Name: 缺血性中风和缺血再灌注小鼠的诱导使用梗塞区的中心动脉闭塞技术和可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 了解使用大脑中动脉闭塞技术在小鼠中诱导缺血性中风和缺血再灌注的方法。该技术保留颈外动脉完整，便于直接向受影响半球输注治疗药物，为中风机制和治疗研究提供可靠的动物模型。

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我们感谢陈磊博士（纽约西奈山医学院）首次在我们的实验室中建立了该模型。本研究部分由以下项目资助：HL126559、DA039576、MH098891、MH63022、MH072567、DA027569 和 NSC 2015/17/B/NZ7/02985。卢克·贝尔特兰博士的部分支持来自美国心脏协会的博士后奖学金（16POST31170002）。

所有实验程序均经迈阿密大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南要求。&#160;必须使用无菌器械并采用无菌技术。
1. 准备阻塞缝合线
<ol>
	<li>对于体重在 20 - 25 g 之间的小鼠，使用直径为 0.21 mm 的缝合线；对于体重在 25 - 35 g 之间的小鼠，使用直径为 0.23 mm 的缝合线。MCAO 手术中缝合线类型的选择取决于动物体重。</li>
	<li>使用银色笔从硅胶包被端开始，在缝合线上 9 mm 处做标记，作为插入长度的参考指引。</li>
</ol>
2. 手术准备
<ol>
	<li>使用实验室麻醉系统，将异氟烷与氧气混合，对小鼠进行麻醉。在商用麻醉机上设置异氟烷浓度为5，氧气流速为2（参见材料表）。将动物转移至手术台面，并通过鼻罩维持麻醉状态（异氟烷设置为1.5–2.5，氧气流速为2）。
	<ol>
		<li>确保小鼠呼吸频率维持在每秒1–2次，无喘息现象。同时确认动物无胡须刺激反应及足底反射（脚趾夹捏反应）。手术期间应至少每5分钟监测一次呼吸频率和呼吸努力程度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌棉签在每只眼睛表面滴加一滴眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。或者，也可从无菌药用软管中挤出眼用软膏涂抹于眼部。</li>
	<li>将动物翻转为仰卧位，剃除手术切口区域的毛发。随后，依次使用70%乙醇、氯己定对术区进行彻底消毒，最后再用70%乙醇擦拭一遍。&#160;将动物置于体视显微镜下的温热手术台面上。 </li>
</ol>
3. 颈总动脉及其内、外分支的解剖
<ol>
	<li>使用手术剪和镊子，在颈部正中做一浅表切口，从胸骨上方至下颌下方（约 3 - 4 cm）。手术区域周围应铺手术巾，以防止器械接触非无菌表面。本视频中省略了手术巾，以便拍摄。</li>
	<li>用镊子仔细分离脂肪和结缔组织，暴露气管。组织应自然地向两侧分开。</li>
	<li>将一个枕头（圆形物体，直径约 0.5 cm）置于小鼠颈部背面，以伸展颈部，进一步暴露手术区域。</li>
	<li>使用组织牵开器或牵开钩打开切口。</li>
	<li>在气管左侧，用镊子小心分离结缔组织，暴露左侧颈总动脉（CCA）。注意避免损伤与颈总动脉伴行的神经和主要静脉。</li>
	<li>继续暴露颈总动脉，注意将其从下方组织中分离，并暴露大脑中动脉（ICA）与大脑外动脉（ECA）分叉处的上方 &#34;Y&#34; 形分支。为便于分离颈总动脉，可将弯头镊子插入颈总动脉下方，穿透结缔组织，然后缓慢张开镊子。</li>
</ol>
4. 大脑中动脉阻塞缝合插入前的CCA准备
<ol>
	<li>在颈总动脉（CCA）下方插入约4 cm长的三段尼龙缝线。确保颈总动脉未发生扭转，否则将极大增加缝线插入的难度。</li>
	<li>在尽可能低的位置，使用永久结结扎最下方的缝线。</li>
	<li>在颈内动脉（ICA）/颈外动脉（ECA）分叉处稍下方，使用可拆卸滑结结扎上方的缝线。</li>
	<li>使用可拆卸滑结结扎中间的缝线，但保持其充分敞开。必须留出足够空间，以免妨碍后续缝线的插入。</li>
	<li>使用显微剪刀在底部与中间缝线之间的颈总动脉上做切口。切口大小为0.2 mm，并应靠近底部缝线处进行。</li>
</ol>
5. 大脑中动脉闭塞
<ol>
	<li>使用镊子将MCAO线插入颈总动脉（CCA）切口，引导其向上至顶端。此步骤应在步骤4.5完成后迅速进行，以防止颈总动脉切口处发生凝血和闭合。若发现线材插入受阻，可用镊子尖端重新打开切口。</li>
	<li>使用滑结轻轻结扎MCAO线硅胶部分的中段缝线，以限制其周围血流，但结扎应足够松动，以允许MCAO线自由移动。</li>
	<li>小心解开上端缝线，确保MCAO线不会滑出。</li>
