Name: 生产，结晶和结构测定℃。难辨通过Microseeding和锌SAD PPEP-1 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 学习利用微晶种技术培养艰难梭菌PPEP-1金属蛋白酶的高质量单晶，用于X射线衍射结构测定。该方法可快速获得适用于结构生物学研究的优质晶体，为药物靶点研究提供重要基础。

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我们感谢瑞士保罗谢勒研究所（Paul-Scherrer-Institute）Villigen 分部瑞士光源（Swiss Light Source）X06DA 光束线的工作人员在同步辐射数据采集过程中提供的支持。我们衷心感谢 Monika Gompert 提供出色的技术支持。本项目得到了科隆大学以及德国研究基金会（German Research Council）资助项目 INST 216/682-1 FUGG 的支持。我们感谢国际研究生院“发育、健康与疾病”（International Graduate School in Development Health and Disease）为 C.P. 提供的博士生奖学金。本研究工作获得了欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号 283570（BioStruct-X）的经费支持。

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作者无任何利益冲突披露。

X射线晶体学仍然是测定蛋白质三维近原子分辨率结构最快且最准确的方法28。然而，该方法需要生长出高度有序的单晶，而这类晶体往往难以获得，且晶体状态本身属于人为条件。尽管如此，将X射线晶体学测定的蛋白质结构与其他方法（尤其是核磁共振，NMR）测定的结构进行比较，通常显示出非常好的一致性。以PPEP-1为例，最近发表的NMR结构29与我们的晶体结构14高度一致，包括S环的流动性也相符。
本方案描述了用于结构研究的N端带His标签的重组PPEP-1蛋白的表达与纯化，以及无标签重组PPEP-1的结晶与结构解析。本案例中单晶难以生长，需采用特殊的微晶接种方法。在下文中，我们将讨论PPEP-1的研究结果，并说明如何调整该方案以适用于其他任何蛋白的表达与结晶。
载体设计与表达的变异
rPPEP-1 表达为N端带His标签的变体（图1A），因为在结晶时，由于His标签可能影...

