在冰上的PBS中。</li>
		<li>在4 °C下以250 × g离心2分钟。弃去上清液，加入500 µl细胞解离液和HBSS（1:1）。加入3 mg/ml胶原酶A和1 Unit/ml DNase I，通过反复吹打使细胞解离，并在37 °C、400 rpm振荡条件下孵育30分钟。 
		注：如有需要，可通过密度梯度离心去除污染的髓鞘和细胞碎片，这可能提高流式细胞术检测的灵敏度，从而降低背景自发荧光和所需采集的事件数量（见第3.5节）。</li>
		<li>在室温（RT）下以250 × g离心2分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml 10%胎牛血清（FCS）/Dulbecco's最低必需培养基（DMEM）中，再次通过反复吹打使细胞解离。</li>
		<li>在室温（RT）下以250 × g离心2分钟。重复洗涤步骤。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 ml PBS中，用2 ml注射器的推杆将脊髓通过置于50 ml离心管上的70 µm细胞筛过滤。</li>
		<li>用4 ml PBS冲洗细胞筛。在室温（RT）下以1,800 × g离心3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 µl 0.2% BSA/PBS中，加入2 µl FcRI封闭试剂，在室温（RT）避光孵育15分钟。</li>
		<li>加入13 µl抗体混合物，在室温（RT）避光孵育15分钟，加入500 µl PBS，并在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µl PBS（或合适的运行缓冲液）中，转移至流式细胞术检测管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>事先滴定所有抗体以确定最佳浓度，具体方法参见 Olesch 的描述 等25.</li>
	<li>根据制造商说明书，使用抗体捕获补偿微珠进行单色补偿，以创建多色补偿矩阵。</li>
	<li>根据制造商的说明，每天使用特定微球进行仪器校准。</li>
	<li>在流式细胞术检测前，向细胞中加入30 µl流式细胞术绝对计数标准品（细胞分离步骤见2.1、2.2、2.3、2.4节），以确定细胞绝对数量。也可不使用计数微球，直接对细胞进行计数。</li>
	<li>将样本（脾脏、淋巴结和血液细胞：100,000 个事件，脊髓：500,000 个事件）上机进行流式细胞术检测，并使用特定的流式细胞术分析软件进行分析。
	<ol>
		<li>打开流式细胞术软件，通过点击按钮添加 fcs 3.0 文件 &#34;添加样品&#34;.</li>
		<li>双击打开添加的文件。调整x轴和y轴的通道。通过创建门控来选择目标细胞群体（参见 图4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 定量 PCR 分析
<ol>
	<li> mRNA的分离及逆转录为cDNA
	<ol>
		<li> 使用苯酚-氯仿法从腰段脊髓（1/3）、脾脏（1/8）和腹股沟淋巴结中提取mRNA，并用乙醇沉淀26。
		<ol>
			<li> 为此，将组织在1 ml硫氰酸胍-苯酚混合液中匀浆，孵育10分钟。加入200 µl氯仿，再次孵育10分钟。</li>
			<li> 经离心步骤（4 °C下18,000 × g离心15分钟）后，用500 µl异丙醇洗涤上层水相，再次离心（4 °C下18,000 × g离心8分钟）。</li>
			<li> 用500 µl乙醇洗涤沉淀，再经一次离心（4 °C下18,000 × g离心5分钟）后，在真空浓缩仪中干燥沉淀（30 °C下5分钟）。随后将沉淀重悬于30 µl水中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li> 为从血液中提取mRNA，将500 µl EDTA抗凝血液在300 × g、4 °C条件下离心10分钟。
		<ol>
			<li> 取含有白细胞的白膜层，用1 ml裂解液（150 mM NH4Cl、100 mM NaHCO3、0.1 mM Na-EDTA，pH 7.4）稀释。</li>
			<li> 室温孵育10分钟后，在650 × g条件下离心6分钟，随后用PBS洗涤两次。</li>
			<li> 使用RNA提取试剂盒，按照制造商说明书从白细胞（WBCs）中提取mRNA。</li>
		</ol>
		</li>
		<li> 使用包含随机六聚体的cDNA合成试剂盒，按照制造商说明书进行cDNA合成。每反应使用200 ng mRNA进行cDNA合成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li> 定量PCR
	<ol>
		<li> 为定量特定mRNA的含量，使用1 µl cDNA、1 µM正向/反向引物以及荧光DNA结合染料，具体操作按照制造商说明书进行27。引物序列见表1。使用定量PCR系统检测IL-1β、IL-6、IL-23、IFNγ、TNFα和PPIA（肽基脯氨酰异构酶）的CT值。</li>
		<li> 采用比较CT（循环阈值）法确定相对mRNA表达水平27。
		<ol>
			<li> 为此，将目的基因的CT值相对于PPIA的表达水平进行归一化处理，即用目的基因的CT值减去PPIA的平均CT值，方法如先前研究所述（Barthelmes et al.28, Schiffmann et al.29, Schiffmann et al.30）。随后计算ΔΔCT值，即将EAE小鼠目的基因的ΔCT值相对于未处理小鼠目的基因表达水平进行归一化，即用EAE小鼠的ΔCT值减去未处理小鼠的平均ΔCT值。</li>
			<li> 为获得目的基因的相对mRNA表达量，使用以下公式计算比值：2-ΔΔct。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li> 检测每对引物的特异性。使用2%琼脂糖凝胶电泳确定扩增片段大小31。片段大小见表1。</li>
</ol>

