Name: 结肠-26癌荷瘤小鼠为癌症恶病质的研究模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习使用Colon-26荷瘤小鼠模型研究癌症恶病质的方法。该模型可重现肿瘤诱导的肌肉萎缩与代谢异常，为探索肌肉消耗机制及潜在治疗策略提供可靠的实验平台。

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我们感谢 Richard Lieber 和 Shannon Bremner 提供的 ImageJ 宏程序及使用说明。在托马斯杰斐逊大学期间，本工作得到了宾夕法尼亚州卫生部 CURE 拨款 TJU No. 080-37038-AI0801 的支持。此后，本研究得到了美国国立卫生研究院向 AB 提供的资助（R21CA190028），以及向 TAZ 提供的来自美国国立卫生研究院（R01CA122596、R01CA194593）、IU 西蒙癌症中心、Lustgarten 基金会、Lilly 基金会有限公司和 IUPUI 胰腺标志性中心的资助。

伦理声明：所描述的所有研究均经托马斯杰斐逊大学和印第安纳大学医学院的机构动物护理和使用委员会批准。
1. C26 细胞的生长与制备
<ol>
	<li>获取C26结肠癌细胞（俄亥俄州立大学医学中心（OSUMC））并配制完全培养基（即， 含10%胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠、1%谷氨酰胺和1%链霉素/青霉素的高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） 
	注意：为了提高不同实验间的可重复性，建议尽可能使用低代次的C26细胞。</li>
	<li>使用商用细胞计数仪将50,000个细胞/cm²接种于培养板2 在含有完全培养基的培养瓶中孵育，置于37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养。2 直至亚融合状态。避免高密度培养，以防细胞分化及表型漂移。</li>
	<li>首次传代后，接种足够数量的细胞以用于计划数量的动物移植。在细胞移植当天，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液按每平方厘米0.02 ml的量对细胞进行胰蛋白酶消化解离2，通过每毫升胰蛋白酶加入至少3 ml新鲜培养基来中和胰蛋白酶，测定细胞浓度（细胞数/ml），并重悬实验所需数量的细胞（1 × 106 每只小鼠的细胞数）置于无菌 PBS 中。 
	注意：C26细胞在密度约为500,000个细胞/cm²时达到汇合状态2.</li>
</ol>
2. 小鼠
<ol>
	<li>将成年CD2F1小鼠（至少8周龄）随机分为若干组（通常为对照组和荷瘤组），每组至少n = 6只。 
	注：C26肿瘤也可在Balb/c小鼠中生长。然而，根据我们的经验，CD2F1小鼠是该特定肿瘤模型更通用且经济的宿主。此外，类似于临床情况以及在其他癌症相关肌肉消耗实验模型中报道的结果14-16，C26恶病质反应中的性别差异也可能被观察到17（参见表1）。</li>
	<li>通过吸入（氧气中含3%异氟烷）对小鼠进行麻醉。仅在完成肿瘤接种所需时间内维持麻醉状态。确保小鼠置于加热垫上，以防止体温流失。在开始肿瘤注射前，轻轻夹捏后肢脚趾以确认麻醉效果。 
	注：由于该操作持续时间较短（通常仅数秒），无需使用兽用眼膏。出于同样原因，接受假手术的对照组动物预计不会出现体重下降。</li>
	<li>使用无菌1 ml胰岛素注射器（配备26号针头），迅速将含有肿瘤细胞的溶液250 μl皮下注射至小鼠肩胛间区脂肪垫内。 
	注：对照组动物将在肩胛间区脂肪垫内注射250 µl无菌生理盐水。</li>
	<li>将动物放回笼中。至少每15分钟直接观察一次，直至其能够对轻柔操作产生反应并恢复翻正反射。 
	注：切勿让小鼠无人看管，并将其安置在含有固体垫料的温暖恢复笼中。此外，在小鼠完全从麻醉中恢复之前，不得将其送回动物房。通常情况下，除非研究人员需要评估个体摄食量，否则无需单独饲养。若需评估且无法使用自动化代谢笼，则必须手动记录食物消耗情况，建议每日同一时间进行。</li>