Clostridium difficile 是医院内抗生素相关性腹泻感染的主要病因之一1。这种革兰氏阳性厌氧细菌通过粪-口途径以其孢子形式传播。例如 BI/NAP1/027 等新型“流行性”或“高毒力”菌株在过去十年中导致北美和欧洲的感染病例数和死亡率急剧上升2。C. difficile 相关疾病（CDAD）是一种危及生命的结肠炎症，具有较高的致死率3。其症状范围从腹泻4到假膜性结肠炎5，以及常导致死亡的中毒性巨结肠6。
由于高致病性菌株具有多重耐药性且复发率高，艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）的治疗较为困难7。目前的治疗方案包括使用抗生素甲硝唑、非达霉素或万古霉素，对于反复复发的病例则采用粪便微生物群移植。迫切需要新的治疗策略8。目前已取得一定进展，针对艰难梭菌（C. difficile）毒素B的治疗性单克隆抗体贝洛托单抗（Bezlotoxumab）9已成功完成III期临床试验，并已向美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）提交上市申请。此外，目前还有多种新型抗生素正处于不同阶段的临床试验中10。
为了开发有效的治疗方法，必须识别新的治疗靶点。最近发现的 C. difficile 蛋白酶脯氨酸-脯氨酸内肽酶-1（PPEP-1；CD2830/Zmp1；E.C. 3.4.24.89）是一个极具前景的靶点，因为敲除菌株中PPEP-1的缺失会降低其毒力 体内艰难梭菌11PPEP-1 是一种分泌型金属蛋白酶12,13 切割两个 C. difficile 其C末端的黏附素13 从而将黏附的细菌从人体肠道上皮释放出来。因此，该过程参与维持细菌固着表型与运动表型之间的平衡 C. difficile为了开发针对PPEP-1的选择性抑制剂，并深入理解其识别底物的机制，必须充分掌握其三维结构的详细信息。我们已解析了PPEP-1单独存在及其与底物肽结合状态下的首个晶体结构。14PPEP-1 是首个已知可特异性切割两个脯氨酸残基之间肽键的蛋白酶15它以双弯曲方式结合底物，并通过位于覆盖蛋白酶活性位点的S环中的一系列脂肪族-芳香族残基网络来稳定底物14这种底物结合模式为PPEP-1所独有，迄今未见于人类蛋白酶中。这使其成为一个极具前景的药物靶点，且抑制剂产生脱靶效应的可能性极低。
未来若要开发并筛选选择性PPEP-1抑制剂，需要大量高纯度且单分散的PPEP-1蛋白。此外，为了确定首批抑制剂的结合模式，还需解析其与PPEP-1的共结晶结构。在我们实验过程中，PPEP-1始终产生重叠生长的晶体。因此，我们建立了一种优化方法，以获得可用于衍射分析的单一高质量PPEP-1晶体。本方案中，我们详细描述了PPEP-114的表达、纯化、结晶及结构解析过程。我们采用在Escherichia coli中进行胞内表达的方式，表达缺失分泌信号序列的PPEP-1变体，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化，并切除纯化标签；接着采用微晶接种法16进入优化筛选，最终通过锌单波长反常散射（zinc-SAD）方法完成结构解析17。该方案可适用于其他蛋白质（e.g. 金属蛋白酶）的制备与结构解析，尤其适用于易形成重叠晶体的蛋白质。应要求，可用于教学目的的质粒DNA（pET28a-NHis-rPPEP-1）及衍射数据可提供使用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;基因/载体/细胞株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a 载体</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>凝血酶可切割的N端His标签</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 菌株 BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H 缺陷型</td></tr><tr><td>针对 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 密码子优化的 PPEP-1 (CD630_28300) 基因</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>custom</td><td>氨基酸 27-220</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消泡剂B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>水性硅油乳液</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>缓冲级</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>任意</td><td></td><td>缓冲级</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>缓冲级</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>甘油 100%</td><td>任意</td><td></td><td>最纯级</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>任意</td><td></td><td>用于晶体储存和低温冷却</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备（通用）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>任意</td><td></td><td>提供 20 &amp;deg;C - 37 &amp;deg;C 的温度</td></tr><tr><td>玻璃器皿</td><td>任意</td><td></td><td>带挡板的锥形瓶（50 ml - 2.8 L）</td></tr><tr><td>大体积培养物离心机</td><td>任意</td><td></td><td>可处理最大 12 L 体积的离心机</td></tr><tr><td>超声破碎仪 Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>或其他任意超声破碎仪/细胞破碎仪</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>任意</td><td></td><td>转速可达 150,000 × g</td></tr><tr><td>NiNTA Superflow 树脂</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>空玻璃 Econo-Column 柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>或其他任意空玻璃或塑料柱</td></tr><tr><td>尺寸排阻色谱柱 HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>色谱系统 &amp;Auml;kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>或其他任意色谱系统</td></tr><tr><td>透析袋 Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>透析袋封口夹</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>超滤装置（浓缩器）10,000 NWCO</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备（晶体学）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低体积移液器 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正向置换移液器 Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>结晶机器人</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔结晶板 TTP IQ，含三个蛋白孔</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>或其他任意96孔结晶板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24孔 CombiClover Junior 板</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Clear 密封胶带</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>硅化玻璃盖玻片</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>商用结晶筛选试剂盒：SaltRx、Index、PEG/Ion、Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>商用结晶筛选试剂盒：Wizard、PACT++、JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT（尼龙环）</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td>环尺寸 0.025 mm - 0.5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap 样品管</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>800 ml 冷冻泡沫杜瓦瓶</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>2 L 冷冻泡沫杜瓦瓶</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>直型样品管夹</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>直型磁性 CrystalWand</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 样品管架</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 颜色编码器 - 白色</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>直头微型镊子</td><td>任意</td><td></td><td>用于操作密封胶带等&lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>针灸针</td><td>任意</td><td></td><td>&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 药店购买</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>任意</td><td></td><td>用于检查结晶板和晶体挂载，放大倍数最高达 160X</td></tr></tbody></table>

蛋白质的制备、结晶与结构测定 c. difficile ppep-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

目前亟需开发新的疗法来应对对人类健康构成重大威胁的Clostridium difficile感染。C. difficile金属蛋白酶PPEP-1是未来开发抑制剂以降低该病原体毒力的潜在靶点。为了进行生物物理和结构表征以及抑制剂筛选，需要大量高纯度且具有活性的蛋白。我们已建立了一种高效生产与纯化PPEP-1的实验方案，利用E. coli作为表达宿主，可获得足够数量和纯度的蛋白，满足结晶及结构解析的需求。此外，通过微晶接种技术，可将严重共晶生长的PPEP-1晶体转化为高度有序、适用于X射线衍射分析的单晶。该方法也可用于其他重组蛋白的制备，以及研究产生共晶现象的其他蛋白质的结构。

rPPEP-1 在多种 E. coli 菌株中均呈现过表达，其中在 E. coli BL21 (DE3) Star 中产量最高（图 1C）。经过第一次 NiNTA 亲和层析后，6xHis 标签可从大部分蛋白中成功切除；在第二次 NiNTA 层析步骤中，未消化的蛋白可与凝血酶消化后的蛋白完全分离（图 1D）。在 S200 16/600 柱上，去标签的 rPPEP-1 以单体形式迁移，偶尔出现前延峰，很可能对应二聚体物种（图 2A）。该蛋白纯度高（图 2B），每升 E. coli 培养液可获得约 50 mg 蛋白。rPPEP-1 在多种条件下均可结晶（图 3），晶体中常含有磷酸盐。所有条件下的晶体均高度重叠生长，因此必须进行晶体优化。图 4 展示了源自商业筛选条件 SaltRx E4 (52)（图 3B-C...

