Name: 葡聚糖增强小鼠和人原发性 NK 细胞的慢转导效率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 了解葡聚糖增强慢病毒转导技术在小鼠和人原代NK细胞中的应用。该方法显著提高基因转导效率，同时保持NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生能力，为免疫治疗研究提供可靠工具。

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感谢Lucia Sammarco及其Lulu's Lemonade Stand提供的灵感、动力和支持。本工作部分由以下机构资助：NIH R01 AI102893 和 NCI R01 CA179363（S.M.）；NHLBI-HL087951（S.R.）；NIH-CA151893-K08（M.J.R.）；NCI 1R01CA164225（L.W）；Alex Lemonade Stand基金会（S.M.）；MACC基金HRHM项目（S.M.；S.R.；M.S.T）；Nicholas家族基金会（S.M.）；Gardetto家族（S.M.）；现代学者计划（M.S.T.）；现代希望之轮（S.R.）；MACC基金（M.S.T. 和 S.M.）；儿童研究所，MCW（S.R.）；以及Kathy Duffey Fogerty奖（M.J.R.）。

所有动物实验方案均遵循动物人道与伦理处理原则，并经威斯康星医学院（MCW）生物医学研究中心（BRC）的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。使用人外周血单个核细胞（PBMCs）的研究已获威斯康星血液中心血液研究所机构审查委员会（IRB）批准。
1. 小鼠、细胞系和载体
<ol>
	<li>从商业供应商处获取 C57BL/6 小鼠。在无病原体条件下维持小鼠种群，使用 6 至 12 周龄的雌性和雄性小鼠。从经伦理审查委员会（IRB）批准的来源获取去标识化的人外周血单个核细胞（PBMCs）。</li>
	<li>使用含 20–30%（v/v）异氟烷的丙二醇（1,2-丙二醇，USP 级）混合物对小鼠进行麻醉。在小鼠麻醉期间，向其眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>在麻醉诱导后，通过颈椎脱位法对动物实施安乐死。
	<ol>
		<li>用一只手牢固抓住小鼠尾根部以固定动物，用另一只手的拇指和食指或一支坚固的笔状物抵住其颈部背部、颅底位置。</li>
		<li>为实现脱位，将固定头部的手向前推并向下施压，同时用握住尾根的手向后拉。通过触诊颈椎组织是否分离来确认脱位效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物留在密闭室或笼内至少 5 分钟，仅在呼吸活动消失或无法检测到心跳时方可移出。</li>
	<li>从商业供应商处获取 K562 和 YAC-1 细胞，并将其维持在含有 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的 RPMI1640 培养基中。定期检测这些细胞系，以排除支原体污染的可能性。</li>
</ol>
2. 慢病毒载体的制备与滴定
<ol>
	<li>在含有20 mL RPMI1640培养基（添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、1 mM丙酮酸钠、5%的7.5%碳酸氢钠溶液和0.001% β-巯基乙醇）的T75 cm2培养瓶中，将5 × 106个293T细胞过夜培养。将培养瓶置于37 °C、含5.2% CO2的培养箱中。</li>
	<li>使用含0.025%胰蛋白酶和1 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）收集293T细胞。向培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C培养箱中孵育10分钟，使293T细胞从T75 cm2培养瓶表面脱落。
	<ol>
		<li>收集脱落的细胞，并用PBS洗涤两次以去除残留的胰蛋白酶和EDTA。用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整为每毫升一百万个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将3.95 µg psPAX2、1.32 µg pMD2G以及5.26 µg pLEP-GFP-Puro（由BRI内部构建，通过将pWPI中的EF1alpha启动子替换pLenti CMV-GFP-Puro中的CMV启动子获得）19共转染至293T细胞中18。
	<ol>
		<li>配制1 mL 150 mM NaCl溶液，加入63 µL 0.6 mg/mL聚乙烯亚胺（PEI；25,000 kD，线性），充分混匀，随后加入质粒并再次混匀。室温孵育20分钟后，将混合物加入细胞中。</li>
		<li>转染后16小时，更换为新鲜培养基并添加4.5 mM丁酸钠。转染后48小时收集含病毒的上清液，并在5,000 × g条件下离心浓缩过夜。参见材料表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过连续稀释法感染293T细胞，并在转导后72小时采用流式细胞术检测，测定病毒滴度20。以绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平作为定量病毒滴度的指标。</li>
