生产，结晶和结构测定℃。难辨通过Microseeding和锌SAD PPEP-1
2016年12月30日
脯氨酸-脯氨酸内肽酶-1 （PPEP-1） 是一种分泌型金属蛋白酶，是来自人类病原体艰难梭菌的有前途的药物靶标。在这里，我们描述了生产和结构测定该蛋白质所需的所有方法。
该程序的总体目标是有效地生长重组脯氨酸脯氨酸内肽酶-1 或 rPPEP-1 蛋白的单晶格衍射质量晶体。如果没有这种方法，rPPEP-1 会立即产生不适合 X 射线衍射分析的高度共生晶体。该技术的主要优点是可以在短时间内产生大量用于 rPPEP-1 结构测定的有序且衍射良好的晶体，并且材料投入有限。
该程序利用 microcity 方法，可适用于 rPPEP-1 及其底物肽复合物的每种成功初始结晶条件。这种方法可以适用于生产几乎所有蛋白质的有序晶体，从而产生共生晶体。它还可用于交叉接种实验、蛋白质差异或小分子共结晶实验。
结晶方法作的可视化演示至关重要，因为即使是微小的变化也会对晶体的衍射质量产生重大影响。使用标准的市售筛网和结晶机器人，以静滴形式进行结晶试验。首先，使用离心超滤装置以 4000 倍 g 和 4 摄氏度的间隔 5 分钟将纯化的蛋白质浓缩至 12 毫克/毫升。
在每个间隔后混合蛋白质，以防止沉淀和加重。使用每摩尔厘米 25、900 的消光系数测定 280 纳米处的蛋白质浓度。将蛋白质平衡至 20 摄氏度后，在 16000 倍 g 和 20 摄氏度下离心 10 分钟，清除所有颗粒和灰尘。
要进行晶体筛选，请使用密封并储存在 4 摄氏度下的预装结晶板。设置试验时，请迅速工作，因为小体积很快就会变干。如果可能，还可以在机器人的扩展坞周围使用湿度室。
将所有结晶板平衡至 20 摄氏度后，通过将蛋白质储液槽移液到子孔 2 到 4 中来设置筛选。使用 300 纳升的液滴体积。对于子孔 2，使用蛋白质与储层的比例为 200：100，对于子孔 3,150：150 用于子孔 4
。立即密封板并将其放入 20 摄氏度的腔室中。在设置后的第一周内每天检查托盘，然后进行每周检查。对于底物肽 rPPEP-1 复合物的共结晶，以 24 毫克/毫升的比例将 rPPEP-1 与 7 倍摩尔过量的肽溶液混合，溶于 tris 缓冲盐水中的冻干粉。
在 20 摄氏度下孵育 30 分钟后，在 16000 倍 g 和 20 摄氏度下离心 10 分钟，清除所有颗粒和灰尘。使用与未结合的 rPPEP-1 蛋白相同的微接种程序进行结晶。rPPEP-1 高度共生晶体在含有 2.4 摩尔磷酸氢铵和 0.1 摩尔三叶草 pH 8.5 的条件下出现。
为了优化初始条件，使用软件计算体积和移液方案，以获得每个条件 2 毫升，允许 10 个优化筛选。条件包括 1.8 至 2.55 摩尔磷酸氢铵（以 0.15 摩尔为单位）以及 0.1 摩尔磷酸氢铵 pH 7.5 至 9.0（以 0.5 pH 单位为步长）。准备一个网格筛选，其中包含来自储备溶液的 24 个条件。
使用移液方案来组合各个条件。将 200 微升每种网格筛选溶液移液到 24 孔板的孔中，并在 20 摄氏度下平衡板。手动设置结晶板。
使用 3 μL 的液滴体积和 2：1、1.5：1：5 和 1：2 的蛋白质储液槽比。在这里，使用外置活塞式移液器以避免气泡形成。立即密封板。
然后将板放入 20 摄氏度的腔室中。1 到 4 天后，rPPEP-1 的高度共生晶体出现在含有 2.55 摩尔磷酸氢铵和 0.1 摩尔三叶草 pH 7.5 至 9.0 的四种条件下，而在其余 20 种条件下没有形成晶体。在这些条件下执行微种子程序以获得 rPPEP-1 的单晶。
要制备微种子原液，首先从其中一个成功条件中选择单个互生晶体。接下来，将 50 微升相应的母液转移到 1.5 毫升的试管中，该试管中包含一个高度抛光的小玻璃珠和 1 微升母液到玻璃盖载玻片上。使用已安装的尼龙润滑剂，捞出晶体并将其转移到玻璃盖载玻片上的液滴中。
然后将含有晶体的液体转移到试管中，高速涡旋 30 秒，确保玻璃珠旋转。将种子原液以 1：1000 的比例稀释到含有相同新鲜制备条件的新 1.5 毫升试管中，并彻底涡旋 5 秒钟。接下来，取下板的密封件，用透明滴剂覆盖 20 种情况。
将 0.5 微升种子原液移液到孔中。密封板并将其放入 20 摄氏度的腔室中。应用这种微晶种技术后，在各种条件下放置后数小时至数天出现高衍射质量的单晶，含有 1.8 至 2.4 摩尔的磷酸铵和 0.1 摩尔的 tris pH 7.5 至 9。
晶体的最大尺寸长到 100 到 200 微米。通过将尼龙环放在晶体正上方的密封胶带上并上下聚焦，为所选晶体的最大长度选择最佳尺寸的尼龙环。rPPEP-1 晶体的典型最长连接距离约为 100 至 200 微米。
还要准备适当的低温条件。用液氮填充泡沫机。然后用样品瓶装入样品瓶夹具，并在充满液氮的 800 毫升泡沫脱水机中预冷。
将标有合适标识符的低温藤支架和低温套管放入充满液氮的 2 升泡沫脱水机中。然后用合适尺寸的已安装尼龙环装入磁棒。接下来，用锋利的手术刀切开结晶板上的密封胶带，然后用镊子将其取下。
吸取 1 μL 的低温条件到盖玻片上。在此步骤中快速工作尤为重要，因为干燥晶体或定量环中极小体积的冷冻溶液可能会导致晶体质量波动，甚至完全失去衍射。所有晶体作步骤都应在立体显微镜下进行。
如果晶体粘在塑料表面，请用针灸针使周围的塑料变形，将其从地面上分离。用安装的尼龙环将水晶从水滴中取出。将晶体快速转移到低温条件下的液滴中，并使其平衡 1 秒钟。
然后尽快使用安装的尼龙环将晶体从水滴中捞出。立即将回收的晶体浸入液氮中冷冻。当已安装的定量环周围的液氮停止沸腾时，将定量环放入样品瓶中。
将样品瓶放在低温藤支架上。在支架上装入 6 个样品瓶后，在支架周围放置一个低温套筒。将晶体储存在装满液氮的罐中，直到使用。