	<li>每日检查小鼠并记录其体重。 
	注：记录体况评分和家笼行为可区分恶病质程度和疾病相关行为变化，这对治疗研究具有重要意义18。</li>
</ol>
3. 安乐死与采血
<ol>
	<li>当荷瘤小鼠相对于对照组的体重下降达到5%、10%或15%（分别对应轻度、中度和重度恶病质）时，与初始体重相比，实施安乐死。 
	注：典型实验通常持续至某一组体重下降达到10%，此时对所有组实施安乐死。体重下降的评估应包含肿瘤在内的整体体重测量。</li>
	<li>将小鼠置于异氟烷全身麻醉（氧气中浓度3%）下，通过心脏穿刺采集血液（约1 - 1.5 ml）。</li>
	<li>将血液收集至含K2-EDTA（18 mg）的空管中，并立即置于冰上。离心血液（4 °C下2,000 × g离心15分钟），收集血浆/血清。</li>
	<li>通过颈椎脱位法处死小鼠，随后进行组织切除和器官采集。</li>
</ol>
4. 组织和器官切除
注意：若需将组织用于生物化学或分子生物学检测，应计划称量每个器官和组织，并立即将组织片段放入预先标记的冻存管中。在液氮中速冻后，于 -80 °C 保存。
<ol>
	<li>为避免组织样本被毛发污染，用70%乙醇喷洒整个动物体表。</li>
	<li>将小鼠仰卧置于解剖板上，并通过将足部固定在升高的滴定管夹上，使一个肢体垂直伸展。</li>
	<li>用Dumont镊子夹住下肢皮肤，使用弯头精细剪刀轻轻去除皮肤和筋膜，暴露下肢深层的肌腹。</li>
	<li>通过腓肠肌在股骨后侧的外侧和内侧髁处的起始点及其通过跟腱止于跟骨的位置，辨认后肢后侧的腓肠肌。
	<ol>
		<li>继续切断腓肠肌的跟腱。用Dumont镊子夹住腓肠肌远端，将肌腹向其起点方向牵拉。使用剪刀尽可能靠近股骨处切断肌肉起始点。将肌肉放入培养皿中，立即称重，并在液氮中速冻后存入冻存管。 
		注意：务必避免将比目鱼肌与腓肠肌一同切除。若发生此情况，应小心用镊子轻轻将其剥离去除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>辨认胫骨前肌，其起始于胫骨前外侧面，通过远端肌腱止于内侧楔骨，并进行切除。
	<ol>
		<li>为获得操作杠杆力，用拇指和食指夹住足趾固定足部。将Dumont镊子尖端插入胫骨前肌表层远端肌腱下方，并移动镊子，利用其钝面将胫骨前肌肌腹从下方结缔组织上分离。</li>
		<li>使用精细弯剪切断远端肌腱，然后尽可能靠近胫骨处切断肌肉起始端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从耻骨区开始向上作矢状切口，延伸至剑突区，切至膈肌上方为止，以打开腹腔。 
	注意：切口深度仅需穿透腹壁肌肉层及下方腹膜筋膜即可。</li>
	<li>用钝头镊子夹住肝脏并小心取出，使用精细弯剪分离与肝脏相连的任何血管或结缔组织。注意不要遗留任何肝叶。称重后在液氮中速冻并存入冻存管。</li>
	<li>用钝头镊子移开肠道，暴露脾脏并轻柔取出。用钝头镊子轻轻夹住脾脏，使用精细弯剪的背面或钝侧分离与脾脏相连的任何结缔组织或血管。称重后在液氮中速冻并存入冻存管。</li>
	<li>辨认位于附睾（雄性）或子宫（雌性）旁的性腺脂肪垫。用钝头镊子轻轻夹住附睾脂肪垫，将其从体腔中拉出。使用精细弯剪切除可能附着在脂肪垫上的任何性腺组织。称重后在液氮中速冻并存入冻存管。 
	注意：通常认为该脂肪组织可代表小鼠全身脂肪质量，且在恶病质状态下其重量会下降。其他脂肪垫也可采用类似方法进行识别、分离、切除和称重。</li>
	<li>使用精细弯剪打开动物胸腔。剪除与胸骨两侧缘相连的肋骨，移除胸骨。使用两把镊子分别夹住肋骨两侧，向两侧牵拉以打开胸腔。</li>
	<li>用镊子轻柔牵拉心脏。使用精细弯剪在左心房处切断主动脉，小心摘除心脏。通过将心脏轻压在吸水纸上，确保排空残留血液。称重后在液氮中速冻并存入冻存管。</li>
</ol>
5. 肌肉组织的冷冻与包埋
<ol>
	<li>将装有异戊烷的小型塑料烧杯（50 ml）下半部分浸入液氮中。当异戊烷变得略微黏稠，并在烧杯内壁形成白色固态层时（温度：-160 °C），即可使用。 