</ol>
3. 小鼠原代NK细胞的纯化与扩增
<ol>
	<li>纯化小鼠原代自然杀伤（NK）细胞21。简言之，将单细胞脾脏悬液通过尼龙毛柱，以去除由B细胞和巨噬细胞组成的贴壁细胞群体。</li>
	<li>将从尼龙毛柱洗脱的非贴壁细胞群体（含小鼠NK细胞）在RPMI1640完全培养基中培养，培养基含1,000 U/mL白细胞介素（IL）-2、10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、1 mM丙酮酸钠、5%的7.5%碳酸氢钠溶液以及0.001% β-巯基乙醇（RPMI1640完全培养基）。</li>
	<li>在培养第4天更换培养瓶中的培养基，以去除非贴壁的T细胞和NKT细胞；仍贴壁于培养瓶的细胞主要为NK细胞。向培养瓶中加入20 mL新鲜RPMI1640完全培养基和1,000 U/mL IL-2，以补充培养基。</li>
	<li>在培养第7天通过流式细胞术检测小鼠NK细胞培养物的纯度，使用NK细胞特异性标记物20，要求CD3-NK1.1+细胞群体比例超过95%。</li>
</ol>
4. 人原代NK细胞的纯化与扩增
<ol>
	<li>通过密度梯度法从健康人类志愿者的血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。简而言之，将35 mL用HBSS稀释一倍的细胞样本小心地叠加在50 mL标准离心管中的15 mL密度梯度液上方。在20 °C下，使用水平转子以400 × g离心30分钟，离心过程中不启用刹车。</li>
	<li>根据制造商的说明书，使用商用抗体介导的阴性筛选试剂盒纯化人原代自然杀伤（NK）细胞。</li>
	<li>分离完成后，通过免疫荧光分析测定NK细胞制备物的纯度。在4 °C条件下，用2 µg/mL抗-CD3抗体和2 µg/mL抗-CD56抗体对NK细胞制备物染色20分钟。用PBS洗涤细胞两次，通过流式细胞术分析细胞表面CD3阴性且CD56阳性的NK细胞群。</li>
	<li>将细胞制备物在4 °C下与抗体孵育20分钟，用PBS洗涤后进行流式细胞仪分析。基因转导实验应使用纯度高于85%的NK细胞制备物20。</li>
</ol>
5. 用慢病毒转导小鼠和人原代NK细胞
<ol>
	<li>将小鼠或人原代 NK 细胞悬浮于 24 孔板中，细胞密度为 0.5 × 105/mL 培养基，并加入 GFP 慢病毒上清液，感染复数（MOI）分别为 5、10 和 20，同时加入 Pb（8 µg/mL）、PS（8 µg/mL）或葡聚糖（8 µg/mL）。</li>
	<li>以 1,000 × g 离心 60 分钟。</li>
	<li>不移除上清液，将细胞在 37 °C、含 5.2% CO2 的培养箱中过夜培养（16–18 小时）。</li>
	<li>用 10 mL PBS 洗涤细胞，重悬于 2 mL 含 IL-2（300 U/mL）的完全 RPMI1640 培养基中。</li>
	<li>通过进行不同效应细胞与靶细胞比例的 51铬（Cr）释放实验，分别检测人和小鼠原代 NK 细胞对 K562 和 YAC-1 细胞的细胞毒性22。
	<ol>
		<li>简要而言，向一百万个靶细胞加入 50 µCi 放射性标记的铬酸钠 51Cr。在 4 小时孵育期间，靶细胞将 51Cr 摄取至细胞蛋白中。孵育结束后，洗涤细胞以去除未结合的放射性标记物。</li>
		<li>根据靶细胞释放的 51Cr 的绝对释放量、自发释放量和实验释放量，计算特异性肿瘤细胞裂解率。 
		注：特异性裂解百分比的计算基于五次重复实验，使用以下公式：% 特异性裂解 = ((51Cr 实验组平均释放量 - 51Cr 自发释放量平均值) / (51Cr 最大释放量平均值 - 51Cr 自发释放量平均值)) × 100，其中 &#34;51Cr 自发释放量平均值&#34; 指在无 NK 细胞存在时靶细胞释放的 51Cr 量，&#34;51Cr 最大释放量平均值&#34; 指靶细胞经 2 N 盐酸（HCl）裂解后释放的 51Cr 量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第 7 天轻轻敲击培养瓶，收获转导后的 NK 细胞。
	<ol>
		<li>通过在 96 孔高蛋白吸附性聚苯乙烯板上包被 2.5 µg/mL 的抗 NKG2D 单克隆抗体（A10）过夜，以滴定浓度的板结合抗 NKG2D 单抗激活收获的细胞。</li>
		<li>在加入原代 NK 细胞前，每孔用 100 µL PBS 洗涤三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在激活后 16 至 18 小时，使用多通道移液器收集培养上清液，用于定量检测 IFN-γ 等细胞因子。使用 ELISA 试剂盒中提供的重组细胞因子生成标准曲线。</li>
	<li>采用 Annexin-V/7-氨基放线菌素 D（7-AAD）染色法检测 NK 细胞活力23，并通过流式细胞仪确定转化 NK 细胞中坏死细胞的百分比。
	<ol>
		<li>进行该实验时，在转导后第四天收获小鼠和人 NK 细胞，用 10 mL 冷 PBS 在 500 × g 条件下各洗涤两次，每次 5 分钟，随后使用 Annexin-V（PE）/7-AAD 试剂盒进行孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的流式细胞分析软件分析数据。选择活细胞群体，并分析 GFP 表达（FITC 通道）以评估病毒转导效率24。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在经济利益冲突。