MJP 是 Xellia 和 Leo Pharmaceuticals 的顾问。

本文所述的EAE模型作为多发性硬化症（MS）的模型受到了广泛关注，并被常规用于测试针对MS的治疗策略32。该小鼠疾病表现出许多与MS相似的临床和组织学特征，其病因是针对神经元抗原的自身免疫被诱导激活。对髓鞘抗原的致敏反应与血脑屏障功能障碍相关，从而导致免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）。我们的研究结果显示，在急性期，淋巴结中的免疫细胞数量出现短暂性增加；在临床前阶段，脾脏中的T细胞和B细胞数量减少。在外周血中，T细胞、B细胞、树突状细胞和单核细胞在临床前阶段短暂增加，而中性粒细胞则随疾病进展持续增加。最后，在脊髓中可检测到免疫细胞的增多（图2）。这些数据表明，T细胞和B细胞从作为这些细胞储存库的脾脏迁移至淋巴结，在淋巴结中被激活并增殖；随后通过血液循环迁移至脊髓。而中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞则从骨髓经由血液循环迁移进入中枢神经系统。
我们的数据显示，在脊髓中，IFNγ、TNFα 和 IL-1β 的表达以疾病依赖的方式受到调控，而 IL-6 仅在疾病 onset 时短暂上调。这些数据支持 EAE 病理过程由 Th1 和 T...

