小鼠耳蜗特定频率区域带状带突起的形态和功能评估
2019年5月10日
本手稿描述了用于评估正常小鼠带状突触的形态特征和功能状态的实验协议。本模型也适用于噪声诱发和与年龄相关的耳蜗性突触性受限模型。讨论了以往小鼠研究的相关结果。
主要报告是真正强调准确定位罗勒膜的特定频率区域在大多数模型中，其中突触数改变和功能可以分析。使用特定频率区域的耳蜗定位，将频率图与人工图数据结合使用。显微镜提供了对几项研究的洞察。
它支持耳蜗神经病变是听力损失、耳鸣和超粘液之前的主要初始事件的概念。在确认对麻醉的八周大成人 C57 黑色 6J 雄性小鼠的手指捏没有反应后。将鼠标放在 37 摄氏度的热垫上，放在电气和隔音室。
接下来，在头骨顶点处放置一个20毫米28分针记录电极，皮肤下的深度为3毫米。在异形帕罗蒂德区域的参考电极，在测量耳的针脚下面，在反边帕罗蒂德区域的接地电极。将装有两厘米塑料管的封闭式现场扬声器放在鼠标旁边，将尖端安装到外部耳道中。
对于听觉脑干反应（或 ABR 记录），在声压水平从 90 分贝降低至 10 分贝时生成音点，以 5 到 10 分贝的声音压力级别步长。在此步骤中，将放大、筛选和平均响应。在每个频率下，确定 ABR 阈值，即最小声压级别，用于进行可靠的 ABR 录制，并具有一个或多个可区分的波，可以通过目视检查清晰识别。
ABR 录音后，从腹侧露出牛皮，用锋利的剪刀打开牛皮，进入耳蜗。使用精细钳子，去除时间骨骼，切断动脉。然后从椭圆形窗口上取下薄片，并破裂圆形窗膜。
轻轻旋转 13 毫米 27 表针的尖端，在耳蜗的顶点处打一个小孔，然后使用细尖移液器将 4% 的甲醛通过窗户轻轻冲洗到正食空间。接下来，用冷清新的0.1摩尔PBS每次洗涤，冲洗骨头三次，每次洗涤五分钟。接着是骨骼的脱钙，在室温下用 10%EDTA 进行 4 小时，在水平摇床上每分钟旋转 20 次。
在孵化结束时，在解剖显微镜下将一个分切的时骨转移到新鲜的0.1摩尔PBS中。使用 3 和 5 Dumont 钳子和 27 量表针来解剖紫锥、中角和基底耳蜗区域。使用剃须刀刀片沿螺旋韧带进行一小系列切口，并去除气管膜和瑞斯纳的膜。
进一步解剖剩余的听觉上皮，包括螺旋肢体，到单独的耳蜗转整个安装准备。然后使用光学显微镜的 40 倍油目标测量罗勒膜长度，将 250 微米刻度放置在眼片中。它可以沿着内毛细胞的立体体进行调整。
解剖后，将每个耳蜗变成单独的2.5毫升离心管。在0.1%Triton X-100中，在室温下在旋转器上用PBS中10%山羊血清阻断任何非特异性结合，在室温下阻断一小时。在孵育结束时，使用200微升移液器尖端在解剖显微镜下去除溶液。
在旋转器上，在0.1%Triton X-100中，用5%山羊血清和PBS中稀释的原抗体孵育样本。第二天早上，用每次洗涤的0.1摩尔PBS冲洗组织样品三次，五分钟，以去除任何残留的原抗体。然后在旋转器的室温下，在室温下用PBS中5%山羊血清稀释的5%山羊血清中稀释的适当的二次抗体标记标本，在室温下2至3小时。
在孵育结束时，用0.1摩尔PBS洗涤样品三次，并转移样品到含有0.1摩尔PBS的单个35毫米板中。将一滴 DAPI 补充安装介质放在幻灯片上，然后将试样从 PBS 转移到安装介质上。将盖滑的一条边放到每个滑轨上并松开，让盖滑轻轻落下。
然后在四摄氏度的幻灯片箱中干燥幻灯片。要对标本进行成像，请使用带适当激光和 63X 高分辨率油浸透镜的共合显微镜，从每个人工耳蜗转动获取 8 微米共合 Z 堆栈。对于突触朋塔计数，设置具有 0.3 微米步长的 Z 堆栈以跨越内毛细胞的整个长度，确保可以对所有突触朋塔进行成像并合并 Z 堆栈中包含图像的 puncta 以获取 Z 访问投影。
将合并的图像导入适当的图像处理软件程序。将特定频率区域的每个 Z 堆栈中的突触总计计数除以 DAPI 正内毛细胞的数量，以计算每个单元的突触pucta数。在每个特定的频率区域，平均所有突触朋克塔在三个不同微观场的图像，包含9至11个内毛细胞。
为了更好地可视化细胞骨骼结构和突触定位，请使用画笔工具直观地评估单个内毛细胞的突触结构和分布。要检查预突触带和后突触受体贴片的并列，请使用矩形选框工具提取色带周围的体素空间，并使用图像剪贴来隔离各个色带。然后单击图像和图像大小，获取这些微型投影的缩略图数组，这些投影可用于识别配对的突触与孤立功能区。
这个代表性实验中的所有10只小鼠都表现出 ABR 阈值，以响应每个声压级别 25 到 70 分贝的音调爆发，具体取决于刺激的频率。此实验的听力阈值最低为 16 千赫，对应与耳蜗顶点大约 43% 的距离，这表明其他人工耳蜗区域的声学灵敏度显著降低。听觉上皮的整个坐骑被解剖成三块，长度被测量并转换成它们与耳蜗顶点的距离百分比。
使用对数函数计算每个耳蜗转动的罗勒膜上的频率位置。在成年小鼠的正常耳朵中，免疫污染揭示了突触带和谷氨酸受体斑块的并列对。研究内毛细胞的基底膜表面，每个细胞有8到20对。
虽然绝大多数的puntta在正常耳朵中显示为并列对，但孤儿丝带在高放大率下很少被观察到。内毛细胞带突触的数量在 16 千赫区域最高，并且随着距离此位置的距离的增加而显著减少。在这个过程中，最重要的是要记住，必须保证人工耳蜗基膜的完整性。
我们需要强调准确性，直到达到技术熟练程度。按照这个程序，可以进行基因治疗，以回答耳蜗神经病变是否可以通过这个措施修复。此措施是探索耳蜗神经病变的更广泛的技术，如果主要初始事件与有听力损失，耳鸣和超耳塞有关。
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概述
本研究详细介绍了一种分析正常小鼠丝带突触形态和功能特征的协议，适用于噪音诱导和年龄相关的耳蜗突触病模型。它强调了在耳蜗中准确定位特定频率区域以评估突触数量和功能变化的重要性。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经科学
- 耳蜗突触病
- 听觉脑干反应
背景
- 理解丝带突触对于研究听觉过程和听力损失至关重要。
- 耳蜗神经病常常先于耳鸣和过敏等症状出现。
- 现有的方法提供了对耳蜗结构和功能的洞察。
研究目的
- 评估小鼠模型中的丝带突触形态和功能。
- 将发现与现有的耳蜗病症文献进行关联。
- 开发一个可靠的测量听觉反应的协议。
使用的方法
- 本研究采用C57BL/6J小鼠的体内听觉脑干反应（ABR）测量。
- 小鼠经历一系列手术和实验程序以接触耳蜗并测量突触点。
- 组织学技术包括抗体标记和共聚焦显微镜以进行详细成像。
- 关键步骤包括ABR记录、耳蜗解剖和突触计数。
主要结果
- 该协议允许量化内毛细胞中的突触变化。
- 它能够详细可视化突触结构以评估功能。
- 发现在特定频率感兴趣区域存在显著的突触生理变化。
结论
- 本研究展示了一种评估耳蜗丝带突触变化的有效方法。
- 它有助于更好地理解听觉疾病的潜在机制。
- 获得的见解可能有助于听力相关疾病的针对性干预。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding cochlear ribbon synapse integrity is critical for identifying early biomarkers of sensorineural hearing loss and related auditory disorders. This protocol enables frequency-specific assessment of synaptic structure and function, supporting target validation in preclinical models of cochlear synaptopathy. By linking morphological changes to functional auditory readouts, it enhances predictive confidence in de-risking therapeutic interventions for hearing-related indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic density and structural integrity as a functional readout for cochlear neuropathy.