	<li>将MCAO线沿颈内动脉（ICA）插入数毫米，然后以与步骤5.2相同的方式重新结扎上端缝线。</li>
	<li>引导MCAO线至闭塞部位。成功插入的标志包括颈总动脉切口处回流血液量较少，且银色9 mm标记位于颈总动脉切口与颈内动脉/颈外动脉（ICA/ECA）分叉之间。可进一步通过监测手段（如激光多普勒血流监测系统15,16）确认闭塞是否成功。 
	注意：闭塞侧大脑中动脉区域血流量下降90%表明闭塞成功。</li>
	<li>成功闭塞后，将中段和上端缝线牢固结扎。若进行假手术操作，则不重新结扎缝线，而应立即跳转至步骤7.3。</li>
</ol>
6. 切口关闭与术后护理
<ol>
	<li>将缝线埋入切口区域。</li>
	<li>移除牵开器或组织钩及垫枕。</li>
	<li>使用无菌生理盐水和棉签清洁缝合区域。</li>
	<li>使用尼龙缝线/缝针和镊子关闭切口。</li>
	<li>给予抗炎药物（例如，卡洛芬 10 mg/kg，皮下注射）和镇痛药物（例如，丁丙诺啡 0.1 mg/kg，皮下注射，每日两次），以缓解术后不适。将小鼠置于放置在加热垫上的笼子中，以防止低体温，并提供自由饮水和软化食物。</li>
	<li>监测动物恢复情况（5–10 分钟）以及中风迹象。症状可能从轻度侧瘫和转圈行为，到对侧腹侧严重收缩及翻滚不等。若干评估指标详见讨论部分。&#160;出现呼吸困难或严重惊厥症状的动物应实施安乐死。</li>
	<li>根据缺血再灌注实验方案，将MCAO缝线留置30分钟至120分钟或更长时间。&#160;缩短阻塞时间可降低死亡率。</li>
	<li>对于永久性阻塞模型，将MCAO缝线留置24小时，但预期会出现显著的死亡率。经过该时间后，进入步骤7。
	<ol>
		<li>若使用永久性阻塞模型，将小鼠保留在笼中直至实验终点。此时取出缝线（步骤7.1至7.8）。该操作也可在安乐死后进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 再灌注
<ol>
	<li>再次麻醉动物（遵循 2.1 中的说明），并拆除伤口缝合线。</li>
	<li>使用镊子和组织分离器重新打开切口，暴露颈总动脉（CCA）。</li>
	<li>小心拆除上方的缝合线，并轻柔地牵拉MCAO缝合线，直至硅胶涂层部分位于中间结处。</li>
	<li>重新打紧上方的结，以防止血液流过缝合线（无需打成活结）。</li>
	<li>小心解开中间的结，并将缝合线拉过上方的结，但仍保留在颈总动脉（CCA）内。</li>
	<li>紧紧扎紧上方的结，以阻断动脉血流。</li>
	<li>完全抽出MCAO缝合线，并紧密扎紧中间的结。</li>
	<li>MCAO缝合线可重复使用多次。每次使用后，需用无菌纱布蘸取70%乙醇小心清洁缝合线，去除污染物（e.g.，血液或组织）。随后，将缝合线放入灭菌袋中进行灭菌处理。</li>
	<li>重复步骤 6.1 - 6.4，并监测动物恢复情况。</li>
</ol>
8. 组织分析
<ol>
	<li>为了监测卒中体积，解剖取出脑组织。
	<ol>
		<li>采用两步法处死小鼠。首先，使动物暴露于过量异氟烷，直至呼吸停止。&#160;若进行TTC染色，应立即断头并进行脑组织提取；若需进行脑切片（例如，用于免疫染色分析），则在断头前通过心脏穿刺进行灌注。&#160;</li>
		<li>在颅底处切断头部，并从颈部切口沿颅骨顶部剪开至两眼之间。暴露颅骨后，从颅底开始沿两侧剪开颅骨，直至眼眶部位。剪切时应沿颅骨较宽的部分进行。注意避免剪得过深，以防损伤脑组织。</li>
		<li>随后，剪开两个眼眶之间的颅骨部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子轻轻抬起颅骨顶部以暴露脑组织。应仅有轻微阻力。若抬起困难，可能是颅骨切口不完全。使用钝头弯镊轻柔地撬出脑组织。脑组织可能仍通过数条神经与周围组织相连。操作时应缓慢进行，逐步分离这些连接结构。</li>
	<li>将新鲜脑组织置于1 mm脑切片模具中，加入数滴PBS，使用剃须刀片或冷冻切片机刀片沿模具槽切片。</li>
	<li>将脑组织转移至100 mm培养皿中，加入染色液（2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 [TTC] 溶于PBS中），使液体覆盖皿底。使用两把镊子将所有脑切片（前面朝下）分开，并按顺序放置于培养皿底部。 
	注意：染色后，存活组织呈红色，而坏死组织保持白色。将染色液预热至37 °C可加快染色速度。卒中区域（白色）最早可在卒中后90分钟显现，并可持续可见超过7天。成像时应同时放置标尺，以便计算卒中体积。</li>
	<li>对解剖获得的脑组织进行后续处理，用于切片、免疫染色、蛋白质提取或多种其他实验操作17,18,19。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何竞争或利益冲突。

