Name: 生产，结晶和结构测定℃。难辨通过Microseeding和锌SAD PPEP-1 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 学习利用微晶种技术培养艰难梭菌PPEP-1金属蛋白酶的高质量单晶，用于X射线衍射结构测定。该方法可快速获得适用于结构生物学研究的优质晶体，为药物靶点研究提供重要基础。

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我们感谢瑞士保罗谢勒研究所（Paul-Scherrer-Institute）Villigen 分部瑞士光源（Swiss Light Source）X06DA 光束线的工作人员在同步辐射数据采集过程中提供的支持。我们衷心感谢 Monika Gompert 提供出色的技术支持。本项目得到了科隆大学以及德国研究基金会（German Research Council）资助项目 INST 216/682-1 FUGG 的支持。我们感谢国际研究生院“发育、健康与疾病”（International Graduate School in Development Health and Disease）为 C.P. 提供的博士生奖学金。本研究工作获得了欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号 283570（BioStruct-X）的经费支持。

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

X射线晶体学仍然是测定蛋白质三维近原子分辨率结构最快且最准确的方法28。然而，该方法需要生长出高度有序的单晶，而这类晶体往往难以获得，且晶体状态本身属于人为条件。尽管如此，将X射线晶体学测定的蛋白质结构与其他方法（尤其是核磁共振，NMR）测定的结构进行比较，通常显示出非常好的一致性。以PPEP-1为例，最近发表的NMR结构29与我们的晶体结构14高度一致，包括S环的流动性也相符。
本方案描述了用于结构研究的N端带His标签的重组PPEP-1蛋白的表达与纯化，以及无标签重组PPEP-1的结晶与结构解析。本案例中单晶难以生长，需采用特殊的微晶接种方法。在下文中，我们将讨论PPEP-1的研究结果，并说明如何调整该方案以适用于其他任何蛋白的表达与结晶。
载体设计与表达的变异
rPPEP-1 表达为N端带His标签的变体（图1A），因为在结晶时，由于His标签可能影...