多发性硬化症（MS）及其相应的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）均表现出中枢神经系统（CNS）内的自身免疫性神经炎症变化。早期活动性MS和EAE病灶的特征是存在浸润的免疫细胞。MS的病因尚不明确，但普遍认为涉及由自身反应性T细胞介导的髓鞘破坏。这些自身反应性T细胞分泌促炎性细胞因子和趋化因子，从而吸引循环系统中的其他免疫细胞，如B细胞、单核细胞和中性粒细胞。单核细胞分化为巨噬细胞。自身反应性T细胞分泌的干扰素γ（IFNγ）促使巨噬细胞极化为促炎性巨噬细胞。这类促炎性巨噬细胞释放细胞因子和活性氧，促进少突胶质细胞发生凋亡。少突胶质细胞的死亡导致脱髓鞘。此外，B细胞分化为浆细胞，并产生针对髓鞘的自身抗体，最终导致髓鞘降解。髓鞘的丧失进一步引起轴突和神经元的退化，从而在中枢神经系统内形成病灶，这是MS的主要特征1。在外周，T细胞和B细胞在淋巴结中被激活，在脾脏中增殖，并通过血液循环迁移至中枢神经系统。单核细胞和中性粒细胞在骨髓中增殖，同样经由血液循环迁移进入中枢神经系统。
白细胞从骨髓、脾脏和淋巴结进入血液，或从血液循环进入中枢神经系统的过程是一个多步骤事件，依赖于多种因素，包括由趋化因子及其受体介导的白细胞与内皮细胞之间的分子相互作用。在免疫反应过程中，肿瘤坏死因子-α（TNFα）、干扰素-γ（IFNγ）和白细胞介素-6（IL-6）等细胞因子可诱导多种细胞类型产生趋化因子，从而招募免疫细胞至炎症部位2,3免疫细胞根据细胞类型及其向炎症部位迁移的路径，在其表面表达特定的趋化因子受体亚群。因此，CXCR2、CCR1 和 CXCR1 在骨髓和血液中的成熟中性粒细胞上表达。4，其配体CXCL2、CCL5或CXCL6的结合可激活中性粒细胞，促进其与内皮细胞的黏附，并进一步促使细胞迁移至组织中5-9CCL2 和 CCL20 可趋化单核细胞及 Th1/Th17 细胞10，表达 CCR211 和 CCR612分别。CCR1 和 CCR5 由不同类型的细胞表达，包括 T 细胞、单核细胞和巨噬细胞13，结合CCL3、CCL5和CCL7，并在多发性硬化症期间上调14CXCR3 在 T 细胞上表达，并与 CCL9、CCL10 和 CCL11 结合15.
多发性硬化症（MS）治疗的一个主要策略是耗竭免疫细胞或阻止免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）。因此，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，已对特定趋化因子受体的阻断作用进行了研究。CCR116、CCR217、CCR718 或 CXCR219 的拮抗作用或基因敲除可减轻EAE的病理变化，而CCR120、CCR520 或 CXCR321 的拮抗作用或基因敲除则未能减轻病理变化。因此，白细胞表面特定趋化因子受体的表达对于其向中枢神经系统的浸润至关重要，并决定了EAE的病程发展。
耗竭免疫细胞是治疗多发性硬化症（MS）患者的有效策略，因为浸润的免疫细胞会释放细胞因子（如TNFα、IL-6和IL-1β），进而促进炎症过程或导致神经元退化22。此外，自身反应性Th1细胞会释放IFNγ，后者可进一步刺激巨噬细胞释放TNFα、IL-1β和IL-23。
本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的诱导方法，以及EAE小鼠不同组织中免疫细胞分布和细胞因子水平（mRNA）的测定。在疾病进程的不同时间点分离细胞，以提供炎症过程的时间依赖性概述，这些炎症过程最终导致中枢神经系统（CNS）病灶的形成。

<table><tbody><tr><td>ABI Prism 7500序列检测系统&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Austin, USA</td><td></td><td>定量PCR系统</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>A6964</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Frankfurt, Germany</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, Frankfurt, Germany</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&amp;nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>552843</td><td>补偿微珠</td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术绝对计数标准品&amp;nbsp;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germany</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪设置与追踪微珠&amp;nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich Munich, Germany</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE试剂盒</td><td>Hooke Laboratories, Lawrence, USA</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&amp;nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Germany</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>第一链cDNA合成试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc受体-1封闭缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术绝对计数标准品</td><td>Polyscience, Eppelheim, Germany</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo软件v10&amp;nbsp;</td><td>Treestar, Ashland, USA</td><td></td><td>流式细胞术分析软件</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&amp;nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td></td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&amp;nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>溶血溶液&amp;nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>K0221</td><td>荧光DNA结合染料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>74104</td><td>RNA提取试剂盒</td></tr></tbody></table>