成功应用所描述的MCAO方法在很大程度上依赖于对脑血流解剖结构的理解。由于缺乏直接的视觉提示，难以判断缝线放置是否准确，因此在将其用于研究性实验之前，反复练习以熟练掌握该操作至关重要。应分析脑卒中体积以确保结果的一致性。添加激光多普勒系统有助于确定血流是否成功阻断，并应定期使用以确保操作正确执行。通过调整动脉的位置，可帮助将MCAO缝线引导至阻塞部位。为协助引导缝线进入大脑中动脉（MCA），当缝线刚通过颈外动脉（ECA）与颈内动脉（ICA）分叉处时，可用镊子轻压分叉点上方约2-3 mm处的ICA，以引导缝线向左/向下移动，防止其误入翼腭动脉。此外，移动步骤3.3中放置的垫枕或将下方结向上并向右牵拉，也有助于调整动脉方向，便于插入操作。本方案其余步骤涉及在体视显微镜下进行的显微外科操作，相对简单明了。根据我们课题组的结果以及他人的报道，该方法的成功率约为80–90%。然而，多种因素可能影响动物存活率，包括体温控制和缝线的选择20,21,22。&#160;...

对脑卒中等心血管疾病的研究依赖于体内模型的应用。为了理解缺血、药物毒性及/或治疗可能产生的影响，有必要采用一种合适、标准化、可靠且可重复的疾病模型，以实现不同治疗组之间的比较研究。在本研究中，我们采用小鼠，因其具有大量可用的转基因品系以及标准化的评估模型。已有研究建立了用于评估实验性缺血性脑卒中后运动与行为功能障碍及其后续恢复情况的评分系统1,2。
目前有多种缺血性脑卒中模型可供选择，例如完全性全脑缺血、不完全性全脑缺血、多灶性脑缺血以及局灶性脑缺血。其中，局灶性脑缺血也是临床上患者中最常见的卒中类型。大多数卒中事件由大脑中动脉（MCA）主干或其附近部位发生栓塞性或血栓性闭塞所引发。基于这些特征，本研究所采用的模型能够较好地模拟人类脑卒中的病因机制，因而所得结果具有高度相关性3。然而，将动物模型中的研究成果转化为人类疾病的治疗手段仍面临诸多挑战。迄今为止，仅有溶栓药物组织型纤溶酶原激活剂被批准用于急性缺血性脑卒中的治疗4。
在小鼠局灶性脑缺血模型中，后循环脑卒中模型和脑静脉血栓形成模型具有高度侵入性，限制了其适用性，并制约了可开展的分析范围。然而，其他技术如栓塞性卒中模型、光化学诱导血栓模型、内皮素-1诱导卒中模型以及经腔内线栓法大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，则可在无此类限制的情况下使用。本方案所描述的技术即为MCAO模型。该模型可稳定诱导局灶性脑缺血，易于实现再灌注，且适用于高通量操作。该模型主要有两种操作方法，分别为Zea-Longa法和Koizumi法。二者在阻塞线插入血管的方式上略有不同。Zea-Longa法通过颈外动脉插入线栓5。本文所采用的技术是在Koizumi法基础上的改良，即通过颈总动脉插入阻塞线栓6。
大脑中动脉闭塞（MCAO）模型已成功用于评估缺血性脑卒中期间发生的各种事件。再灌注后，可观察到脑水肿以及血脑屏障的破坏。神经元死亡的峰值通常出现在24小时；然而，7天后会恢复至基线水平7。在人类中，性别和年龄是决定脑卒中预后的关键变量，这一现象在小鼠和大鼠中同样存在8,9,10。已有多个研究利用MCAO模型来验证治疗手段的有效性11,12,13,14。