	注意：始终使用非&#173;避免使用会产生火花的铜制或铝制手动工具。避免吸入产品蒸气。在通风良好的条件下使用。若处理泄漏且无法或不便于通风时，应佩戴合适的呼吸器。</li>
	<li>将包埋介质涂抹于样品台（软木塞）上，短暂浸入异戊烷（约10秒），使其冷冻。</li>
	<li>处理肌肉 （例如通过肌腱将胫骨前肌或腓肠肌垂直于软木塞固定，以保持肌纤维的取向，并便于进行横切。</li>
	<li>将新鲜肌肉的末端小心地放置在冷冻包埋介质的表面。 
	注意：肌肉组织会粘附。切勿用包埋介质完全包裹肌肉组织。同时，为便于后续测定横截面积，必须保持其垂直方向。</li>
	<li>将固定有肌肉的样品台浸入异戊烷浴中（通常的冷冻时间为 7 - 15 秒，具体取决于样本的大小和组成）。 
	注意：将样本浸入冷冻液的时间不应超过完全冻结所需的时间。冷冻时间过长会导致组织块破裂，而时间过短则会引起冰晶形成。理想的冻结样本呈乳白色、不透明状。</li>
	<li>将标本冷冻后，放入小型塑料袋或标本管（50 ml）中，并立即置于-80 °C超低温冰箱或液氮中保存。</li>
</ol>
6. 原始数据分析
<ol>
	<li>为了控制小鼠个体间体型差异的影响，需根据初始体重（IBW）对最终体重（FBW）、无瘤体重以及 carcass、器官和组织重量（以克为单位）进行标准化处理，并以如下形式表示： &#34;体重/100 mg 理想体重&#34;. 
	注意：或者，部分研究者将肌肉质量归一化为胫骨长度。</li>
	<li>使用数据分析软件，计算归一化体重的均值和标准差。在对照组与C26荷瘤小鼠之间采用非配对Student t检验进行统计分析。 
	注意：结果可相对于体重（理想体重和无肿瘤全身体重）、肿瘤、器官及组织重量进行表示。</li>
</ol>
7. 肌肉切片
<ol>
	<li>将冰冻切片机内腔的工作温度设置为约 -23 °C。</li>
	<li>使标本（先前储存在 -80 °C 条件下）在工作温度下适应平衡（数小时即可）。</li>
	<li>切取标本多个厚度为 8-μm 的切片（优先选择胫骨前肌或腓肠肌），并将切片收集到载玻片上。 
	注意：应在肌肉的肌腹中部区域进行切片。 此外，为保证准确性，切片方向应垂直于肌肉的固定轴。</li>
	<li>将载玻片保留在冰冻切片机腔室内。若后续需进行免疫荧光/免疫组化研究或酶组织化学染色，则切勿使其解冻。</li>
	<li>将载玻片储存于 -80 °C，以备后续分析使用。</li>
</ol>
8. 通过层粘连蛋白免疫荧光评估肌纤维大小（替代方案1）
注意：在评估肌肉形态和横截面积（CSA）时，苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色以及基于免疫荧光（IF）的染色方法均为公认的测定肌纤维大小的方法19。尽管肌肉切片的H&amp;#38;E染色是一种有价值且便捷的形态学分析方法，但使用IF方法14明显更快，且准确性略高于基于H&amp;#38;E的方法。H&amp;#38;E方法的具体步骤如下所述。
<ol>
	<li>从冷冻切片机或-80 °C保存环境中取出组织切片，置于室温下平衡约5至10分钟。 
	注意：为了避免使用小鼠来源的初级抗体可能引起的非特异性结合，建议使用其他物种来源的抗体，或采用市售的 &#34;鼠抗鼠&#34; 免疫检测试剂盒</li>
	<li>将切片浸入预冷的甲醇（-20 °C）中，孵育10分钟。</li>
	<li>室温下用1×PBS缓冲液冲洗切片5分钟。</li>
	<li>吸除 PBS，使用免疫组化专用笔在载玻片上圈出组织切片区域。切勿让切片任何阶段完全干燥。</li>
	<li>在室温下将合适的封闭缓冲液（PBS 中含 5 - 8% FBS 或 PBS 中含 5% 小牛血清）孵育于切片上，持续 1 小时。</li>
	<li>移除封闭缓冲液。</li>
	<li>在湿盒中，将兔抗层粘连蛋白抗体（1:30）或小鼠抗肌营养不良蛋白抗体（1:30）一抗用封闭液稀释后加入组织切片，室温孵育2小时（或4 °C过夜）。</li>
	<li>用1×PBS冲洗切片5分钟。</li>
	<li>移除洗涤缓冲液，并用1×PBS再次洗涤切片5分钟。</li>
