果蝇的制备及心功能体内使用光学相干显微镜成像纵向（OCM）

该程序的总体目标是使用光学相干显微镜技术在体内纵向对果蝇的心脏功能进行成像。该方法可以通过提供指标来帮助回答果蝇心脏结构和功能发育领域的关键问题，例如果蝇过程中心脏直径、心率和心脏活动期的变化。该技术的主要优点是光学相干显微镜能够以高空间和时间分辨率对小动物心脏进行无创成像。

由于果蝇和脊椎动物之间存在遗传相似性，这项技术可能有助于揭示人类心脏病的机制以及与心脏发育的关系。该方法也可以应用于其他系统，例如在动物模型中研究或治疗起搏器功能减弱的光遗传学起搏。为本实验生产果蝇时，让生殖亲本果蝇交配并在新鲜小瓶中产卵 8 小时。

因此，产下的一窝卵会发育成年龄相近的果蝇。要安装幼虫进行 OCM 成像，首先用一块双面胶带准备一个干净的面。推出胶带下方残留的气泡。

接下来，使用软刷从小瓶中取出合适大小的幼虫。将幼虫放在干净的纸巾上。用湿润的刷子去除粘在上面的任何食物，然后晾干。

现在，在宽视场显微镜下，确认幼虫的发育阶段。然后，将幼虫的背侧朝上放置以进行安装。然后，将粘性载玻片放到幼虫上，并使用适度的压力将其固定到胶带上。

将已安装的幼虫沿 y 横向放置在 OCM 系统的可调节载物台上，背侧朝上。载物台上的一个小孔使幼虫不与载物台平面接触。从 A5 到 A8 段发现心脏管的宽管腔。使用计算机上的实时图像，找到心管的后部区域并向前移动载物台，直到可以看到 A7 段。

现在，设置图像采集的参数。每个 B 扫描使用 100 个 A 扫描，并使用 100 个 B 扫描。然后，将扫描仪电压设置为在 x 横向上覆盖约 0.28 毫米，并在 y 横向上将其设置为 0 伏。

接下来，用深色布块块样品光束路径，然后单击软件中的开始按钮以获取背景噪声数据以进行背景扣除。要采集横向M型图像，请将参数调整为每个B扫描128次A扫描，并使用4， 096次B扫描。然后，像以前一样重新调整电压，使其在 x 方向上覆盖 0.28 毫米，在 y 方向上覆盖 0 伏特。

然后，在飞心管 A7 段的横向 M 模式下获取图像。在数据保存过程中，用黑布挡住成像光束，以尽量减少光线照射到样品样品上。对心脏进行五次成像，以获得可靠的心脏功能测量值。

要收集三维图像，每个B扫描使用400次A扫描，使用800次B扫描，并在x轴横向上使用1.7毫米的电压，在y轴横向上使用大约4毫米的电压。然后，移动显微镜载物台以观察整个苍蝇并调整焦距以查看清晰的图像。要去除幼虫，请使用湿润的软刷将其转移到装有新鲜食物的新小瓶中，以便继续发育和纵向研究。

在蛹期 PD1 中，心管的宽管腔保持在 A5 至 A8 段。在 PD1 处，努力对 A7 节段进行成像，就像对 L2 和 L3 阶段幼虫所做的那样。PD1 蛹期由白色蛹识别。

这个时间窗口非常适合对早期蛹进行光学成像，因为高透明度导致 OCM 成像的光穿透率更高。如果有食物粘在身上，请用刷子清洁蛹。使用湿刷子，将蛹安装在一个小载玻片上，并保持背侧朝上。

载玻片应适合放入飞管中，以保护动物在自己的腔室中发育。擦干蛹中多余的水，然后将其放在载物台上，蛹朝上，然后像对幼虫所做的那样对 A7 段进行成像。成像后，将载玻片和蛹转移到管中进行连续培养。

在 PD1 阶段之后，从 PD2 开始，在 A1 和 A4 段之间开始形成一个锥形腔。由于蛹变得越来越不透明，成像系统的穿透深度会减小。在 PD2 处，蛹壳变黄，身体不如 PD1 透明。

在 PD3 时，蛹的颜色仍然比 PD2 阶段的颜色深一点。到 PD4 阶段，可以在壳内观察到黑色条纹。一些 PD4 会发育成成人，而另一些会进入 PD5 阶段。

在 PD5 阶段，黑色条纹更加明显。用镊子拿起 PD2 蛹并将其安装在载玻片上。在 OCM 系统上，找到心管的前端，然后向后端移动约 50 微米，找到心管的 A1 段。

请注意，在 PD2 阶段，心脏的锥形腔非常小，可能还没有跳动。如前所述继续进行成像。重复相同的程序在 PD3、PD4 和 PD5 阶段对果蝇进行成像。

首先，将成蝇转移到体积约为 45 毫升的空小瓶中。然后，将棉签浸入麻醉液中，将棉签棒放入药瓶中，棉签尖端位于棉塞正下方。等待 3 分钟。

成年苍蝇将被麻醉两分半钟到三分半钟，具体取决于它的大小。现在用一块双面胶带准备一个载玻片。然后，使用软刷，将麻醉的苍蝇移动到载玻片上，背面朝上。

在宽视场显微镜下，使用镊子分离翅膀并将它们粘在胶带上，从而暴露心脏区域进行成像。现在，使用前面描述的成像技术对心脏的 A1 段进行成像，并在实验结束时牺牲果蝇。使用带有一个 24B-GAL4 驱动程序拷贝的应变蝇进行纵向心脏成像。

在幼虫阶段，心脏管从管腔较宽的后腹部区域 A8 开始，到直径较窄的背段 A1 结束。在 PD2 后期，锥形室开始在 A1 至 A4 段发育。从横向 M 型 OCM 图像中量化苍蝇心率。

奇怪的是，在蛹期，心脏偶尔会停止跳动。总体而言，从幼虫期到蛹期，心跳明显减慢，然后从蛹到成虫期大幅增加。自这一发展以来，这项技术为发育心脏病学领域的研究人员提供了一种新工具，可以探索各种基因对果蝇模型中心脏发育的影响。

在尝试此程序时，重要的是要仔细跟踪果蝇的发育，以便在每个发育阶段创建图像。