<table><tbody><tr><td>0.23 mm MCAO 缝合线</td><td>Doccol</td><td>702345PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>0.21 mm MCAO 缝合线</td><td>Doccol</td><td>702145PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>银色标记笔</td><td>staples</td><td>503205</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Vetequip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine science tool</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>直头手术镊</td><td>Fine science tool</td><td>00108-11</td><td></td></tr><tr><td>弯头手术镊</td><td>Fine science tool</td><td>00109-11</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>Fine science tool</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>尼龙缝合线</td><td>Braintree scintific</td><td>SUT-S 104</td><td></td></tr><tr><td>缝合用缝线</td><td>VWR</td><td>95057-036</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>FisherSci</td><td>50-121-8005</td><td></td></tr><tr><td>脑组织切片模具</td><td>Braintree scintific</td><td>BS-A 5000C</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机刀片</td><td>VWR</td><td>89202-606</td><td></td></tr><tr><td>可选：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Periflux 激光多普勒系统</td><td>Perimed</td><td>Periflux 5000</td><td></td></tr><tr><td>监测单元</td><td>Perimed</td><td>PF 5010 - LDPM</td><td></td></tr></tbody></table>

采用大脑中动脉阻塞技术诱导小鼠缺血性卒中与缺血-再灌注及梗死区域的可视化

Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area

脑血管疾病在全球人群中具有很高的发病率，包括多种类型的疾病，如中风。为了研究中风对组织损伤的影响并评估治疗干预措施的有效性，已开发出多种物种的实验模型。这些模型包括完全性全脑缺血、不完全性全脑缺血、局灶性脑缺血和多灶性脑缺血。本方案所描述的模型基于大脑中动脉闭塞（MCAO），属于局灶性缺血类别。该技术可在大脑半球一个明确定义的区域产生稳定的局灶性缺血，且比其他方法更具微创性。本方案所述操作在小鼠上进行，原因在于存在多种遗传变异品系，且已有大量标准化测试可用于小鼠的行为学和神经功能缺损评估。

阻塞缝合的插入路径如图1所示。MCAO缝合线应沿路径进入阻塞区域，在颈内动脉（ICA）处发生分叉。成功阻塞大脑中动脉（MCA）将导致组织损伤，可通过TTC染色观察到。图2展示了假手术处理动物（图2A）以及60分钟MCAO缺血再灌注动物（在阻塞后90分钟或24小时进行染色，图2B）的染色图像。为确定脑梗死体积，首先使用成像过程中提供的标尺，通过从对侧总脑区面积中减去同侧未梗死区域面积，计算出每张切片的梗死面积。该计算可使用商业软件或开源软件完成。随后，根据切片厚度为1 mm，计算每张切片的梗死体积，并将所有切片的梗死体积相加。此方法可得出每只动物的总梗死体积，进而可在不同动物组别和处理方式之间进行比较。通常情况下，60分钟的阻塞后接23小时的再灌注，在15周龄未经处理的野生型C57BL/6J小鼠中产生的梗死体积约为21 ± 3 mm3。
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我们描述了一种通过使用硅胶包被的缝合线阻塞大脑中动脉来诱导小鼠脑卒中的模型。该方案可用于诱导永久性阻塞，或诱导短暂性缺血后进行再灌注。