	<li>移除洗涤缓冲液，向切片加入适当的荧光标记二抗（用封闭缓冲液按1:1,000稀释），在湿盒中室温孵育1小时。</li>
	<li>去除二抗，用1×PBS冲洗切片5分钟。</li>
	<li>吸除洗涤缓冲液，用1×PBS重复洗涤5分钟。吸除洗涤缓冲液，使用水性封片剂加盖盖玻片覆盖组织切片。</li>
	<li>使用染色切片的数字图像识别肌肉的形态学特征。为此，采用倒置荧光显微镜观察免疫荧光切片（建议使用10X或20X放大倍数的物镜），并配合数字相机和图像采集软件。在每幅数字图像中添加比例尺（建议每块肌肉切片随机选取20–30个视野），以利于横截面积（CSA）的定量分析。图像应以.TIF格式保存，以便与使用ImageJ程序的图像分析软件兼容。</li>
	<li>使用 ImageJ 宏通过内肌膜中荧光二抗的存在来区分结缔组织与收缩组织（肌纤维大小）20. 
	注意：宏和操作说明可向作者 Richard Lieber 和 Shannon Bremner 获取。</li>
	<li>双击桌面上的图标以打开 ImageJ 程序。</li>
	<li>单击以加载 CSA 宏 &#34;插件&#34; 选项卡。向下移动光标以选择 &#34;安装&#34; 单击一次即可选择该选项。</li>
	<li>从保存该文件的文件夹中选择横截面宏并加载，然后单击 &#34;打开&#34;.</li>
	<li>宏打开后，通过点击打开包含比例尺的组织学图像 &#34;文件&#34; 然后 &#34;开放&#34; 从 ImageJ 工具栏中。</li>
	<li>图像打开后，选择 &#34;直线工具&#34; 在 ImageJ 程序中，单击带有直线图标的按钮。</li>
	<li>一旦 &#34;直线工具&#34; 选择后，先在比例尺最左端单击一次，然后在比例尺最右端单击一次。操作正确时，比例尺上应出现一条黄色叠加线。</li>
	<li>确保黄色线条仍覆盖在比例尺上，选择 &#34;分析&#34; 单击 ImageJ 工具栏中的标签一次。</li>
	<li>在 &#34;分析&#34; 标签，向下移动光标并选择 &#34;设置比例尺&#34; 单击即可。</li>
	<li>在 &#34;设置比例尺&#34; 窗口，切勿更改其中的数值 &#34;像素距离&#34; 标尺已知距离输入框中 &#34;已知距离&#34; 盒。更改单位为 &#34;长度单位&#34; 与比例尺单位相对应的框即， 微米 = µm）。最后，选择 &#34;全球&#34; 通过点击左侧的复选框 &#34;全球&#34; 一次。</li>
	<li>关闭 &#34;设置比例尺&#34; 窗口。</li>
	<li>打开要测量的第一幅图像，方法是按下 &#34;O&#34; 键盘上的按钮。观察弹出的窗口，该窗口允许用户在图像保存的文件夹中查找并选择待测量的图像。单击图像一次以选中，然后再次单击 &#34;开放。&#34;</li>
	<li>打开后，应出现一个窗口，用于选择横截面积（CSA）测量值的可接受范围以及圆形度参数。 
	注意：这些设置通常保留默认值。但如果需要更改这些设置，务必确保实验中待测量的每张连续图像的设置值保持一致。</li>
	<li>设置CSA范围和圆度后，观察图像上被红色像素覆盖的区域 &#34;阈值&#34; 窗口。通过滑块调整图像的阈值 &#34;阈值&#34; 窗口，直至肌肉纤维被红色像素准确填充。 
	注意：应尽量获取数量最多且互不接触的纤维；若纤维相互接触，将被识别为一条较大的纤维，后续需进行编辑处理。</li>
	<li>设定阈值后，按下 &#34;1&#34; 使用键盘上的按钮测量肌纤维。</li>
	<li>用黄线圈出单个肌纤维。在图像中逐项检查，移除程序误选的伪影或重叠的纤维。具体操作为：单击选中非纤维结构，然后按 &#34;D&#34; 键盘上的按钮。这将从测量结果中删除它们。</li>
	<li>选择并复制测量数据 &#34;测量值窗口，&#34; 并将它们粘贴到电子表格中以进行进一步分析。 
	注意：所获得的数值也可用于评估纤维分布分析，该参数通常可用于判断肿瘤生长是否促使肌纤维向更小的尺寸方向转变。</li>
	<li>在 ImageJ 中，通过单击关闭所有打开的窗口 &#34;X&#34; 位于窗口的左上角。</li>