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

多发性硬化症被认为是一种炎性自身免疫性疾病，其特征是中枢神经系统（CNS）内形成病灶，导致认知和运动功能障碍。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的一种有用动物模型，因为它同样以中枢神经系统病灶形成、运动功能障碍为特征，并且也由自身免疫和炎症反应驱动。其中一种EAE模型是通过在小鼠中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55的肽段诱导建立的。EAE小鼠表现出进行性的疾病进程，该进程分为三个阶段：临床前阶段（第0–9天）、疾病发作期（第10–11天）和急性期（第12–14天）。MS和EAE均由侵入中枢神经系统的自身反应性T细胞引发，这些T细胞分泌趋化因子和细胞因子，进而招募更多的免疫细胞。因此，本研究分析了在三个疾病阶段期间脊髓中的免疫细胞分布情况。为了明确T细胞、B细胞和单核细胞的活化/增殖/积聚起始于疾病发展的哪个时间点，还评估了淋巴结、脾脏和血液中的免疫细胞分布。此外，测定了三个疾病阶段中多种细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-23、TNFα、IFNγ）的水平，以深入了解疾病的炎症过程。综上所述，这些数据提供了EAE病理过程中免疫细胞功能谱的总体概况。

图1 给出了本文所述不同方法的示意图概述。 1) 小鼠接受 MOG 注射35-55 抗原暴露后10.7 ± 0.3天出现初始临床症状28EAE小鼠的代表性疾病进程如图所示 图1. 2) 在临床前阶段（第2天、第4天、第6天）、疾病 onset 阶段（第10天）以及疾病急性期（第12天、第14天）的不同时间点，从对照组和 EAE 小鼠中采集多种组织（脾脏、淋巴结、腰段脊髓）及血液。 3) 利用定量PCR检测疾病病程中不同时间点采集的多种组织内调控EAE发展的细胞因子的mRNA表达谱。 4) 从疾病进程的不同时间点提取的多种组织中分离单细胞，并通过流式细胞术确定免疫细胞分布。
在脾脏和淋巴结中，T细胞和B细胞是最...

