葡聚糖增强小鼠和人原发性 NK 细胞的慢转导效率

该方案的总体目标是制定允许在原代自然杀伤细胞中成功进行基因转导的技术。这种方法可以帮助回答免疫治疗领域的关键问题，例如基因改造对效应淋巴细胞（如自然杀伤细胞）或 NK 细胞的影响。该技术的主要优点是目标基因在原代小鼠或人 NK 细胞中有效表达。

根据文本方案制备和滴定慢病毒载体后，通过将单细胞脾悬浮液通过尼龙棉柱来纯化小鼠原代 NK 细胞，以耗尽由 B 细胞和巨噬细胞组成的贴壁群体。在完全培养基中使用每毫升 1， 000 单位的白细胞介素-2 RPMI1640培养含有 NK 细胞的非贴壁群体。在培养的第 4 天，使用 20 毫升 RPMI1640 完全培养基和每毫升 1， 000 单位的 IL-2 更换培养基，以去除非贴壁的 T 和 NKT 细胞。

第 7 天，使用 MK 细胞特异性标记物，使用大于 95%CD3 阴性和 NK1.1 阳性群体的制剂，通过流式细胞术检查小鼠 NK 细胞的纯度。为了分离外周血单核细胞或 PBMC，在 50 毫升锥形管中以 15 毫升密度梯度小心地将 35 毫升半稀释细胞分层。在水平转子中以 400 倍 G 和 20 摄氏度离心梯度 30 分钟，不得间断。

根据文本方案纯化人原代 NK 细胞后，通过每毫升添加 2 μg 抗 CD3 和每毫升 2 μg 抗 CD56 抗体来确定细胞的纯度。将细胞在 4 摄氏度下孵育 20 分钟。使用 PBS 洗涤细胞两次。

然后，通过流式细胞术分析细胞。NK 细胞群细胞表面的 CD56 呈阳性，CD3 呈阴性。用 GFP 慢病毒上清液将小鼠或人原代 NK 细胞以每毫升培养基 0.5 倍至第 5 倍的速度悬浮在 24 孔板的孔中，NLY 为 5、10 和 20。

然后在聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或葡聚糖存在下。将板以 1， 000 倍 G 离心 60 分钟。然后，在不倾析上清液的情况下，在注入 5.2% 二氧化碳的 37 摄氏度培养箱中培养细胞过夜。

用 10 ml PBS 洗涤细胞后，使用 2 ml 含 IL-2 的 RPMI1640 培养基重悬细胞。在收获细胞的前一天，用每毫升 2.5 微克的抗 MKG2D 单克隆抗体包被 96 孔高蛋白吸收性聚苯乙烯板。并将板在室温下或冰箱中孵育过夜。

第二天，使用 100 微升 PBS 洗涤每个孔 3 次。首先轻轻敲击板，然后向 96 孔板的每个孔中加入 100 微升细胞，收获转导的 NK 细胞。激活后 16 至 18 小时，使用多通道移液器收集上清液。

然后使用 ELISA 试剂盒中的重组细胞因子，生成标准曲线并定量细胞因子，例如上清液中的干扰素 γ。为了测试 NK 细胞活力，转导后 4 天，用 10 毫升冷 PBS 洗涤细胞两次。然后，收获细胞并使用 XM5 7-氨基放线菌素 D 对其进行染色。

使用流式细胞术确定转化的 NK 细胞中坏死细胞的百分比，并根据文本方案分析数据。该图显示，与添加聚凝胺或硫酸鱼精蛋白相比，当向培养物中添加葡聚糖时，与重组 IL-2 一起孵育然后用 GFP 慢病毒转导的人 NK 细胞实现了更高的转导效率，并增加了病毒滴度。如图所示，在小鼠 NK 细胞中也证明了类似的结果，与聚凝胺或硫酸鱼精蛋白相比，右旋糖酐提高了慢病毒载体的效率。

在本实验中，通过针对 K562 和 YAC-1 作为靶细胞的 CR 释放试验检查转导的原代 NK 细胞的细胞毒能力。与未转导的 NK 细胞相比，葡聚糖转导 NK 细胞不会对转化的 NK 细胞的杀伤潜力产生负面影响。在这里，转导的人原代 NK 细胞与 K562 共培养 24 小时，并收集上清液以测量干扰素 γ。

结果表明，葡聚糖对转导的 NK 细胞产生细胞因子的能力没有影响。此外，一项独立验证表明，用板结合的抗 NKG2DA10 单克隆抗体激活的葡聚糖处理的 NK 细胞仍然能够产生细胞因子干扰素 γ。在尝试此过程时，请务必记住旋转转导的细胞。

遵循此程序，转染等其他方法可能会很深入，以回答其他问题，例如如何改善基因递送。开发后，这项技术为免疫学领域的研究人员铺平了道路，用于探索 NK 细胞中的基因作。看完这个视频，您应该对如何转导 NK 细胞有很好的了解。