	<li>通过按下打开一个待测量的新图像 &#34;O&#34; 重复步骤 8.24 至 8.29。</li>
</ol>
9. 来自H的肌纤维大小评估&amp;#38;E 染色切片（替代方案 2）
<ol>
	<li>将玻璃载玻片放入盛有滤过型 Harris 苏木精染液的 Coplin 罐中，染色 8 分钟。 
	注意：若希望染色较浅，可改用 Mayer 苏木精染液。</li>
	<li>用去离子水冲洗载玻片。</li>
	<li>将载玻片浸入自来水中，最多 5 分钟。</li>
	<li>用去离子水快速冲洗，然后将载玻片置于滤过 1% 伊红溶液中染色不到 2 分钟。 
	注意：若希望染色更深，可在伊红溶液中加入 1–2 滴冰醋酸（浓度不超过 0.01%）。</li>
	<li>开始脱水步骤：将载玻片在 70% 乙醇中冲洗不到 1 分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入 90% 乙醇中 1 分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入 95% 乙醇中 1 分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入 100% 乙醇中 2 分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入二甲苯中 2 分钟，然后转移至另一装有新鲜二甲苯的 Coplin 罐中继续处理 2 分钟。 
	注意：载玻片在二甲苯中存放时间不得超过 1 小时，直至封片前均保存于其中。</li>
	<li>使用 Permount 或其他选择的二甲苯基封片介质，将盖玻片覆盖于肌肉切片上。</li>
	<li>在显微镜下以 20× 放大倍数观察 H&amp;E 染色的玻璃载玻片，并拍摄整个肌肉切片区域的图像。使用明场显微镜、数字相机及图像采集软件获取图像。 
	注意：需在同一放大倍数下拍摄比例尺或测微尺图像，以便确定横截面积（CSA）。同上，每块肌肉切片至少记录 20–30 个随机视野。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件评估肌纤维大小。打开每幅数字图像，按上述方法设定比例尺。使用自由选择工具，用鼠标或为提高效率使用数位板和手写笔沿肌纤维周长描记，每块肌肉至少测量 1,500–2,000 根肌纤维。</li>
</ol>
10. 数据收集与分析
<ol>
	<li>为确定肌纤维大小，需评估平均肌纤维&#34;横截面积&#34;。计算每块肌肉测量结果的均值和标准差（SD），包括横截面积和Feret直径。此外，为评估实验条件是否与肌纤维向更小或更大方向转变相关，需分析&#34;肌纤维分布情况&#34;。</li>
	<li>对两组数据进行非配对t检验，以评估结果的显著性。计算C26小鼠组与对照组所得数值的比值。将数据绘制成图表，显示均值±SD以及频率分布直方图，以直观展示肌纤维尺寸的变化趋势。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尤其是在晚期，结直肠癌常伴随恶病质的发生，这会导致患者预后更差并降低其生活质量。许多研究聚焦于癌症继发性病症的治疗；然而，尽管在此领域已做出诸多努力，目前仍无获批用于癌症恶病质的疗法21。因此，动物模型必须尽可能贴近人类疾病的病理特征，以最大程度实现研究结果的转化。
C26荷瘤小鼠是癌症恶病质研究中常用的实验模型22-24。该模型与人类疾病高度相似，表现出体重、肌肉质量和脂肪质量下降，肌纤维萎缩，以及炎症相关基因和泛素连接酶表达升高，符合显著的蛋白质高分解代谢特征2,5。尽管如此，已有研究报道该模型与癌症患者的数据存在一些差异25,26。事实上，该模型的某些特征可能构成严重局限性，从而限制实验结果的解释，这些特征包括非生理性的肿瘤生长环境（例如，皮下异位移植而非原位植入胃肠道）、相对于其他模型（例如，遗传性模型或原位注射肿瘤模型）较短的实验周期、对IL-6作用的依赖性，以及必须使用CD2F1或Balb/c小鼠。
<p class="jove_conte...