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。

多发性硬化被认为是一种炎性自身免疫性疾病，其特征是在中枢神经系统（CNS）内形成病灶……

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的总体目标是促进对多发性硬化症发病潜在分子机制的研究。该方法有助于回答多发性硬化症领域中的关键问题，例如，免疫细胞在疾病发展的哪个阶段浸润中枢神经系统？该技术的主要优势在于，EAE模型模拟了多发性硬化症的许多主要特征，如脱髓鞘和免疫细胞浸润。该技术的应用前景涉及多发性硬化症的治疗，因为利用此方法测试的药物已有获批用于该疾病。通常，刚接触此方法的研究人员可能会遇到困难，因为在诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）时必须充分考虑多种条件。小鼠必须饲养在无应激环境中，且百日咳毒素应新鲜配制。该方法的官方演示至关重要，因为仅通过文字描述难以掌握淋巴结的分离和脊髓的提取。首先，向10至13周龄的雌性小鼠皮下注射200微克髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，该蛋白用200微升含400微克结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂乳化。在注射后立即以及24小时后，向小鼠腹腔内注射含0.2微克百日咳毒素的200微升PBS溶液。在诱导EAE之前，必须使小鼠适应操作处理和实验环境，以避免应激反应，因为应激可能抑制临床症状的发展。注射一周后，按照下表所述每日观察小鼠的临床症状。为评估EAE诱导后淋巴结的免疫细胞群体，在诱导后的适当时间点，用80%异丙醇润湿切口区域，小心去除髋部区域的皮肤。使用镊子从脂肪组织中仔细分离出腹股沟淋巴结。随后称量淋巴结重量，并将样本置于冰上PBS中。为了分析脊髓细胞，先用异丙醇润湿动物背部，然后使用解剖刀沿脊柱纵向切开。接着去除皮肤，分离出支配后肢的腰段脊柱部分。用装有 PBS 的注射器冲洗脊柱，以提取脊髓。切除约1/3的腰段脊髓后，称量脊髓组织片段，并将组织置于冰上的PBS中保存。为分析脾脏免疫细胞群体，打开组织以暴露腹腔下部。随后取出脾脏，并切除约1/8的组织。 称取脾脏组织碎片的重量，并将组织置于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存。随后，使用一支2 mL注射器的推杆将剩余组织通过50 mL离心管口上放置的70微米细胞筛网研磨成匀浆，再用5 mL PBS冲洗滤网。将滤过的细胞悬液离心。将沉淀物重悬于500微升细胞裂解缓冲液中，然后将细胞转移至1.5毫升离心管中。室温孵育10分钟后，用500微升PBS洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将沉淀物重悬于100微升含0.2% BSA的PBS中，并向细胞中加入2微升Fc受体1封闭缓冲液。室温避光孵育15分钟后，加入13微升抗体混合液，继续在室温避光条件下标记细胞15分钟。孵育结束后，用500微升PBS洗涤细胞至少两次，将最终的细胞沉淀重悬于500微升新鲜PBS中。然后将细胞转移至流式管中，并置于冰上。最后，为了通过流式细胞术分析样品，在进行流式细胞术检测前立即向细胞中加入30 µL流式细胞术绝对计数标准品，以确定细胞的绝对数量。然后在流式细胞仪上分析样品。如图所示，在EAE诱导的急性期，淋巴结内所有免疫细胞群体均出现短暂性增加。然而，在脾脏中，只有巨噬细胞、B 细胞、T 细胞和中性粒细胞表现出浸润增加。在血液中，所有免疫细胞群体在疾病临床前期均表现出外周循环中的短暂性升高，这与急性期腰段脊髓中类似的疾病依赖性升高相对应，但单核细胞群体除外，后者在进入脊髓后可能分化为巨噬细胞。此处展示了用于评估不同细胞群体的设门策略。细胞数量与所分析的组织量或血容量相关，反映了细胞的绝对计数。在淋巴结中，IL-23 mRNA 的表达在临床前期升高，而 IL-6 的表达则随疾病进展而升高。在脾脏中，IL-6 和 IL-23 的表达在临床前期即升高，而 IL-1β mRNA 的表达则直至疾病发作后才受到影响。在血液中，仅有 TNF-α mRNA 的表达上调，且其上调方式与疾病相关。在腰段脊髓中，TNF-α、IL-1β 和干扰素 γ 在疾病的急性期被诱导表达，而 IL-6 仅在疾病 onset 期上调。若操作熟练，正确完成 EAE 模型构建、后续细胞分离及效应分析，十只小鼠的全部流程可在八小时内完成。通过此操作步骤，可进一步采用其他方法（如蛋白质印迹或ELISA）来验证mRNA表达分析的结果。该技术建立后，为多发性硬化症领域的研究人员探索中枢神经系统脱髓鞘机制提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何诱导EAE模型，以及如何分离免疫细胞以获得可重复的流式细胞术结果。不要忘记，使用完全弗氏佐剂可能具有极高危险性，在进行该操作时应采取预防措施，例如提起小鼠皮肤，并确保注射器完全穿透皮肤。

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免疫学与感染

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小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

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在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

本方案描述了如何确定实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物治疗是通过抑制免疫细胞浸润而产生中枢神经系统保护作用，还是在免疫细胞浸润攻击过程中具有神经保护作用。...

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在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前最常用的多发性硬化小鼠模型之一。在本方案中，对两种性别的C57BL/6J小鼠使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽进行免疫，主要导致尾巴和肢体的上升性轻瘫。本文将讨论EAE的诱导与评估方案。...

在两种性别中建模多发性硬化症：MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

了解实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导方法，用于研究多发性硬化症的分子机制。该方案结合流式细胞术和定量PCR技术，可分析小鼠淋巴结、脾脏、血液及脊髓中的免疫细胞分布与细胞因子mRNA表达水平，为神经免疫学研究提供可靠工具。

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

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