Name: 协议小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 了解如何通过瞬时过表达转录因子将小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为诱导性滋养层干细胞。该方法利用Tfap2c、Gata3、Eomes和Ets2等因子，为研究胚胎与胚外谱系之间的屏障机制提供了可靠的实验手段。

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所有小鼠实验均依照德国动物保护法进行，并获得当地机构动物护理委员会（北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局[批准编号：AZ 84-02.04.2013.A428]）的批准。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>配制293T培养基：DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），10%（v/v）胎牛血清（FBS），L-谷氨酰胺（2 mM），丙酮酸钠（1 mM），青霉素/链霉素（1×）。</li>
	<li>配制MEF培养基：DMEM，10%（v/v）FBS，L-谷氨酰胺（2 mM），1×非必需氨基酸，青霉素/链霉素（1×）。</li>
	<li>配制TS培养基（不含FGF4/肝素）：RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640培养基），20%（v/v）FBS（干细胞培养级），青霉素/链霉素（1×），L-谷氨酰胺（2 mM），丙酮酸钠（1 mM），2-巯基乙醇（0.1 mM）。</li>
	<li>配制含FGF4/肝素的TS培养基（TS + F4H）：RPMI 1640，20%（v/v）FBS（干细胞培养级），青霉素/链霉素（1×），L-谷氨酰胺（2 mM），丙酮酸钠（1 mM），2-巯基乙醇（0.1 mM），25 ng/ml FGF4，1 µg/ml肝素。 
	注意：FGF4和肝素需在使用前立即直接加入培养基中。</li>
	<li>配制含FGF4/肝素的TS条件培养基（TS-CM + F4H）：70% MEF条件培养的TS培养基 + 30% 新鲜配制的TS培养基 + 25 ng/ml FGF4，1 µg/ml肝素。 
	注意：FGF4和肝素需在使用前立即直接加入培养基中。</li>
	<li>配制转染培养基：Advanced DMEM，2%（v/v）FBS（干细胞培养级），L-谷氨酰胺（2 mM），青霉素/链霉素（1×）。</li>
	<li>配制病毒生产培养基：Advanced DMEM，5%（v/v）FBS（干细胞培养级），L-谷氨酰胺（2 mM），青霉素/链霉素（1×）。</li>
</ol>
2. 小鼠胚胎成纤维细胞的分离
<ol>
	<li>使用野生型129S2SV雌鼠与纯合子雄性R26::rtTA小鼠（品系名称：B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7）进行定时交配。在E13.5天通过颈椎脱臼法处死小鼠，并按照标准方案8分离原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。随后，将一个胚胎的细胞接种至150 mm培养皿中，使用MEF培养基进行培养。</li>
	<li>当150 mm培养皿中的原代MEF细胞达到汇合状态时，用10 ml PBS洗涤细胞两次，加入4 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液。将培养皿置于37 °C培养箱中孵育3–4分钟。</li>
	<li>孵育结束后，在倒置显微镜下（使用10倍物镜）检查细胞是否已从培养皿表面脱落。加入5 ml MEF培养基以终止消化反应，并将细胞悬液收集至50 ml锥形管中。</li>
	<li>合并多个培养皿的细胞悬液，收集至一个50 ml锥形管中。在200 × g、10 °C条件下离心3分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含有10%（v/v）二甲基亚砜的FBS中。将MEFs分装后冻存，以备后续使用。 
	注意：也可使用野生型原代MEFs；但需同时转导表达rtTA的慢病毒载体（例如使用Maherali et al.9描述的FUdeltaGW-rtTA质粒）与其他慢病毒载体。</li>
	<li>MEF条件培养的TS培养基的制备 
	注意：在进行转化实验前，必须预先制备MEF条件培养的（CM）TS培养基，该培养基用于单个诱导型滋养层干细胞（iTSC）系的传代培养（见第6节）。
	<ol>
		<li>将每150 mm培养皿接种1 × 107个有丝分裂失活的MEFs，使用MEF培养基接种所需数量的培养皿。通过γ射线照射（剂量为9 Gy）使MEFs失活。 
		注意：每个150 mm培养皿可获得约60 ml条件培养基（CM）。</li>
		<li>接种后第二天，吸除并弃去MEF培养基，向每个含有有丝分裂失活MEFs的培养皿中加入20 ml新鲜配制的TS培养基（不含FGF4/肝素），并将培养皿放回37 °C培养箱中继续培养。</li>
		<li>TS培养基在有丝分裂失活的MEFs上孵育三天后，将培养基收集至50 ml锥形管中。使用0.2 µm滤器过滤培养基，然后进行步骤2.6.4。每批收集后，向培养皿中更换20 ml新鲜TS培养基，以制备下一批CM。 
		注意：有丝分裂失活的MEFs最多可用于三次CM的制备。</li>
		<li>将过滤后的CM按每管35 ml分装至50 ml锥形管中，于-20 °C保存备用。使用时解冻后加入15 ml新鲜配制的TS培养基，得到70% TS-CM，置于4 °C保存，可使用一个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在293T细胞中生产慢病毒载体
注意：所有步骤均在生物安全二级许可的实验室内进行。
<ol>
	<li>在进行转化实验之前，制备用于多西环素（dox）诱导下过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2 和 mCherry 的慢病毒载体。针对每种慢病毒，将相应的慢病毒转移载体与包装质粒及表达 VSV-G 的包膜质粒共同转染 293T 细胞（质粒信息参见材料表）。 
	注意：有关病毒制备的有用信息，请参见 Gavrilescu 等10尽管本文描述的是逆转录病毒的制备，但有关293T细胞质量和质粒DNA的一般性说明同样适用于慢病毒的制备。 
	警告：使用慢病毒载体时需采取适当的安全防护措施，操作必须在生物安全二级设施中进行。</li>
	<li>用5 ml聚-L-赖氨酸（100 µg/ml）溶液覆盖五个100 mm培养皿，轻轻摇晃使包被溶液均匀分布。将培养皿置于37 °C培养箱中孵育30分钟。30分钟后吸除包被溶液，并用PBS冲洗培养皿一次。</li>
	<li>铺板 7 × 106 每皿加入10 ml 293T细胞培养基中的293T细胞，轻轻摇晃培养皿使细胞均匀分布，然后将培养皿放回37 °C培养箱中。</li>
	<li>次日早晨，将生长培养基更换为5 ml转染培养基。加入6 µl的氯喹溶液（25 mM）1,000倍储存液，然后将培养皿放回37 °C培养箱中。</li>
	<li>同时，准备转染混合物：
	<ol>
