体内模型对缺氧对肿瘤转移的影响测试

该程序的总体目标是使用动物模型直接测试肿瘤缺氧对转移的影响。该方法有助于确定缺氧促转移作用的潜在机制和防止肿瘤播散的潜在新治疗靶点。该技术的两个优点是能够测试体内肿瘤缺氧的影响，并概括癌症患者发生的转移和细胞相互作用的步骤。

在我们的模型中，肿瘤缺氧是通过结扎向小鼠荷瘤肺门供血的股动脉产生的。随后的后肢截肢阻止了与重复原发性肿瘤生长相关的活动性，从而形成转移。演示该程序的将是 Jason Tilan、Sung-Kyeok Hung 和乔治城大学临床前成像研究实验室的联合主任 Olga Rodriguez 博士。

要注射尤文肉瘤细胞，请轻轻抑制一只 4 到 6 周龄的雌性 SCID 米色小鼠，稳定第四和第五指之间的左腿，以露出下后肢的内侧。将一根 28 号 1/2 英寸的针头以大约 30-45 度角向前插入腓肠肌，朝向胫骨嵴。当针尖接触牙峰时，轻轻抽出针头，缓慢注射 0.1 毫升尤文肉瘤细胞，同时继续拔针。

然后使用数字卡尺每天通过内侧/外侧和前/后长度测量小腿大小，直到肿瘤大小达到所需的体积。在开始结扎之前，皮下注射镇痛剂，然后施用 Hypoxyprobe-1 以确认缺氧。接下来，将麻醉的鼠标放在作表面的加热垫上，并在动物的眼睛上涂抹药膏。

然后，用一条胶带从中线约 45 度处伸展并固定后肢。用脱毛霜去除手术区域，10 秒后用乙醇准备垫去除乳膏，然后用连续三次 10% 聚维酮碘和乙醇湿巾对暴露的皮肤进行消毒。将鼠标转移到立体显微镜下，从大腿中部向腹股沟区域在皮肤上切开 1 厘米。

使用蘸有生理盐水的细棉签，轻轻刷掉大腿肌肉周围的皮下脂肪组织。然后小心地钝解剖皮下脂肪组织，露出下面的股动脉。稳定伤口和手术区域，露出中上内收肌的脉管系统，用细镊轻轻刺穿膜性股骨鞘，露出神经血管束。

使用一套干净的细镊子，在腹股沟附近、腹股沟韧带远端的近端位置，将股动脉与股静脉和神经解剖并分离。然后，在股骨外侧回旋支支远端的股动脉下通过一根 6-0 丝缝合线，并用双结闭塞股动脉。用 6-0 聚丙烯缝合线闭合切口，皮下注射 0.5 毫升温盐水用于体液平衡治疗。

然后将动物放在恢复笼中悬垂的暖垫上，并进行监测，直到完全恢复。在适当的实验时间点，轻轻抑制动物并用剪刀从胫骨远端到骨盆区域剃掉荷瘤肢体的毛发。注射镇痛剂，将麻醉的动物置于右侧卧位，放在放置在加热垫上的无菌窗帘上。

如刚才所示，在眼睛上涂抹软膏并对手术部位进行消毒。然后，在动物身上放置无菌窗帘，并在股骨中间圆周皮肤切口，然后进行钝性解剖和皮肤近端回缩。暴露腿部正中侧的内侧股神经血管蒂。

然后使用 4-0 聚乳蛋白 910 涂层的可吸收缝合线在腹股沟韧带附近结扎。使用剪刀对肌肉进行股骨中段横切，然后将软组织钝性解剖到髋股关节。使用骨切割器进行股骨中截骨术，然后用可吸收的明胶海绵轻轻按压截骨部位，以尽量减少出血。

然后使用手术伤口夹闭合覆盖的皮肤，并皮下注射 0.5 毫升温盐水进行体液平衡治疗。每周至少两次，仔细触诊肿瘤注射动物的头部、颈部和腋窝区域以及对侧后肢。通过腹胀检查内脏转移，通过食指轻轻的剑突压力检查是否存在肺转移。

为了在适当的实验时间点通过 MRI 评估内部器官转移，请打开连接到温水循环系统的泵，以将小鼠维持在生理体温。然后，将呼吸传感器与动物的上腹部接触，并打开 BIOPAC Systems 呼吸监测设备。将麻醉的小鼠放在定制设计的小鼠立体定位支架上，并将眼药膏涂抹在动物的眼睛上。

为了减少运动伪影和噪声，请在 MRI 协议中选择门控选项，以将数据收集与呼吸周期同步。然后，运行二维 T2 加权解剖成像序列以对转移灶进行成像。对于截肢、切开或尸检后的原代肿瘤细胞培养，从每个感兴趣的组织样本中收获 2 至 3 个 2-3 毫米的湿润有光泽的粉红色活肿瘤组织片段，并将分离的片段放入含有新鲜原代培养基的 6 厘米细胞培养板中。

然后，将组织转移到细胞培养箱中，以达到适当的细胞生长期。将尤文肉瘤细胞注射到腓肠肌后，允许原发肿瘤生长到 250 立方毫米的小腿大小。通过 Hypoxyprobe-1 染色确定，该体积的对照肿瘤仅在远离脉管系统的细胞中表现出相对较低的内源性缺氧水平。

相比之下，股动脉结扎会在绝大多数肿瘤细胞中诱导严重缺氧，甚至是那些靠近血管的肿瘤细胞。股动脉结扎术的有效性得到了股动脉结扎和截肢之间三天内原发肿瘤生长的完全抑制的支持。组织病理学分析显示，术后 3 天收获的股动脉结扎治疗的原发性肿瘤大面积坏死。

然而，肿瘤组织内存在一组活的肿瘤细胞，位于靠近脉管系统的肿瘤边缘。这些剩余的活肿瘤细胞具有高度侵袭性，它们的大量内渗证明了这一点。血管腔内的许多细胞是 Hypoxyprobe-1 阳性，表明股动脉结扎后缺氧的细胞可能已经开始血管浸润。

在这些实验中，缺氧显着增加了转移的频率和多重性，通常在携带对照肿瘤的小鼠中未受影响的位置观察到。一旦掌握，每只动物都可以在 30 分钟内完成每个外科手术，包括准备、麻醉和恢复。整个实验的长度取决于所使用的细胞系及其生长和转移速率。

MRI 和安乐死时间表根据转移瘤的潜伏期而变化，必须在试点实验中为每个单独的细胞系建立。在尝试此程序时，重要的是要记住在手术后保持适当的疼痛管理和动物监测。如果手术完美执行，则不应观察到与手术相关的严重不良反应或死亡。

在此程序之后，可以对来自对照和缺氧原发性肿瘤及其相应转移的组织和细胞进行进一步分析，包括用于确定缺氧诱导转移机制的全局基因表达谱。该技术可用于癌症转移领域的研究人员，直接测试肿瘤缺氧对疾病播散的影响。虽然这里我们专注于尤文肉瘤，但类似的方法可以应用于其他肿瘤。

看完这个视频后，你应该对如何创建肿瘤缺氧的动物模型以及如何在体内和体外监测产生的转移有很好的了解。