肌肉消耗是多种临床疾病的严重并发症，如癌症、败血症、肝病、肝硬化、心力衰竭和肾功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病以及艾滋病。特别是，至少50%的癌症患者表现出明显的肌肉消耗1。癌症中骨骼肌的丢失是由于骨骼肌蛋白水解系统的过度激活导致蛋白质降解增加和/或蛋白质合成减少所致6。同时伴有明显的脂解作用，导致脂肪组织耗竭。临床上，恶病质与生活质量和生存期缩短相关，据估计，20%至30%的癌症患者死亡原因与恶病质有关7。采用尽可能接近人类疾病的实验模型将具有重要意义。理想的动物模型应具有高度可重复性，并尽可能减少不同治疗手段以及通常与临床状况相关的饮食、性别和遗传背景等不可预测因素的干扰8。迄今为止，癌症恶病质主要通过移植癌细胞或注射致癌物的动物模型进行研究，尽管近年来也开始采用易感癌症的基因修饰小鼠作为新的研究方法。
携带C26癌（也称为结肠-26癌和腺癌）的小鼠是癌症恶病质研究中特征明确且被广泛使用的模型2,5。C26肿瘤的生长主要通过增强脂肪和蛋白质的分解代谢，导致机体体重和肌肉重量下降9。通常，当肿瘤重量占总体重的10%时，骨骼肌重量会减少20–25%，而脂肪的损耗更为显著3,10。随着肿瘤生长，还会出现肝肿大和脾肿大，并伴随急性期反应的激活以及促炎性细胞因子水平的升高3,11。其中，白细胞介素-6（IL-6）在介导C26模型中肌肉萎缩方面发挥关键作用，尽管该细胞因子可能并非恶病质的唯一诱导因素12。升高的IL-6通过激活JAK/STAT3通路引起肌肉萎缩，而抑制这一转录因子则可防止肌肉损耗3,4。
在C26诱导的肌肉萎缩过程中，与许多其他肌肉萎缩状况类似，肌肉质量的丢失主要是由于肌纤维内肌肉蛋白含量减少所致，而非细胞死亡或肌纤维丧失13。在C26恶病质模型中，糖酵解型和氧化型肌纤维的横截面积均向更小的方向偏移2，这也与肌肉力量下降一致5。全球许多研究团队已利用C26模型来发现新的肌肉萎缩介导因子或针对癌症恶病质的具有临床意义的药物。然而，该模型的应用存在多种不同的操作方法，这引发了对数据一致性问题的担忧，并在不同实验条件下造成了可重复性障碍。本文介绍了一种用于癌症恶病质研究的典型C26模型使用方法，可获得标准化且可重复的实验数据。