		<li>为每种慢病毒载体准备两支5 ml反应管，分别标记为A和B。</li>
		<li>向A管中加入600 µl的2倍HEPES缓冲盐水（HBS）。</li>
		<li>在B管中混合61.5 µl CaCl₂2 溶液（2 M），含18.5 µg 慢病毒载体DNA、9.25 µg psPAX2 和9.25 µg pMD2.G。用无菌培养级H调整体积至600 µl2O.</li>
		<li>将B管中的溶液逐滴加入A管中，同时涡旋混匀。室温孵育转染混合物15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将转染混合物小心地逐滴加入已准备好的100 mm培养皿中的293T细胞中。5至6小时后，吸除培养基，更换为10 ml病毒生产培养基。将培养皿放回37 °C培养箱中继续培养。 
	注意：更换培养基时需小心操作，因为293T细胞容易从培养皿上脱落。转染后5-6小时更换培养基至关重要，因为氯喹长时间暴露对细胞具有毒性。</li>
	<li>次日早晨，小心吸除并弃去培养基，更换为7 ml病毒生产培养基。</li>
	<li>次日早晨收集第一批次含病毒的培养基。吸出培养基并收集至15 ml锥形管中。再次向细胞中加入7 ml病毒生产培养基。将含病毒的培养基保存在冰箱中，直至次日收集第二批次。</li>
	<li>次日早晨，吸出第二批含病毒的培养基，加入含有第一批病毒培养基的15 ml锥形管中。此时可弃去293T细胞。使用0.45 µm无表面活性剂的醋酸纤维素膜滤器过滤含病毒的培养基。将过滤后的含病毒培养基分装，于-80 °C保存，以备后续使用。 
	注意：病毒生产也可在6孔板中进行，相应减少体积和细胞数量即可。</li>
</ol>
4. 使用4种因子和mCherry对照载体对成纤维细胞进行转导
注意：所有步骤均在生物安全二级设施中进行。
<ol>
	<li>有关实验流程的示意图，请参见图1。解冻一份原代rtTA-MEF细胞 aliquot，将3.33 × 105个细胞接种至6孔板的每个孔中，每孔总体积为2 ml MEF培养基。至少准备3个孔，并分别标记为4因子（4F）、mCherry和对照组。 
	注意：也可使用野生型MEF细胞，此时在步骤4.2中配制慢病毒混合液时需加入表达rtTA的慢病毒载体。</li>
	<li>细胞从冻存状态完全复苏后的第二天，分别向三个6孔板孔中更换转导培养基，体积分别为0.6 ml（4F组）、0.9 ml（mCherry组）和1 ml（对照组）。在室温下解冻一份含有pLV-tetO-Tfap2c、-Gata3、-Eomes、-Ets和-mCherry病毒的aliquot，取每种病毒上清液（Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2）各100 µl加入4F孔中。 
	注意：若使用野生型MEF细胞，需将预铺的培养基体积减少100 µl，并额外向4F组混合液中加入100 µl含FUdeltaGW-rtTA病毒的上清液。</li>
	<li>向标记为mCherry的孔中加入100 µl含mCherry病毒的培养基。每孔加入polybrene，使其终浓度为8 µg/ml。将培养板放回37 °C培养箱中，过夜孵育MEF细胞与含病毒的上清液。 
	注意：若使用野生型MEF细胞，需将预铺的培养基体积减少100 µl，并额外加入100 µl含FUdeltaGW-rtTA病毒的上清液。</li>
	<li>次日早晨，小心移除含病毒的培养基，用2 ml PBS洗涤三次。最后，每孔加入2 ml TS培养基（不含FGF4/肝素）。 
	注意：转导后的MEF细胞可直接用于诱导型滋养层干细胞（iTSC）诱导实验，也可冻存以备后续使用。</li>
</ol>
5. 成纤维细胞向诱导滋养层干细胞（iTSC）的转化
注意：所有步骤均在生物安全二级许可的实验室内进行。
<ol>
	<li>用 2 ml PBS 将转导的 MEFs 洗涤两次，加入 0.5 ml 胰蛋白酶/EDTA 溶液后，在培养箱中孵育 3 - 4 分钟。在倒置显微镜下观察细胞是否充分脱离。
	<ol>
		<li>加入 1 ml TS 培养基以终止胰蛋白酶作用。将细胞悬液转移至 15 ml 圆锥形离心管中，在 200 × g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，用 2 ml TS 培养基重悬细胞沉淀。使用未转导的对照样品进行细胞计数。</li>
		<li>将 4F-MEFs、mCherry-MEFs 和未转导的对照 MEFs 分别以每 100 mm 细胞培养皿 2 × 105 个细胞的密度接种于含 2 µg/ml 多西环素的 10 ml TS 培养基中（TS 培养基 + FGF4/肝素 + 多西环素）。</li>
		<li>也可在较小规格的培养皿中进行转分化实验。按每 cm2 接种 3.6 × 103 个细胞的密度接种于所需尺寸的培养皿中，并相应调整培养基体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，使用落射荧光显微镜（配备 10X&#160;物镜及适用于红色荧光激发的滤光片）观察 mCherry 蛋白的表达情况，以评估转导效率。 
	注意：转导效率应接近 100%。若在转基因诱导后出现明显的细胞死亡，则表明病毒滴度过高，应减少含病毒培养基的用量后重新进行转导。</li>
	<li>从此时起，每隔一天更换所有培养皿中的培养基，持续至接种后第 10 天。此后，使用不含多西环素的 TS 培养基（TS 培养基 + FGF4/肝素）对细胞进行换液培养。</li>
	<li>使用倒置显微镜持续观察 4F 培养皿中“转分化区域”的出现情况（参见 图 2B 和 C），观察时间最长可达 3 周。此类克隆在两个对照培养皿（mCherry-MEFs 和未转导 MEFs）中不应可见。</li>
</ol>
6. 单个iTSC细胞系的分离
注意：步骤6.3不需要使用组织培养罩。建议用70%乙醇擦拭倒置显微镜，以尽量减少细菌污染的风险。在转分化过程的第21至28天之间，可分离单个iTSC克隆。
<ol>
	<li>向96孔U型底培养板的12个孔中每孔加入40 µl 0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，并将培养板置于冰上。</li>
	<li>在进行克隆分离前，吸除4F-MEF转分化培养皿中的培养基，用10 ml PBS洗涤细胞一次。再次加入10 ml PBS，并将培养皿置于倒置显微镜下。</li>
	<li>使用设定为40 µl的100 µl移液器，用枪头围绕单个克隆进行环取并吸起漂浮的克隆，将每个克隆的细胞分别转移至已准备好的96孔板中的一个孔内。挑取12个克隆后，将96孔板放入37 °C培养箱中孵育5分钟。</li>
	<li>通过反复吹打使细胞解离，然后将细胞悬液转移至含有500 µl预配TS-CM培养基（30%新鲜TS培养基 + 70% CM + FGF4/肝素）的24孔板中的一个孔内。</li>
	<li>次日更换为新鲜的TS-CM培养基以去除死细胞，之后每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>观察具有明亮边界的上皮样克隆的出现情况（参见图2）。一旦出现克隆，继续培养至细胞融合度达70%，或最多培养一周，并逐步在更大的培养皿中扩增。此后，按照含血清或无血清定义培养基中的标准方案，将细胞作为真正的滋养层干细胞（TSCs）进行培养3,5,11。</li>
</ol>