脯氨酰-脯氨酰内肽酶-1（PPEP-1）是一种由人类病原体Clostridium difficile分泌的金属蛋白酶，也是具有前景的药物靶点。本文描述了该蛋白的制备及其结构解析所需的全部方法。

蛋白质的制备、结晶与结构测定 C. difficile PPEP-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

迫切需要开发新的疗法来应对对人类健康构成重大威胁的艰难梭菌感染。艰难梭菌金属蛋白酶 PPEP-1 是一种……

本实验的总体目标是高效培养出可用于单晶衍射分析的重组脯氨酰内肽酶-1（rPPEP-1）蛋白的高质量单晶。若不采用此方法，rPPEP-1 会立即形成严重孪生的晶体，无法适用于X射线衍射分析。该技术的主要优势在于，可在较短时间内使用有限的材料获得大量结构有序且衍射质量良好的晶体，从而实现对 rPPEP-1 的结构解析。该实验步骤采用微晶法，可适用于rPPEP-1及其底物肽复合物的任何成功初始结晶条件。该方法可进行调整，用于制备几乎所有能产生孪生晶体的蛋白质的有序晶体。此外，该方法还可应用于交叉接种实验、蛋白质变异研究，或与小分子的共结晶实验。结晶方法操作过程的可视化演示至关重要，因为即使微小的差异也可能对晶体的衍射质量产生显著影响。采用标准市售筛选试剂盒和结晶机器人，以坐滴法进行结晶试验。首先，使用离心超滤装置将纯化的蛋白质浓缩至每毫升12毫克，在4000 × g 条件下、4 °C 温度下每5分钟进行一次浓缩。每次间隔后混合蛋白质溶液，以防止沉淀和加剧。通过使用25,900 M⁻¹cm⁻¹的消光系数，在280纳米处测定蛋白质浓度。将蛋白质在20摄氏度平衡后，于20摄氏度、16000 × g离心10分钟，以去除所有颗粒和灰尘。进行结晶筛选时，使用预先填充并密封后储存在4摄氏度的结晶板。设置实验时应迅速操作，因为小体积液滴会迅速干燥。如果可能，还应在机器人操作平台周围使用湿度控制舱。将所有结晶板平衡至20摄氏度后，通过移液将蛋白质与储液混合物加入2至4号子孔中进行筛选。液滴体积为300纳升。2号子孔的蛋白质与储液比例为200:100，3号子孔为150:150，4号子孔为100:200。立即密封培养板并将其置于20摄氏度的培养箱中。在设置后的第一周内每天检查培养板，之后每周检查一次。对于底物肽rPPEP-1复合物的共结晶，将rPPEP-1以24毫克/毫升的浓度与七倍摩尔过量的肽溶液按1:1比例混合，肽溶液由溶于Tris缓冲盐水的冻干粉末制备。在20摄氏度下孵育30分钟后，于20摄氏度、16000 × g条件下离心10分钟，以去除所有颗粒和灰尘。采用与未结合的rPPEP-1蛋白相同的微晶接种方法进行结晶。在含有2.4摩尔磷酸氢二铵和0.1摩尔Tris缓冲液（pH 8.5）的条件下，两天后出现了高度共生的rPPEP-1晶体。为了优化初始条件，使用软件计算体积和移液方案，以获得每种2毫升的条件，可进行10次优化筛选。条件包括1.8至2.55摩尔的磷酸氢二铵，以0.15摩尔为步长递增，以及0.1摩尔的trisapseal，pH值从7.5至9.0，以0.5个pH单位为步长递增。使用储备溶液配制包含24种条件的网格筛选。按照移液方案配制各个条件。将每种网格筛选溶液各200微升加入24孔板的孔中，并在20摄氏度下平衡该板。手动设置结晶板。使用3微升的液滴体积，以及2:1、1.5:1.5和1:2的蛋白质与储液比例。此处使用正向置换移液器以避免产生气泡。立即密封培养板。然后将该板置于20摄氏度的培养箱中。1至4天后，在含有2.55 mol/L磷酸氢二铵和0.1 mol/L Tris缓冲液（pH 7.5至9.0）的四个条件下，出现大量相互生长的rPPEP-1晶体，而在其余20个条件下则无晶体形成。在这些条件下进行微晶接种操作，以获得rPPEP-1的单晶。为制备微晶种子原液，首先从一个成功的结晶条件中选取一颗相互生长的单晶。接着，将50微升相应的母液转移至含有一个微小且高度抛光的玻璃珠的1.5毫升离心管中，并取1微升母液滴加到玻璃盖玻片上。