- Operational Value: Provides a standardized method to quantify synaptic puncta per inner hair cell across defined cochlear regions.
- Translational Value: Supports hypothesis testing for gene therapy or pharmacological interventions aimed at rescuing synaptic function.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative synaptic puncta counts that can be normalized to inner hair cell numbers for comparative analysis.
- Reproducibility: Uses confocal imaging and Z-stack projection to ensure consistent visualization and counting of synaptic structures.
- Scalability: Applicable to multiple cochlear turns and frequency regions, enabling regional mapping of synaptic changes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models early events in sensorineural hearing loss where synaptopathy precedes threshold shifts.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of synaptic loss with auditory brainstem response wave I amplitudes to assess functional impact.
- Preclinical Continuity: Supports longitudinal evaluation from discovery through validation stages of therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing a quantifiable, histology-based endpoint that complements functional auditory testing in preclinical studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven evaluation of synaptic alterations in response to genetic, pharmacological, or environmental perturbations.
- Screening: Enables development of standardized assays for synaptic density that support compound screening in ototoxic or noise-exposed models.
- Analytics: Delivers quantitative outputs (synaptic puncta per cell, ABR wave I amplitude) that allow dose-response and genotype-phenotype correlations.
- Translational Research: Bridges structural and functional data to support go/no-go decisions in preclinical advancement of hearing loss therapeutics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing synaptic integrity across diverse models of cochlear neuropathy.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by providing direct evidence of synaptic preservation or loss in vivo.
- Operational Value: Standardizes synaptic evaluation through immunostaining, confocal imaging, and normalized counting protocols.
- Strategic Value: Improves risk-adjusted decision-making by identifying early biomarkers of synaptic dysfunction before hearing threshold changes.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of candidates based on synaptic rescue potential, reducing late-stage failure in auditory indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cochlear dissection, immunostaining, and confocal microscopy for accurate synaptic visualization.
- Dependent on specialized instrumentation including microtomes, cryostats, and high-resolution oil immersion lenses.
- Necessitates standardization across teams for tissue preparation, antibody incubation, and imaging parameters to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cochlear anatomy and frequency mapping when extrapolating data across models or strains.
- Limited by the need for terminal procedures, restricting longitudinal sampling in the same animal.