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li>
<li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+S+%22Science%22">Science</a>. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li>
<li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta%2Factivin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li>
<li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550(2007).</li>
<li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍的基于4种因子（Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2）的转分化方案，提供了一种可靠的方法，可将小鼠胚胎成纤维细胞高效地转化为诱导型滋养层干细胞（iTSCs）。此外，该方法也可用于出生后尾部成纤维细胞的转化，但其效率较胚胎成纤维细胞有所下降3。总体而言，原代成纤维细胞的质量是转分化效果的关键因素，应尽量使用低代次细胞（第2至第3代）。
本方案的优势在于使用强力霉素诱导型载体，可实现对转基因表达的时间控制。这使得能够建立稳定的诱导型滋养层干细胞（iTSC）系，激活内源性转录因子网络，从而在不依赖转基因表达的情况下维持滋养层干细胞命运。这与先前发表的方案形成对比，后者描述了从胚胎干细胞诱导产生滋养层干细胞命运的方法，而该方法迄今为止仅能获得重编程不完全的类滋养层干细胞1。
然而，本方案的一个已知局限性在于转分化后出现的克隆数量存在变异，导致难以预测转分化效率。这些局限性是由于&#160;若干高度可变的因素对转分化结果至关重要：单个慢病毒载体的转导效率、起始细胞群体的增殖程...