脑血管疾病在全球人群中具有很高的发病率，包括多种类型的疾病，如中风。为了研究……的影响，

该手术方法的总体目标是在保留大脑中动脉完整的情况下，稳定且可靠地诱导缺血性脑卒中。该技术有助于回答脑卒中研究领域中的一些关键问题，例如治疗手段对脑卒中严重程度的影响。该技术的主要优势在于，脑卒中诱导后，大脑中动脉仍保持通畅，可用于直接向受损半球灌注治疗药物。将用异氟烷麻醉的小鼠放置在准备好的手术台面上，并连接鼻罩以输送混有氧气的异氟烷。确保呼吸频率维持在每秒一次至两次，且无喘息现象。此外，需确认动物对胡须刺激或足底反射无反应。使用无菌棉签在每只眼睛上涂抹一滴眼用润滑剂，以防止在手术过程中眼睛干燥。剃除切口区域的毛发后，使用70%乙醇和基于氯己定的溶液彻底消毒手术区域。将动物置于立体显微镜下的温暖手术台面上。接下来，使用手术剪和镊子，从胸骨上方至下颌下方沿颈部正中线做一浅层切口。用镊子仔细分离脂肪组织和结缔组织，以暴露气管。组织应自然地向两侧分开。然后在颈部后方放置一个枕头或其它直径约0.5厘米的圆形物体，以伸展颈部并进一步暴露手术区域。使用组织牵开器或牵开钩打开切口。随后在气管左侧，小心地用镊子分离结缔组织，暴露左侧颈总动脉，同时避免损伤附近的神经和主要静脉。接下来，将弯头镊子插入颈总动脉（CCA）下方，刺穿结缔组织，然后缓慢张开镊子以松解颈总动脉。将颈总动脉与其下方组织分离，暴露大脑中动脉和大脑外动脉的上方Y形分支。颈总动脉暴露后，在其下方穿入三段尼龙缝合线。确保CCA没有扭曲，否则会极大地增加缝线插入的难度。然后在尽可能低的位置，使用永久结缝合底部缝线。在ICA和ECA分叉下方不远处，用可拆卸的滑结缝合顶部缝线。接下来，使用可拆卸的滑结绑扎中间的缝线，但保持其完全张开。然后，用显微解剖弹簧剪刀在颈总动脉（CCA）下端缝线与中间缝线之间靠近下端缝线处做一个0.2毫米的切口。用镊子将MCAO缝线插入颈总动脉切口，并引导其向上端缝线方向推进。然后轻轻收紧颈总动脉（CCA）上中间缝线的滑结，使其限制大脑中动脉阻塞（MCAO）缝线周围的血流，但又足够松弛，以允许 MCAO 缝线自由移动。现在小心地解开上方的缝线，确保 MCAO 缝线不会滑出。将 MCAO 缝线向颈内动脉（ICA）内插入数毫米，然后像之前一样用滑结重新结扎上方的缝线。接下来，将MCAO缝线引导至闭塞部位，首先将其经ECA远端插入ICA，然后确保缝线保持在ICA内，绕过蝶腭动脉。若颈总动脉（CCA）切口处几乎没有血液反流，且银色9毫米标记位于CCA切口与ICA和ECA分叉之间，则表明插入成功。成功闭塞后，紧密结扎中段和上段缝线，然后将缝线埋入切口区域。移除牵开器或组织钩以及垫枕后，使用蘸有无菌生理盐水的棉签清洁缝合区域。然后用尼龙缝线缝合皮肤。将小鼠置于放置在加热垫上的洁净笼子中，以防止低体温，并给予自由饮水和软质食物。至少观察动物 5 到 10 分钟，监测其是否出现中风迹象。根据缺血再灌注实验方案，将大脑中动脉阻塞（MCAO）缝线保留 30 分钟至 120 分钟或更长时间。按照之前的方法对动物进行麻醉，并拆除伤口缝合线后，使用镊子和组织分离器重新打开切口，暴露颈总动脉（CCA）。然后小心拆除上方的缝线，并轻轻牵拉MCAO缝线，直至硅胶包被部分位于中间结扎处。重新打上方结扎结，以防止血液流过MCAO缝线。接着小心松开中间结扎结，并将MCAO缝线从上方结扎结处拉出，同时保持其位于颈总动脉（CCA）内。紧密结扎顶端结以阻断动脉血流。随后完全拔出MCAO缝线，并紧密结扎中间结。缝合切口，并按之前方法进行术后护理。该示意图以蓝色显示了本视频所演示操作导致的梗阻区域。手术区域位于图的底部，由椭圆形标示，缝合位置以黑色线条表示。以下图像显示了脑切片的TTC染色结果。该图像显示了假手术插入后的典型染色结果。此图像代表了60分钟MCAO后90分钟再灌注所导致的组织损伤情况。在60分钟MCAO后24小时再灌注时，可观察到更严重的组织损伤。对神经元标志物 MAP2 进行免疫荧光染色，可清晰显示右侧图像中经 60 分钟阻断后又进行 23 小时再灌注所导致的神经元丢失。通过 GFAP 免疫荧光染色可观察到星形胶质增生。在右侧图像中，星形胶质细胞主要集中于缺血再灌注脑组织损伤区域的邻近部位，而在假手术对照组中则呈现出弥散性的染色模式。在进行该操作时，重要的是要监测动物的健康状况和闭塞时间。操作完成后，可采用其他技术，如异常行为分析和免疫荧光，以进一步探讨组织损伤与修复的相关问题。

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