可视化Stromule频率与荧光显微镜

该程序的总体目标是使用活细胞共聚焦荧光显微镜在叶片内可视化和确定基质频率，以及使用从叶片中提取的叶绿体在体外可视化基质。这些实验方法可以通过发现基质的功能来帮助回答植物细胞生物学和叶绿体研究中的关键问题。这些技术的主要优点是它们产生可重复和稳健的数据，即使是这些高动态的叶绿体结构。

我们之所以有叶绿体分离研究的想法，是因为一些研究表明，基质的形成需要胞质结构（如细胞骨架）才能形成。所以我们决定混合细胞，看看是否还会形成基质。要制备叶子样品，首先使用非常锋利的剃须刀片切下一小段 Nicotiana benthamiana 叶子。

切开叶子切片后，立即将其浸入装满水的 5 毫升注射器中。然后，从注射器中抽出空气，并在拉动柱塞之前用手指盖住注射器孔口进行真空。轻轻松开柱塞，以免损坏叶片截面。

然后重复空气去除两到三次，或直到空气被去除，叶子看起来是深绿色的。在载玻片上加入一滴水，然后将叶子部分放在水滴上。然后在叶子的顶部再滴一滴水，并添加盖玻片。

如果有任何气泡，请轻轻敲击盖玻片，直到它们被去除。使用透射光和 20 倍物镜，聚焦在叶切片中心附近的视野上，同时可视化多个叶绿体。保存带有透射光的图像，以便以后必要时可以区分细胞类型。

然后切换到激光照明，使用适合所用荧光团的激发和发射滤光片，并保存另一张图像。使用显微镜软件，选择 GFP 通道，然后单击以将针孔孔径调整到一个通风单位。选择激光扫描以开始可视化样品，然后单击 GFP 通道和检测器增益以最小化激光功率，同时仍能清晰地显示频闪。

接下来，准备一个 Z 堆栈实验，该实验将通过视野中的叶子表皮收集一系列图像。根据需要调整扫描速度和图像分辨率，以确保快速收集 Z 堆栈。然后保存 Z 堆栈以供以后分析。

使用图像 J，使用软件中的最大强度将 Z 堆栈合并为单个图像。然后识别并手动计数图像中的所有叶绿体。对于每个叶绿体，目视确定是否在合并的 Z 堆栈图像中看到一个或多个从叶绿体延伸的频闪。

要提取完整的叶绿体，请使用以下试剂制备冷提取缓冲液。然后，用 NaOH 和 HCl 将 pH 值调节至 6.9，并在使用前冷藏。准备分离缓冲液，并将 pH 值调节至 7.6。

如果叶子不表达基因编码的基质荧光基团，请制备羧基荧光素二乙酸酯或 CFDA 溶液。要分离叶绿体，请从几株植物中取出大约 5 到 10 克叶子，然后用冷水短暂冲洗。然后立即将叶子转移到 50 毫升冷提取缓冲液中。

使用几个短脉冲的搅拌机，研磨叶子，然后通过两到三层粗棉布过滤混合物以去除叶子碎屑。将提取的叶绿体分成两个 50 mL离心管，并以 750 x g 的离心速度离心 1 分钟。弃去上清液，使用 10 毫分离缓冲液重悬绿色叶绿体。

然后再次以 750 x g 离心 1 分钟，弃去上清液，并使用分离缓冲液重新悬浮叶绿体，直至最终体积为 5 mL。如果叶绿体来自表达质体靶向荧光蛋白的转基因植物，则将 20 微升叶绿体转移到载玻片上并添加盖玻片。然后进行显微镜检查。

为了对不表达质体靶向荧光蛋白的植物的叶绿体进行染色，在分离缓冲液中向 5 毫升叶绿体中加入 5 微升 50 毫摩尔 CFDA 原液。让叶绿体孵育 5 分钟后，将一小份等分试样转移到载玻片上，添加盖玻片并进行显微镜检查。最后，使用 FITC 或 GFP 滤光片组和 20 倍物镜同时可视化多个叶绿体。

或者一个更高的目标，即可视化单个分离的叶绿体。此处显示了显示年轻 N.Benthamiana 幼苗体内 GFP 口频率的合并堆栈。在此面板中，图像经过去饱和和反转，使基质显示为黑色。

叶绿体被标记为没有基质，或至少有一个基质。在观察到的 87 个表皮叶绿体中，有 33 个有基质，在该叶子中的频率为 37.9%。该图代表了对来自 23， 000 种不同植物的单片叶子的超过 21， 000 个叶绿体和数百个细胞的分析。

白天的平均 stromule 频率为 20.8 正负 1.8%，夜间平均 stromule 频率为 12.8 正负 0.9%，表明白天频率明显更高，由 Welch 的 T 检验确定。在该图中，从表达质体靶向 GFP 的本氏猪笼草中分离后，或使用 CFDA 对本氏猪笼草或油曲菠菜的叶绿体进行染色后，在体外观察到叶绿体基质。在对基质进行活细胞成像时，重要的是快速工作，并尽可能少地纵植物组织。

在此程序之后，可以使用其他方法（如基因沉默或化学处理）来发现参与基质形成和功能的其他分子参与者或途径。植物细胞生物学和植物免疫学的研究人员已使用该技术来研究基质在细胞信号通路和植物对病原体的反应中的作用。看完这个视频后，你应该对如何计算叶子中的基质频率，以及如何观察提取的叶绿体中的基质有一个很好的了解。

请记住，为扫描电子共聚焦显微镜供电的激光器和电压可能非常危险，因此了解使用此设备的系统要求非常重要。