最近，一项比较多种小鼠胚胎干细胞向滋养层干细胞转化方法的研究表明，在所有被分析的系统中，谱系转化均未完全完成。所生成的并非诱导性滋养层干细胞（iTSCs），而是所谓的滋养层干细胞样细胞，这些细胞仍保留着起源细胞命运的记忆1。在此，我们采用了一种不同的iTSC生成策略。类似于从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）直接诱导生成多能干细胞的方法2，我们实现了从已分化的体细胞组织直接转化为iTSCs。首先，我们筛选出12个候选因子，当在MEFs中过表达时可诱导滋养层干细胞命运。随后发现，Tfap2c、Gata3、Eomes和Ets2这四个因子对于诱导iTSCs是必要且充分的3。与此同时，另一研究团队独立证实Tfap2c、Gata3和Eomes三个因子足以将MEFs转化为iTSCs。然而，在该研究中，相较于我们的实验，外源基因表达所需时间显著更长，表明当转分化组合中缺少Ets2时，转化动力学存在差异4。
传统的含有胎牛血清（FBS）的培养体系在诱导型及囊胚来源的滋养层干细胞培养中依赖于经增殖失活的MEF细胞所分泌的因子5,6。在诱导型滋养层干细胞（iTSC）的诱导过程中，这些因子由MEF细胞提供，这些MEF细胞不携带完整的转基因组合，也不会发生转分化。然而，一旦单个iTSC克隆被传代培养，它们就需要使用经增殖失活的MEF细胞预处理过的培养基。此后，iTSC可按照标准操作流程，像囊胚来源的TSC一样进行培养和处理。值得注意的是，与Tanaka et al. 5的方法不同，我们常规在培养TSC和iTSC时并不对细胞培养皿进行明胶包被处理。