Clostridium difficile 是医院内抗生素相关性腹泻感染的主要病因之一1。这种革兰氏阳性厌氧细菌通过粪-口途径以其孢子形式传播。例如 BI/NAP1/027 等新型“流行性”或“高毒力”菌株在过去十年中导致北美和欧洲的感染病例数和死亡率急剧上升2。C. difficile 相关疾病（CDAD）是一种危及生命的结肠炎症，具有较高的致死率3。其症状范围从腹泻4到假膜性结肠炎5，以及常导致死亡的中毒性巨结肠6。
由于高致病性菌株具有多重耐药性且复发率高，艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）的治疗较为困难7。目前的治疗方案包括使用抗生素甲硝唑、非达霉素或万古霉素，对于反复复发的病例则采用粪便微生物群移植。迫切需要新的治疗策略8。目前已取得一定进展，针对艰难梭菌（C. difficile）毒素B的治疗性单克隆抗体贝洛托单抗（Bezlotoxumab）9已成功完成III期临床试验，并已向美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）提交上市申请。此外，目前还有多种新型抗生素正处于不同阶段的临床试验中10。
为了开发有效的治疗方法，必须识别新的治疗靶点。最近发现的 C. difficile 蛋白酶脯氨酸-脯氨酸内肽酶-1（PPEP-1；CD2830/Zmp1；E.C. 3.4.24.89）是一个极具前景的靶点，因为敲除菌株中PPEP-1的缺失会降低其毒力 体内艰难梭菌11PPEP-1 是一种分泌型金属蛋白酶12,13 切割两个 C. difficile 其C末端的黏附素13 从而将黏附的细菌从人体肠道上皮释放出来。因此，该过程参与维持细菌固着表型与运动表型之间的平衡 C. difficile为了开发针对PPEP-1的选择性抑制剂，并深入理解其识别底物的机制，必须充分掌握其三维结构的详细信息。我们已解析了PPEP-1单独存在及其与底物肽结合状态下的首个晶体结构。14PPEP-1 是首个已知可特异性切割两个脯氨酸残基之间肽键的蛋白酶15它以双弯曲方式结合底物，并通过位于覆盖蛋白酶活性位点的S环中的一系列脂肪族-芳香族残基网络来稳定底物14这种底物结合模式为PPEP-1所独有，迄今未见于人类蛋白酶中。这使其成为一个极具前景的药物靶点，且抑制剂产生脱靶效应的可能性极低。
未来若要开发并筛选选择性PPEP-1抑制剂，需要大量高纯度且单分散的PPEP-1蛋白。此外，为了确定首批抑制剂的结合模式，还需解析其与PPEP-1的共结晶结构。在我们实验过程中，PPEP-1始终产生重叠生长的晶体。因此，我们建立了一种优化方法，以获得可用于衍射分析的单一高质量PPEP-1晶体。本方案中，我们详细描述了PPEP-114的表达、纯化、结晶及结构解析过程。我们采用在Escherichia coli中进行胞内表达的方式，表达缺失分泌信号序列的PPEP-1变体，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化，并切除纯化标签；接着采用微晶接种法16进入优化筛选，最终通过锌单波长反常散射（zinc-SAD）方法完成结构解析17。该方案可适用于其他蛋白质（e.g. 金属蛋白酶）的制备与结构解析，尤其适用于易形成重叠晶体的蛋白质。应要求，可用于教学目的的质粒DNA（pET28a-NHis-rPPEP-1）及衍射数据可提供使用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;基因/载体/细胞株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a 载体</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>凝血酶可切割的N端His标签</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 菌株 BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H 缺陷型</td></tr><tr><td>针对 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 密码子优化的 PPEP-1 (CD630_28300) 基因</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>custom</td><td>氨基酸 27-220</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消泡剂B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>水性硅油乳液</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>缓冲级</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>任意</td><td></td><td>缓冲级</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>缓冲级</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>甘油 100%</td><td>任意</td><td></td><td>最纯级</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>任意</td><td></td><td>用于晶体储存和低温冷却</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备（通用）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>任意</td><td></td><td>提供 20 &amp;deg;C - 37 &amp;deg;C 的温度</td></tr><tr><td>玻璃器皿</td><td>任意</td><td></td><td>带挡板的锥形瓶（50 ml - 2.8 L）</td></tr><tr><td>大体积培养物离心机</td><td>任意</td><td></td><td>可处理最大 12 L 体积的离心机</td></tr><tr><td>超声破碎仪 Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>或其他任意超声破碎仪/细胞破碎仪</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>任意</td><td></td><td>转速可达 150,000 × g</td></tr><tr><td>NiNTA Superflow 树脂</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>空玻璃 Econo-Column 柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>或其他任意空玻璃或塑料柱</td></tr><tr><td>尺寸排阻色谱柱 HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>色谱系统 &amp;Auml;kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>或其他任意色谱系统</td></tr><tr><td>透析袋 Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>透析袋封口夹</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>超滤装置（浓缩器）10,000 NWCO</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备（晶体学）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低体积移液器 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正向置换移液器 Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>结晶机器人</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔结晶板 TTP IQ，含三个蛋白孔</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>或其他任意96孔结晶板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24孔 CombiClover Junior 板</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Clear 密封胶带</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>硅化玻璃盖玻片</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>商用结晶筛选试剂盒：SaltRx、Index、PEG/Ion、Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>商用结晶筛选试剂盒：Wizard、PACT++、JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT（尼龙环）</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td>环尺寸 0.025 mm - 0.5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap 样品管</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>800 ml 冷冻泡沫杜瓦瓶</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>2 L 冷冻泡沫杜瓦瓶</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>直型样品管夹</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>直型磁性 CrystalWand</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 样品管架</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 颜色编码器 - 白色</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>直头微型镊子</td><td>任意</td><td></td><td>用于操作密封胶带等&lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>针灸针</td><td>任意</td><td></td><td>&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 药店购买</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>任意</td><td></td><td>用于检查结晶板和晶体挂载，放大倍数最高达 160X</td></tr></tbody></table>

蛋白质的制备、结晶与结构测定 c. difficile ppep-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