本研究表明，使用右旋糖酐作为阳离子聚合物试剂可提高慢病毒对小鼠和人原代自然杀伤（NK）细胞的转导效率。此外，其他阳离子试剂如聚溴化物（Pb）或聚硫酸酯（PS）对慢病毒载体递送至人原代NK细胞并无明显影响。既往研究已证实，Pb可增强慢病毒对人T细胞的基因转导效率17。然而，本研究结果表明，Pb和PS对人原代NK细胞均无类似增效作用。在本研究中，Pb仅对小鼠NK细胞的转导效率有轻微提升。已有研究显示，使用TBK1/IKKɛ抑制剂BX795抑制细胞内抗病毒防御机制，并联合PS作为增强剂，可提高慢病毒转导效率25。然而，实验结果表明，该抑制剂对小鼠或人原代NK细胞的转导效率并无影响（数据未显示）。
结果表明，葡聚糖可有效诱导人和小鼠原代NK细胞的转导，而PS和Pb则无此作用。结果还显示，葡聚糖不影响NK细胞的效应功能，如抗肿瘤细胞毒性和促炎性细胞因子的产生。因此，这些结果证实葡聚糖的使用并未改变这些原代NK细胞的存活能力。
多项研究分析并比...

自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统中的主要淋巴细胞群体1。NK细胞在宿主免疫应答中发挥着对抗肿瘤和感染的第一道防线作用2,3,4。NK细胞还通过分泌强效的细胞因子和趋化因子，在耐受性形成过程中发挥核心作用5。由于其靶向并清除肿瘤细胞的强大能力，目前正在进行多项临床试验，以评估供体来源的人NK细胞作为癌症过继性免疫治疗的应用潜力6,7。与T细胞相比，NK细胞的发育生物学尚未被充分阐明8。这一知识的缺乏部分原因在于缺乏能够高效将目的基因导入小鼠或人原代NK细胞的技术。因此，大多数NK细胞研究均在细胞系中进行，而非在原代细胞中开展。因此，建立一种可靠且高效的原代NK细胞转导目的基因的实验方案至关重要。
本研究的总体目标是建立一种稳定且可靠的方法，用于将原代人或小鼠自然杀伤（NK）细胞通过慢病毒或逆转录病毒进行转导。
早期为解决这一问题而开展的研究主要采用原代NK细胞的瞬时转染方法，包括质粒转染9,10、EB病毒（Epstein-Barr Virus, EBV）/逆转录病毒杂合载体11、痘苗病毒载体12,13以及Ad5/F35嵌合型腺病毒载体14。尽管这些技术具有一定的转导效率，但由于其转导效果为瞬时性，因而不适用于基因修饰NK细胞的长期应用。少数近期研究采用逆转录病毒载体转导NK细胞，但需多次感染循环才能达到可接受的基因表达水平11,15。与逆转录病毒载体不同，慢病毒载体可利用宿主细胞的核输入机制，将病毒前整合复合物转运至细胞核内。这一特性克服了病毒在非分裂细胞（包括原代NK细胞）中复制的主要限制因素。
不同细胞表面受体与病毒颗粒之间的相互作用介导了病毒进入细胞的过程。由于病毒包膜蛋白与其相应的宿主受体之间可能存在负电荷排斥，初始结合可能受到限制。许多转导技术的原理在于，添加阳离子聚合物（如多聚素B（Pb）、硫酸鱼精蛋白（PS）或葡聚糖）可使细胞表面受体带正电荷，从而增强病毒包膜蛋白的结合能力。这将提高病毒颗粒与细胞的融合效率及摄取率16。尽管已有报道表明，Pb或PS可在T细胞中提高基因转导效率17，但其在原代自然杀伤（NK）细胞转导效率方面并未显示出作用。此外，目前尚未针对这些试剂在原代NK细胞中的应用进行过比较分析。本研究比较了三种阳离子聚合物的转导效率。结果显示，在这三种阳离子聚合物中，只有葡聚糖能显著提高病毒对小鼠和人原代NK细胞的转导效率。