<table><tbody><tr><td>盐酸多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>溶于无菌 PBS 中，配制 2 mg/ml 储存液。分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>磷酸氯喹&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>用无菌细胞培养级水配制 25 mM 储存液。分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>聚凝胺（六亚甲基溴化双胺）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>用无菌细胞培养级水配制 8 mg/ml 储存液。分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>人重组成纤维细胞生长因子 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>溶于含 0.1% BSA 的无菌 PBS 中，配制 25 &amp;micro;g/ml 储存液。分装后于 -80 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>用无菌 PBS 溶解，配制 1 mg/ml 储存液。分装后于 -80&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>ProFection 哺乳动物转染系统</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS，不含钙、不含镁</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640，不含谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>无表面活性剂的醋酸纤维素膜滤器</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)，细胞培养级</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(rtTA*M2)Jae/J 7&lt;/sup&gt;</td><td>JAX Mice</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞的实验方案

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

滋养层干细胞（Trophoblast stem cells, TSCs）是哺乳动物发育过程中首次细胞命运决定的产物。它们可以被培养 体外，保持自我更新能力，并能分化为滋养层谱系的所有亚型，相当于 体内 产生胎盘胎儿部分的干细胞群体。因此，滋养层干细胞（TSCs）为研究胎盘发育以及胚胎与胚外细胞命运决定提供了独特的模型 体外从囊胚阶段开始，由DNA甲基化和组蛋白修饰构成的特定表观遗传屏障严格区分了这两个谱系。本文介绍了一种通过在小鼠胚胎成纤维细胞中瞬时过表达滋养层关键调控因子Tfap2c、Gata3、Eomes和Ets2，以完全克服该谱系屏障的实验方案。所诱导生成的滋养层干细胞具有自我更新能力，在形态学、标志基因表达及甲基化模式方面与囊胚来源的滋养层干细胞几乎完全相同。功能上 体外 和 体内 检测证实，这些细胞能够沿滋养层谱系分化，产生多倍体滋养层巨细胞，并在注入胚泡时嵌合到胎盘中。由体细胞组织诱导产生滋养层干细胞为研究这一胚外谱系的遗传与表观遗传特性开辟了新途径，同时也提供了无需破坏相应胚胎即可生成滋养层干细胞系的可能性。

在转入4F基因表达被激活的培养皿中，细胞迅速发生形态变化（比较 图2A和B。大约在第14至21天，出现明显的转分化区域（文中给出了两个示例） 图2B和C）。这些初级克隆缺乏典型的滋养层干细胞（TSC）形态；然而，一旦进行传代培养，便会呈现出具有紧密边缘和明亮边界的特征性上皮样形态，与真正的TSCs非常相似（图 2D）。4F-iTSCs 对滋养层转录因子 Cdx2 和 Tfap2c 呈阳性染色（图2E）。这些诱导性滋养层干细胞系现可用于后续实验 体外 或 体内 分析， 即, 体外 分化实验或胎盘嵌合实验。
<img alt="基因表达时间线示意图；转导、转基因诱导、克隆分离过程。" src="/files/ftp_upload/54277/54277...