<table><tbody><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Falcon - Becton Dickinson</td><td>35-5001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>链霉素-青霉素&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>CD2F1 小鼠</td><td>Harlan</td><td>060</td><td></td></tr><tr><td>麻醉装置</td><td>EZ-Anesthesia</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>软木圆盘</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63305</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus 玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>抗层粘连蛋白兔多克隆抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>抗肌营养不良蛋白鼠单克隆抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-D508</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗小鼠 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11062</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗兔 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21211</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS216</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Acros Organics</td><td>422680025</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal-XYL</td><td>Thermo</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Observer.Z1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td> Bamboo 数位板</td><td>Wacom</td><td>CTH-661</td><td></td></tr><tr><td>Mac OS X 版 Prism 7.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mac 2011 版 Excel</td><td>Microsoft Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>IJ1.46</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Microtainer 离心管</td><td>BD</td><td>365873</td><td></td></tr></tbody></table>

结肠-26 癌移植小鼠模型在癌症恶病质研究中的应用

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

癌症恶病质是一种进行性骨骼肌质量和脂肪组织丢失、负氮平衡、厌食、疲劳、炎症以及脂解和蛋白水解系统激活的综合征。患有恶病质的癌症患者对抗肿瘤治疗的反应较差，并且死亡率升高1。为了研究肿瘤生长导致机体和肌肉消耗的分子机制，已建立了多种动物模型。本文介绍一种已被充分表征的癌症恶病质模型的相关方法：携带C26癌细胞的小鼠模型2-4。尽管该模型在恶病质研究中被广泛使用，但由于不同实验室采用的方法存在差异，可能导致结果重复性问题。C26肿瘤的生长会引起显著且进行性的体重和骨骼肌质量下降，同时伴随肌肉横截面积减小和肌力减弱3-5。脂肪组织也会发生丢失。组织消耗与循环中促炎性细胞因子水平升高相关，尤其是白细胞介素-6（IL-6）3，其在很大程度上（但并非完全）介导了C26恶病质的发生。目前普遍认为，C26肿瘤诱导肌肉组织消耗的主要机制是激活骨骼肌中的蛋白水解系统。因此，肌肉特异性泛素连接酶（如atrogin-1/MAFbx和MuRF-1）的表达水平被公认为评估肌肉分解代谢状态的有效指标2。本文详细阐述如何以可重复的方式建立该模型，并如何分离多种组织和器官（包括肝脏、脾脏和心脏）以及脂肪组织和骨骼肌（如腓肠肌、胫前肌和股四头肌）。我们还提供了实用的操作方案，介绍如何进行肌肉组织冷冻、切片及肌纤维大小的定量分析。

C26 肿瘤的生长动力学显示，注射后的前 7 - 8 天存在一个滞后期，随后进入细胞的指数生长期（4 - 5 天）。最终，肿瘤质量可达体重的约 10%（约 2 g；图 1A-B）。在第一阶段，仅能通过触诊定位肿瘤，表现为皮肤上的微小突起。在第二阶段，可在皮下观察到明显的肿块。极少数情况下，肿瘤可能发生溃烂，形成开放性伤口；此时，该小鼠将被排除出实验组，并实施人道安乐死。
在第一阶段，体重无明显变化，但在第二阶段显著下降，降至初始体重的10 - 15%（若仅计算无肿瘤体重，则下降约30%；图1A）。荷瘤小鼠在实验结束时表现出明显的消耗状态，毛发杂乱，体况（BC）评分为118（图1C）。BC1表示严重消瘦的小鼠，其骨骼结构明显可见，椎骨清晰分节。体重下降主要归因于骨骼肌和脂肪组织的萎缩（图1B）。体重...

携带结肠-26（C26）癌细胞的小鼠是癌症恶病质的经典模型。随着肿瘤生长，出现进行性肌肉萎缩，肌肉特异性泛素连接酶过度表达，肌肉横截面积减小。同时也可观察到脂肪减少。恶病质的研究依据肌肉萎缩严重程度随时间推移而加重的情况进行。