目前亟需开发新的疗法来应对对人类健康构成重大威胁的Clostridium difficile感染。C. difficile金属蛋白酶PPEP-1是未来开发抑制剂以降低该病原体毒力的潜在靶点。为了进行生物物理和结构表征以及抑制剂筛选，需要大量高纯度且具有活性的蛋白。我们已建立了一种高效生产与纯化PPEP-1的实验方案，利用E. coli作为表达宿主，可获得足够数量和纯度的蛋白，满足结晶及结构解析的需求。此外，通过微晶接种技术，可将严重共晶生长的PPEP-1晶体转化为高度有序、适用于X射线衍射分析的单晶。该方法也可用于其他重组蛋白的制备，以及研究产生共晶现象的其他蛋白质的结构。

rPPEP-1 在多种 E. coli 菌株中均呈现过表达，其中在 E. coli BL21 (DE3) Star 中产量最高（图 1C）。经过第一次 NiNTA 亲和层析后，6xHis 标签可从大部分蛋白中成功切除；在第二次 NiNTA 层析步骤中，未消化的蛋白可与凝血酶消化后的蛋白完全分离（图 1D）。在 S200 16/600 柱上，去标签的 rPPEP-1 以单体形式迁移，偶尔出现前延峰，很可能对应二聚体物种（图 2A）。该蛋白纯度高（图 2B），每升 E. coli 培养液可获得约 50 mg 蛋白。rPPEP-1 在多种条件下均可结晶（图 3），晶体中常含有磷酸盐。所有条件下的晶体均高度重叠生长，因此必须进行晶体优化。图 4 展示了源自商业筛选条件 SaltRx E4 (52)（图 3B-C...

脯氨酰-脯氨酰内肽酶-1（PPEP-1）是一种由人类病原体Clostridium difficile分泌的金属蛋白酶，也是具有前景的药物靶点。本文描述了该蛋白的制备及其结构解析所需的全部方法。

蛋白质的制备、结晶与结构测定 C. difficile PPEP-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

迫切需要开发新的疗法来应对对人类健康构成重大威胁的艰难梭菌感染。艰难梭菌金属蛋白酶 PPEP-1 是一种……

本实验的总体目标是高效培养出可用于单晶衍射分析的重组脯氨酰内肽酶-1（rPPEP-1）蛋白的高质量单晶。若不采用此方法，rPPEP-1 会立即形成严重孪生的晶体，无法适用于X射线衍射分析。该技术的主要优势在于，可在较短时间内使用有限的材料获得大量结构有序且衍射质量良好的晶体，从而实现对 rPPEP-1 的结构解析。该实验步骤采用微晶法，可适用于rPPEP-1及其底物肽复合物的任何成功初始结晶条件。该方法可进行调整，用于制备几乎所有能产生孪生晶体的蛋白质的有序晶体。此外，该方法还可应用于交叉接种实验、蛋白质变异研究，或与小分子的共结晶实验。结晶方法操作过程的可视化演示至关重要，因为即使微小的差异也可能对晶体的衍射质量产生显著影响。采用标准市售筛选试剂盒和结晶机器人，以坐滴法进行结晶试验。首先，使用离心超滤装置将纯化的蛋白质浓缩至每毫升12毫克，在4000 × g 条件下、4 °C 温度下每5分钟进行一次浓缩。每次间隔后混合蛋白质溶液，以防止沉淀和加剧。通过使用25,900 M⁻¹cm⁻¹的消光系数，在280纳米处测定蛋白质浓度。将蛋白质在20摄氏度平衡后，于20摄氏度、16000 × g离心10分钟，以去除所有颗粒和灰尘。进行结晶筛选时，使用预先填充并密封后储存在4摄氏度的结晶板。设置实验时应迅速操作，因为小体积液滴会迅速干燥。如果可能，还应在机器人操作平台周围使用湿度控制舱。将所有结晶板平衡至20摄氏度后，通过移液将蛋白质与储液混合物加入2至4号子孔中进行筛选。液滴体积为300纳升。2号子孔的蛋白质与储液比例为200:100，3号子孔为150:150，4号子孔为100:200。立即密封培养板并将其置于20摄氏度的培养箱中。在设置后的第一周内每天检查培养板，之后每周检查一次。对于底物肽rPPEP-1复合物的共结晶，将rPPEP-1以24毫克/毫升的浓度与七倍摩尔过量的肽溶液按1:1比例混合，肽溶液由溶于Tris缓冲盐水的冻干粉末制备。在20摄氏度下孵育30分钟后，于20摄氏度、16000 × g条件下离心10分钟，以去除所有颗粒和灰尘。采用与未结合的rPPEP-1蛋白相同的微晶接种方法进行结晶。在含有2.4摩尔磷酸氢二铵和0.1摩尔Tris缓冲液（pH 8.5）的条件下，两天后出现了高度共生的rPPEP-1晶体。为了优化初始条件，使用软件计算体积和移液方案，以获得每种2毫升的条件，可进行10次优化筛选。条件包括1.8至2.55摩尔的磷酸氢二铵，以0.15摩尔为步长递增，以及0.1摩尔的trisapseal，pH值从7.5至9.0，以0.5个pH单位为步长递增。使用储备溶液配制包含24种条件的网格筛选。按照移液方案配制各个条件。将每种网格筛选溶液各200微升加入24孔板的孔中，并在20摄氏度下平衡该板。手动设置结晶板。使用3微升的液滴体积，以及2:1、1.5:1