使用固定在细针上的尼龙环，挑取晶体并将其转移至玻璃盖玻片上的液滴中。然后将含有晶体的液体转移至离心管中，高速涡旋振荡30秒，确保玻璃珠充分旋转。取晶种储备液，用新制备的相同条件溶液在新的1.5毫升离心管中进行1:1000稀释，并彻底涡旋振荡5秒。接下来，移除覆盖20个条件且含有清晰液滴的板的密封膜。将0.5微升的晶种储备液用移液器加入各孔中。密封培养板并将其置于20摄氏度的培养箱中。采用此微晶接种技术后，在含有1.8至2.4摩尔磷酸铵和0.1摩尔Tris（pH 7.5至9）的不同条件下，数小时至数天内即可出现高质量的单晶。晶体最大尺寸可生长至100至200微米。通过将尼龙环置于晶体上方的密封膜上，并上下调焦，根据所选晶体的最大长度选择最合适尺寸的尼龙环。rPPEP-1晶体的典型最大尺寸约为100至200微米。同时准备好适当的冷冻条件。将泡沫杜瓦瓶中装入液氮。然后将冻存管夹装上冻存管，并在装有液氮的800毫升泡沫杜瓦瓶中预冷。将带有合适标识的冷冻罐架和冷冻套管放入装有液氮的两升泡沫杜瓦瓶中。然后，将适当尺寸的尼龙环固定在磁力棒上。接下来，用锋利的手术刀切开结晶板上的密封胶带，并用镊子将其移除。用移液器吸取一微升冷冻液滴加到盖玻片上。此步骤需特别注意操作速度，因为晶体或悬滴中微量冷冻溶液的干燥可能导致晶体质量波动，甚至完全丧失衍射能力。所有晶体操作步骤均应在体视显微镜下进行。如果晶体粘附在塑料表面，可用针灸针轻轻变形周围的塑料，使晶体从基底上脱离。用装有尼龙环的工具将晶体从液滴中捞出。迅速将晶体转移至冷冻保护剂液滴中，并使其平衡约一秒钟。然后尽快用装有尼龙环的镊子将晶体从液滴中捞出。立即将取出的晶体浸入液氮中进行骤冷。当液氮中尼龙环周围的气泡停止沸腾时，将尼龙环放入样品管中。将小瓶置于冷冻罐支架上。当支架装载六个小瓶后，在支架周围套上冷冻套管。将晶体储存于充满液氮的罐中，直至使用。进行数据收集时，使用夹钳小心地从冷冻罐中取出已安装的晶体，并将其存放在泡沫杜瓦瓶中以运输。将光束挡板和探测器移至停放位置，并将冷冻喷嘴向上移动数毫米。用手指固定住冷冻帽的底座，迅速取下小瓶，然后将冷冻帽底座安装到测角头上。然后将冷冻喷嘴和光束挡板移回原位，并对晶体进行居中。在整个过程中，务必小心避免触碰光束挡板或探测器。接着以0.1度的振荡角度采集180度的数据集，如下所示。图中所示为使用商业结晶筛选试剂盒进行初步筛选所获得的紧密簇生rPPEP-1晶体，结晶条件为1.4摩尔柠檬酸三钠二水合物、0.1摩尔HEPES钠盐，pH 7.5。图中还展示了在60%（体积比）tacsimate、pH 7.0、0.1摩尔BIS-TRIS丙烷、pH 7.0条件下初步筛选获得的晶体。此外，在2.4摩尔磷酸氢二铵、0.1摩尔Tris、pH 8.5条件下也观察到晶体析出。经过微晶接种优化步骤后，多个条件中均获得了单晶，包括2.1摩尔磷酸氢二铵、0.1摩尔Tris、pH 8，以及2.25摩尔磷酸氢二铵、0.1摩尔Tris、pH 8。用尼龙环捞取的晶体大小为100至200微米，显微镜检查显示其具有单一晶格。X射线衍射分析表明，这些晶体确实呈现单一晶格，并能将X射线衍射至接近原子级分辨率。解析重组PPEP-1底物肽复合物的晶体结构，有助于深入了解PPEP-1的底物结合模式。底物肽可在PPEP-1处于开放构象时扩散进入其底物结合区域。随后，随着环的闭合，底物通过氢键以及位于S环上的独特脂肪族-芳香族侧链网络与PPEP-1发生相互作用。底物以一种独特的双重弯曲构象结合，弯曲部位位于sizzle肽键以及P2'至P3'肽键处。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备可用于结构研究的单一晶格、良好衍射的重组PPEP-1晶体。类似的方法也可应用于其他蛋白质，通过调整孵育温度和C储备液稀释比例，获得高度共生长的晶体。由于其多功能性和操作简便，这一简单技术应在每次晶体优化过程中都进行尝试。

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