<table><tbody><tr><td>葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90-64-91-9</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺（Pb）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白（PS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p3369</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATALANTA</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Corning</td><td>MT25000CI</td><td></td></tr><tr><td>干扰素γ（IFN-&amp;gamma;）</td><td>eBioscience</td><td>14-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶染色液</td><td>BD</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>PHOENIX</td><td>NDC 57319-559-05</td><td></td></tr><tr><td>NK细胞阴性筛选试剂盒</td><td>Stem Cell</td><td>19855</td><td></td></tr><tr><td>Yac-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>Jakson</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>293T细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>T75培养瓶</td><td>Cornnig</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>基于抗体的阴性筛选试剂盒</td><td>Stem Cell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;铬（Cr）释放实验</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030</td><td></td></tr><tr><td>ELISA试剂盒</td><td>Ebioscience</td><td>00-4201-56</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma</td><td>5887-5G</td><td></td></tr><tr><td>线性聚乙烯亚胺</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>菲可尔</td><td>GE Life Science</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

右旋糖酐提高小鼠和人原代nk细胞的慢病毒转导效率

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

将特定基因高效转导至自然杀伤（NK）细胞一直是一个重大挑战。成功的基因转导对于明确目的基因在NK细胞发育、分化及功能中的作用至关重要。近年来，嵌合抗原受体（CARs）在癌症免疫治疗中的进展进一步凸显了建立一种高效方法以将外源基因递送至效应淋巴细胞的迫切需求。目前，慢病毒介导的基因转导在人或小鼠原代NK细胞中的效率仍然显著偏低，这是主要的限制因素。近期研究表明，使用聚凝胺等阳离子聚合物可提高T细胞的基因转导效率。然而，这些试剂未能改善NK细胞的转导效率。本研究显示，右旋糖酐（一种支链葡聚糖多糖）可显著提高人和小鼠原代NK细胞的转导效率。这一高度可重复的转导方法为转导人原代NK细胞提供了有效工具，有望极大提升临床基因递送应用，从而推动基于NK细胞的癌症免疫治疗。

右旋糖酐可有效促进慢病毒载体在原代人和小鼠自然杀伤细胞中的基因转导
从外周血单个核细胞（PBMC）中分离并纯化人自然杀伤细胞（NK细胞），纯度超过85%，并在含300 U/mL重组白细胞介素-2（rIL-2）的条件下过夜培养。随后，将这些原代NK细胞在24孔板中用不同感染复数（MOI；分别为每细胞3、10和20感染单位）的GFP慢病毒进行转导，同时加入8 µg/mL的聚苯乙烯（Pb）、聚苯乙烯-磺酸（PS）或葡聚糖（dextran）。细胞在1,000 × g条件下离心60分钟，并在含病毒的CO2培养箱中于37 °C继续培养过夜。之后，细胞经洗涤并重悬于新鲜RPMI1640完全培养基中，含300 U/mL rIL-2，继续培养7天。转导效率通过转导后第7天的GFP表达水平，采用流式细胞术进行评估。结果显示，葡聚糖可增强慢病毒对人NK细胞的转导效率，提高病毒滴度，从而增加转导NK细胞的比例（图1</...