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

生产，结晶和结构测定<em&gt;℃。难辨</em&gt;通过Microseeding和锌SAD PPEP-1

本文描述了Caffrey膜结构与功能生物学研究组采用的手动设置膜蛋白在脂质介相中结晶实验的步骤。...

利用脂质介相结晶膜蛋白以进行结构测定

基于结构的药物设计在药物研发中发挥着重要作用。并行追求多个靶点可显著提高先导化合物发现的成功率。以下文章重点介绍了西雅图传染病结构基因组学中心如何采用多靶点策略，实现流感病毒A型PB2亚基从基因到结构的测定。...

流感病毒聚合酶PB2亚基基因至结构解析的多靶点并行处理方法

来源：Figueroa, D. M., 等. 抗菌肽定位表征中细菌球状体与原生质体的制备与可视化。J. Vis. Exp. (2018)本视频演示了通过首先抑制大肠杆菌（Escherichia coli）细胞分裂以诱导丝状化，随后进行细胞壁的酶解，从而制备大肠杆菌球状体的方法。该过程包括可控地添加螯合剂、DNase...

E. coli 原生质球的制备

跨膜蛋白结构域之间相互作用的生物物理与生化研究面临诸多技术挑战，首要挑战即获得合适的实验材料。本文介绍了一种用于制备和纯化二硫键稳定的跨膜肽复合物的实验方案，该复合物适用于溶液核磁共振（NMR）及其他分析技术的结构研究。...

用于结构研究的二硫键稳定跨膜肽复合物的制备

β-桶状外膜蛋白（OMPs）在革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体的外膜中具有多种功能。本文旨在通过提供相关实验方案，解决结构研究中已知的一个瓶颈问题，即大量制备β-桶状OMP蛋白，以满足通过X射线晶体学或核磁共振波谱法进行结构解析的需求。...

从构建体到晶体——迈向β-桶状外膜蛋白的结构解析

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SP0092 碳水化合物转运底物结合蛋白的生化与结构表征

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细菌球状体和原生质体的制备与可视化以表征抗菌肽的定位

我们描述了通过X射线晶体学测定NEMO蛋白IKK结合域结构的实验方案。该方法包括蛋白质的表达、纯化与表征，以及获得其无配体结合形式蛋白质高质量晶体并完成结构解析的策略。...

NEMO 的 IKK 结合结构域的制备、结晶与结构测定

本方案旨在从结构层面研究TmPep1050（一种M42型氨肽酶）从二聚体到十二聚体的转变过程。该流程简明清晰，涵盖从蛋白质纯化到X射线数据处理的全过程。通过TmPep1050H60A...

X射线晶体学研究寡聚态转变 Thermotoga maritima M42 氨基肽酶 TmPep1050

本文描述了一种多功能微流控装置，该装置能够利用逆扩散法实现酶的结晶，通过浸泡法将底物引入晶体，并在室温下对芯片内的晶体进行连续分析，从而测定酶与底物复合物的三维结构。...

通过多功能微流控芯片中的序列晶体学对酶-底物复合物进行结晶及结构测定

利用冷冻电镜（cryoEM）解析大分子复合物的结构已成为某些类别蛋白质和复合物的常规方法。本文概述了该流程（包括样品制备、筛选、数据采集与处理），并引导读者参考更详细的资源，以针对更具挑战性的样品调整相关变量。...

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

学习利用微晶种技术培养艰难梭菌PPEP-1金属蛋白酶的高质量单晶，用于X射线衍射结构测定。该方法可快速获得适用于结构生物学研究的优质晶体，为药物靶点研究提供重要基础。

蛋白质的制备、结晶与结构测定 C. difficile PPEP-1 的微晶种法结合锌单波长反常散射法

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