癌症恶病质是一种进行性骨骼肌质量和脂肪组织丢失、负氮平衡、厌食、疲劳、炎症等综合症，……

本实验方案的总体目标是以可重复的方式实施 Colon 26 体内模型，并对伴随肿瘤生长而出现的进行性肌肉消耗和肌力减弱进行恰当研究。该模型有助于回答癌症恶病质领域中关于肿瘤诱导的肌肉丢失、肌力下降、肌肉分解代谢增强以及促炎性细胞因子水平升高等关键科学问题。该实验模型的主要优势在于，随着肌肉消耗程度的加重，能够以时间依赖的方式稳定地诱导出符合恶病质表型的一系列变化。将由本实验室的技术员 Rafael Barreto 和 Teresa Zimmer 课题组的博士研究生 Joseph Rupert 演示这些操作步骤。植入 C 26 肿瘤时，使用无菌的 1 毫升胰岛素注射器，配备 26 号针头，迅速将 1 × 10⁶ 个细胞经皮下注射至单只成年 CD2F1 小鼠肩胛间脂肪垫内。肿瘤注射后，将动物放回笼中，并进行监测。每天观察小鼠并记录其体重。当荷瘤小鼠相对于对照组动物的体重下降达到其初始体重的5%、10%或15%时，通过心脏穿刺采集1至1.5毫升血液，并将每份血液样本分别转移至空的18毫克钾EDTA管中。将样本管置于冰上，直至所有血液采集完毕。然后离心样品，在离心结束后收集血浆和血清。为避免进一步污染，用70%乙醇喷洒整个动物体。随后将动物仰卧位放置于解剖台上，并用一个升高的滴定管夹固定一条后肢，使该肢体垂直伸展。使用 Dumont 镊子夹住后肢的浅层皮肤，用弯头精细剪刀轻轻去除皮肤和筋膜，暴露下肢深层的肌腹。通过其在股骨后侧的外侧和内侧髁起始、并通过跟腱止于跟骨的位置，辨认后肢后侧的腓肠肌。用镊子夹住腓肠肌远端，将肌腹向其起点方向牵拉。 然后，使用剪刀在肌肉起点处将其切断，尽可能靠近股骨，并将肌肉转移至已预称重的培养皿中。立即称量培养皿，并将肌肉转移至已预先标记的冻存管中。接下来，通过胫骨前外侧面的起点及其经远端肌腱止于内侧楔骨的位置，辨认胫骨前肌。然后，用拇指和食指握住足部的脚趾，将杜蒙特镊子的尖端立即插入胫骨前肌浅层远端肌腱的下方。移动镊子，使其钝端可用于将胫骨前肌肌腹与下方结缔组织分离，并使用精细弯剪切断远端肌腱。随后，在尽可能靠近胫骨处切断肌肉的起点。当所有肌肉组织采集完毕后，将装有异戊烷的塑料50毫升烧杯下半部分浸入液氮中。当异戊烷变得略微粘稠，且烧杯内壁可见白色固态层时，向样品夹上滴加数滴包埋介质。然后用镊子夹住肌肉的肌腱部位，小心地将新鲜肌肉的一端置于包埋介质上方。将其相对于软木塞垂直持握。然后，在保持肌肉垂直的情况下，将卡盘及附着的肌肉浸入异戊烷浴中7到15秒，直至组织完全冻结。冻结良好的样本将呈现乳白色。然后，将肌肉放入样品管中，立即在负80摄氏度下保存。为了保护RNA和酶的结构以及胫骨前肌样品，必须在肌肉组织提取后尽快进行冷冻。要切片冷冻的肌肉组织，首先将冷冻切片机内腔的工作温度设置为负23摄氏度。将存放于负80摄氏度的标本置于工作温度下静置数

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癌症研究

结肠-26癌荷瘤小鼠为癌症恶病质的研究模型

建立该模型可采用两种技术：将癌细胞悬液注射至盲肠壁，或将皮下肿瘤组织块移植到盲肠。该模型可用于研究结直肠癌的自然进展过程，以及评估针对结直肠癌的新型治疗药物。...

结直肠癌小鼠原位模型

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使用氧化偶氮甲烷（AOM）和硫酸葡聚糖钠（DSS）建立结肠炎相关性癌症模型

本视频介绍了建立患者来源的异位移植结直肠癌小鼠模型的实验方案，用于研究结直肠癌细胞在非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内的进展过程。该小鼠模型有助于理解原发肿瘤的生长特性及转移模式。...

建立结直肠癌PDOX小鼠模型：在小鼠模型中研究结直肠癌的进展

结直肠癌, PDOX模型, 小鼠模型, 肿瘤异种移植, 癌症进展, 原位移植, 患者来源的异种移植, 肿瘤微环境, 转移, 预临床模型

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