要进行数据收集，请使用夹子小心地从低温甘蔗中取出镶座的晶体，并将其存放在泡沫脱水机中以供运输。将光阑和探测器移动到停放位置，并将低温喷嘴向上移动几毫米。用手指固定底座，同时快速取出样品瓶，将冻存帽底座安装到测角仪头上。
然后将低温喷嘴和光束光阑移回原位，并使晶体居中。始终小心不要触摸光束光阑或探测器。继续收集振荡角为 0.1 度的 180 度数据集，如下所示。
这里显示的是高度共生的 rPPEP-1 晶体，这些晶体是在 1.4 柠檬酸钠三钠二水合物、0.1 摩尔 HEPES 钠（pH 7.5）中使用商业结晶筛选进行初步筛选获得的。此处显示的是用 60% 体积对体积石墨烯（pH 7.0）、0.1 摩尔 BIS-TRIS 丙烷（pH 7.0）进行初步筛选获得的晶体。晶体也出现在 2.4 摩尔磷酸氢铵、0.1 摩尔三、pH 8.5 中。
应用微晶种优化程序后，在几个条件下包含单晶，包括 2.1 摩尔磷酸氢铵，0.1 摩尔三，pH 8 和 2.25 摩尔磷酸氢铵，0.1 摩尔三，pH 8。镶嵌在尼龙环中的晶体大小为 100 至 200 微米，从显微镜检查中似乎只有一个晶格。X 射线衍射分析表明，这些晶体确实表现出单晶格，并将 X 射线衍射到接近原子的分辨率。
解析重组 PPEP-1 底物肽复合物的晶体结构可以深入了解 PPEP-1 的底物结合模式。底物肽在其开放确认中可以扩散到 PPEP-1 的底物结合基团中。然后，当发生环闭合时，底物通过氢键和位于 S 环上的独特脂肪族-芳香族侧链网络与 PPEP-1 相互作用。
底物以独特的双扭结构象结合，在嘶嘶声肽键和 P2 引物到 P3 引物肽键处扭结。看完这个视频，你应该对如何生产重组 PPEP-1 的单晶格井衍射晶体进行结构研究有了很好的了解。类似的方法可以用于其他蛋白质，产生高度互生的晶体，并进一步改变孵育温度和 C 储备液稀释。
由于其多功能性和简单的使用性，应该在每个晶体优化过程中尝试这种简单的技术。
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概述
本文讨论了产生和结构测定来自梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile）的脯氨酸-脯氨酸内肽酶-1（PPEP-1）的方法，PPEP-1是一种金属蛋白酶。重点是一种生长高质量重组PPEP-1晶体的方法，用于X射线衍射分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 结构生物学
- 蛋白质晶体学
- 生物化学
背景
- PPEP-1是一种分泌的金属蛋白酶，具有作为药物靶点的潜力。
- 由于晶体相互生长，rPPEP-1的结晶具有挑战性。
- 高效的晶体生长对结构分析至关重要。
- 微城市法可适用于各种结晶条件。
研究目的
- 开发一种生产单晶格衍射质量rPPEP-1晶体的方法。
- 实现rPPEP-1及其底物复合物的结构测定。
- 提供一种适用于其他产生相互生长晶体的蛋白质的通用方法。
使用的方法
- 微城市法用于晶体生长。
- 初始结晶条件的适应。
- 交叉接种实验。
- 与小分子的共结晶。
主要结果
- 高效生产rPPEP-1的有序晶体。
- 适合X射线衍射的高数量的晶体。
- 该方法适用于各种蛋白质结晶场景。
- 在结构生物学中具有更广泛的应用潜力。
结论
- 开发的方法显著提高了rPPEP-1的晶体质量。
- 这种方法可以增强其他蛋白质的结构研究。
- 未来研究可以利用这种技术进行药物发现。
常见问题
Executive Industry Relevance
Determining the atomic structure of virulence factors like C. difficile PPEP-1 enables structure-guided inhibitor design to reduce pathogenicity. Reliable production of diffraction-quality crystals is a prerequisite for fragment screening and lead optimization in anti-infective programs. This microseeding protocol addresses a common bottleneck in structural biology by converting intergrown crystals into single-lattice forms suitable for X-ray diffraction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of PPEP-1's substrate binding mode through high-resolution structural data.
- Operational Value: Provides pure, active protein in sufficient quantities for biophysical assays and inhibitor screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates well-ordered crystals capable of near-atomic resolution X-ray diffraction for detailed active-site mapping.