本文介绍了一种通过在十天内过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和 Ets2，将小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为功能完整且稳定的滋养层干细胞的实验方案。

滋养层干细胞（TSCs）是哺乳动物发育过程中首次细胞命运决定的结果。它们可在体外培养并保持……

本实验的总体目标是从小鼠成纤维细胞生成真正的诱导滋养层干细胞（iTSCs）。该方法有助于回答干细胞领域中的关键问题，即胚胎谱系与胚外谱系之间屏障的本质。该技术的主要优势在于转基因表达仅短暂激活，从而有利于稳定转化细胞的筛选。在配备适当个人防护装备的生物安全二级实验室中，用5毫升多聚赖氨酸溶液覆盖五块100毫米培养皿，轻轻摇晃培养皿使包被液均匀分布。将培养皿放入37°C培养箱中孵育30分钟，随后吸除多聚赖氨酸溶液，并用PBS冲洗培养皿一次。接着，在每块培养皿中加入7×10⁶个293T细胞，置于10毫升293T细胞培养基中，轻轻旋转培养皿使细胞均匀分布，然后将培养皿放回培养箱中继续培养。第二天早晨，将生长培养基更换为五毫升转染培养基。然后向培养物中加入六微升1000倍浓缩的氯喹溶液，并将培养板放回37摄氏度的培养箱中。为制备转染混合液，针对每种慢病毒载体，将600微升慢病毒载体DNA溶液逐滴加入600微升2X HEPES缓冲盐溶液中，同时涡旋混匀，并将转染混合液在室温下孵育。15分钟后，将混合物逐滴非常小心地加入已准备好的293T细胞中，然后将培养皿放回培养箱。5至6小时后，更换为10毫升病毒生产培养基，并将培养板重新放回培养箱。次日早晨，小心更换为7毫升新鲜的病毒生产培养基，继续过夜培养。接下来，将每块培养板中的培养基转移至单独的15毫升锥形管中，并向培养板中加入7毫升新鲜的病毒生产培养基，继续过夜培养。次日早晨，收集第二批含病毒的培养基，将上清液与第一批病毒液合并，然后将含病毒的培养基通过0.45微米无表面活性剂的醋酸纤维素膜滤器过滤，分装为500微升的 aliquot，于-80℃保存。为将成纤维细胞转化为诱导性滋养层干细胞，用2毫升PBS将转导后的胚胎成纤维细胞（MEFs）洗涤两次。然后在37摄氏度下用0.5毫升胰蛋白酶EDTA溶液使细胞脱离。三到四分钟后，在倒置显微镜下确认细胞已从培养皿上脱落，随后加入1毫升TS培养基以终止胰蛋白酶作用。将细胞悬液转移至各自的15毫升锥形管中，并离心收集细胞。然后将沉淀重悬于2 mL TS培养基中，并在含有成纤维细胞生长因子4和肝素、并补充了多西环素的10 mL TS培养基中，每100 mm培养皿接种两次，每次接种5×10⁴个表达mCherry的四因子转导细胞或对照未转导MEF细胞，进行过夜培养。次日，在落射荧光显微镜下，通过mCherry蛋白的表达情况评估转导效率。若转导效率约为100%，则将培养物放回培养箱，并每隔一天更换所有培养皿中的培养基，直至第10天。此后，使用倒置显微镜监测四因子培养皿中转分化区域的出现情况，持续长达三周；在此期间，用含有成纤维细胞生长因子4和肝素但不含多西环素的新鲜TS培养基喂养细胞。识别转分化区域至关重要，因为此时MEFs在形态上并不类似于滋养层干细胞。应寻找紧邻滋养层巨细胞的密集堆积的克

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