协议小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞

在这里，我们提出了一种方案，通过过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和 Ets2 十天，将小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为功能齐全且稳定的滋养层干细胞。

该程序的总体目标是从小鼠成纤维细胞中产生真正诱导的滋养层干细胞或 iTSC。这种方法可以帮助回答干细胞领域中关于将胚胎与胚胎外谱系分开的屏障性质的关键问题。该技术的主要优点是转基因表达仅被瞬时激活，便于选择稳定转化的细胞。

在生物安全二级实验室中，使用适当的个人防护设备，用 5 毫升聚-L-赖氨酸溶液覆盖五个 100 毫升的培养皿，轻轻摇动板以均匀分布涂层溶液。将培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中 30 分钟，然后吸出聚-L-赖氨酸并用 PBS 冲洗培养皿一次。接下来，在 10 毫升 293 T 细胞培养基中，每培养皿 10 到 6 个 T 细胞接种 7 次，旋转培养皿以均匀分布细胞，然后将培养皿放回培养箱中。

第二天早上，用 5 mL 转染培养基替换生长培养基。然后用 6 微升 1000X 氯喹原液处理培养物，并将板放回 37 摄氏度的培养箱中。为了制备转染混合物，对于每种慢病毒载体，在涡旋时将 600 μL 慢病毒 DNA 溶液滴加到 600 μL 2X HEPES 缓冲盐水中，并在室温下孵育转染混合物。

15 分钟后，非常小心地将混合物逐滴加入准备好的 293 个 T 细胞中，然后将培养皿放回培养箱中。5 到 6 小时后，用 10 mL 病毒生产培养基替换培养基，然后将板放回培养箱中。第二天早上，小心地用 7 mL 新鲜病毒生产培养基替换培养基，再次孵育过夜。

接下来，将培养基从每个板转移到单独的 15 mL 锥形管中，并在板上加入 7 mL 新鲜病毒生产培养基，再次孵育过夜。第二天早上，收获第二批含病毒的培养基，将上清液与第一批病毒混合，并通过 0.45 微米不含表面活性剂的醋酸纤维素膜过滤器将含病毒的培养基过滤，以 500 微升等分试样储存在负 80 分。为了将成纤维细胞转化为诱导滋养层干细胞，用 2 毫升 PBS 洗涤转导的团块胚胎成纤维细胞或 MEF 两次。

然后在 37 摄氏度下用 0.5 毫升胰蛋白酶 EDTA 溶液分离细胞。三到四分钟后，在倒置显微镜下确认细胞已从板中浮出，然后用 1 毫升 TS 培养基激活胰蛋白酶。将细胞悬液转移到单独的 15 ml 锥形管中，并离心细胞。

然后将沉淀重悬于 2 毫升 TS 培养基中，并将每 100 毫升培养皿中的未转导 MEF 接种 2 次 10 至第五个 4 因子 mCherry 或 10 毫升培养皿中未转导的 MEFs，该培养基含有成纤维细胞生长因子 4 和补充有多西环素的肝素，用于过夜培养。第二天，在落射荧光显微镜下，使用 mCherry 蛋白表达来估计转导效率。如果转导效率约为 100%，则将培养物放回培养箱中，每隔一天更换一次所有培养皿中的培养基，直到第 10 天。

此后，使用倒置显微镜用含有成纤维细胞生长因子 4 和不含多西环素的肝素的新鲜 TS 培养基喂养细胞，以监测四个因子培养皿上异分化区域的外观长达三周。鉴定跨分化区域至关重要，因为此时 MEF 在形态上与滋养层干细胞不相似。寻找与滋养层巨细胞相邻的密集堆积的菌落，这些菌落可通过它们的细胞大小和大细胞核来识别。

要分离单个 iTSC 线，首先用 70% 乙醇擦拭倒置显微镜，以尽量减少细菌污染的机会。接下来，将 40 微升 05% 胰蛋白酶 EDTA 添加到 96 U 底孔板的 12 个孔中，并将板置于冰上。现在从四因子的 MEF 转分培养皿中吸出培养基，并用 10 毫升 PBS 洗涤细胞一次。

洗涤后，向细胞中加入 10 毫升新鲜 PBS，并将板放在倒置显微镜载物台上。使用设置为 40 μL 的 100 微升移液器，用移液器吸头环绕每个单独的菌落并吸出得到的漂浮菌落。将每个菌落转移到 96 孔板的单个孔中，直到挑选出 12 个菌落。

然后将菌落在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。在孵育结束时，用移液分离细胞，并将细胞悬液转移到含有 500 μL 完全 TS 加成纤维细胞生长因子和肝素培养基的 24 孔板的各个孔中，用于过夜培养。第二天，用新鲜的完全 TS 加成纤维细胞生长因子和肝素培养基替换培养基，以去除死细胞并将板放回培养箱中。

每天监测培养物中具有明亮边界的上皮集落的出现。观察菌落后，将细胞培养长达一周或直到它们达到 70% 汇合。在激活 4 因子转基因表达的培养物中，细胞会迅速改变形态。

大约在第 14 至 21 天，出现明显的跨分化区域。这些原代菌落缺乏典型的滋养层干细胞形态，但是一旦它们被传代培养，就会观察到具有紧密边缘和明亮边界的特征性上皮形态，很容易让人想起真正的滋养层干细胞。当这四个因子诱导的滋养层干细胞对滋养层转录因子、 Cdx2 和 Tfap2c 保持阳性时，这些细胞系的想法可用于后续的体外或体内分析。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在六周内完成。按照此过程，可以执行其他方法，如原始细胞辅助注射，以回答有关生成的 iTSCs 的嵌合化潜力的其他问题。开发后，这项技术为该领域或早期谱系分离的研究人员探索小鼠胚胎与胚胎外细胞命运转换铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何直接将新的胚胎成纤维细胞转化为诱导滋养层干细胞有一个很好的了解。不要忘记，使用慢病毒载体可能非常危险，应始终遵循预防措施，例如使用生物安全二级，适当的工作流程。