- Operational Value: Uses microseeding to optimize crystallization conditions with limited protein input, increasing throughput.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by revealing how substrate peptides interact with PPEP-1 via hydrogen bonds and aliphatic-aromatic networks.
- Operational Value: Produces crystals suitable for ligand soaking or co-crystallization to evaluate inhibitor binding.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the structural biology workflow from protein production to lead identification, enabling iterative cycles of crystallization, data collection, and structure-based design.
- Discovery Biology: Facilitates target validation by providing structural insights into PPEP-1 function and inhibition mechanisms.
- Screening: Yields crystals compatible with fragment screening and X-ray diffraction data collection for hit identification.
- Analytics: Delivers electron density maps that reveal substrate binding conformations and potential inhibitor interaction points.
- Translational Research: Connects atomic-level structural data to preclinical inhibitor optimization through defined binding modes.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other proteins prone to intergrown crystal formation, broadening utility across targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protease-substrate interactions through clear visualization of binding modes.
- Operational Value: Enables reproducible production of single-lattice crystals from initially poor crystallization hits.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by providing high-quality structural data for computational docking and medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target druggability assessments, supporting risk-adjusted investment decisions.
Implementation Considerations
- Expertise in protein purification, crystallization screening, and microseeding techniques.
- Access to crystallization robots, imaging systems, and X-ray diffraction beamlines.
- Standardization of protein concentration, drop ratios, and seeding protocols across teams.
- Adaptation of buffer conditions (e.g., ammonium phosphate, Tris pH) for different protein targets.
- Limitations include dependency on initial crystallization hits and optimization time for seed stock preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Initial Screening of rPPEP-1 and Co-crystallization of rPPEP-1 with Ligands Using Commercial Screens
3:54
Crystal Optimization Using Microseeding
7:35
Crystal Mounting
10:45
Results: Evaluation of rPPEP-1 Crystal Growth Using Optimization Procedure
12:48
Conclusion