本研究的目的是开发能够成功实现原代自然杀伤（NK）细胞基因转导的技术。通过葡聚糖介导的慢病毒转导方法，可实现人或小鼠原代NK细胞的高效基因表达。该基因转导方法将极大改善NK细胞的遗传操作效果。

右旋糖酐提高小鼠和人原代NK细胞的慢病毒转导效率

自然杀伤（NK）细胞中特定基因的高效转导一直是一个主要挑战。成功的转导对于定义……至关重要

本方案的总体目标是建立能够成功实现原代自然杀伤细胞基因转导的技术。该方法有助于解答免疫治疗领域中的关键问题，例如基因修饰对效应淋巴细胞（如自然杀伤细胞，即NK细胞）功能的影响。该技术的主要优势在于能够在原代小鼠或人源NK细胞中高效表达目的基因。根据文本方案制备并滴定慢病毒载体后，通过将单细胞脾脏悬液过尼龙毛柱层析，去除由B细胞和巨噬细胞组成的贴壁细胞群，从而纯化小鼠原代自然杀伤（NK）细胞。使用含1,000单位/毫升白细胞介素-2的RPMI1640完全培养基培养含有NK细胞的非贴壁细胞群。培养第四天，更换培养基，加入20毫升RPMI1640完全培养基和1,000单位/毫升IL-2，以去除非贴壁的T细胞和NKT细胞。在第七天，使用NK细胞特异性标记物，通过流式细胞术检测小鼠NK细胞的纯度，所用样本中CD3阴性且NK1.1阳性细胞比例应超过95%。为分离外周血单个核细胞（PBMCs），在50毫升锥形管中，将35毫升经半量稀释的细胞小心铺加于15毫升密度梯度液上。将梯度液在水平转子中以400 × g离心力、20°C条件下离心30分钟，离心过程中不使用刹车。按照文本方案纯化人原代NK细胞后，通过加入每毫升2微克的抗CD3抗体和每毫升2微克的抗CD56抗体来测定细胞纯度。将细胞在4°C下孵育20分钟。使用PBS洗涤细胞两次。然后通过流式细胞术分析细胞。NK细胞群体在细胞表面表现为CD56阳性，CD3阴性。将小鼠或人原代NK细胞悬浮于24孔板的孔中，每毫升培养基中加入5×10⁵个细胞及GFP慢病毒上清，MOI值分别为5、10和20。然后在含有聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或右旋糖酐的情况下，以1,000 × g离心培养板60分钟。随后，不倾去上清液，将细胞置于含5.2%二氧化碳的37°C培养箱中过夜培养。用 10 毫升 PBS 洗涤细胞后，使用含 IL-2 的 2 毫升 RPMI1640 培养基重悬细胞。在收获细胞的前一天，用每毫升 2.5 微克的抗 MKG2D 单克隆抗体包被 96 孔高蛋白结合力聚苯乙烯板，并在室温或冰箱中孵育过夜。次日，用 100 微升 PBS 每孔洗涤三次。通过轻轻敲击培养板使转导的 NK 细胞脱落，收集细胞后向 96 孔板的每孔加入 100 微升细胞悬液。激活后 16 至 18 小时，使用多通道移液器收集上清液。然后利用ELISA试剂盒中的重组细胞因子绘制标准曲线，并定量上清液中的细胞因子，例如γ-干扰素。为检测NK细胞活力，在转导后第四天，用10毫升冷PBS洗涤细胞两次。随后收集细胞，并使用XM5 7-氨基放线菌素D进行染色。使用流式细胞术测定转化后的NK细胞中坏死细胞的百分比，并根据文本方案分析数据。该图显示，与添加聚凝胺或多聚赖氨酸硫酸盐相比，将葡聚糖加入培养体系后，经重组IL-2孵育的人源NK细胞实现了更高的转导效率并提高了病毒滴度。如图所示，在小鼠NK细胞中也观察到类似结果，与聚凝胺或多聚赖氨酸硫酸盐相比，葡聚糖增强了慢病毒载体的转导效率。在本实验中，通过以 K562 和 YAC-1 细胞为靶细胞的铬释放实验，检测了经转导的原代 NK 细胞的细胞毒作用能力。与未转导的 NK 细胞相比，葡聚糖介导的 NK 细胞转导并未对转导后 NK 细胞的杀伤潜能产生负面影响。在此，将转导后的人原代 NK 细胞与 K562 细胞共培养 24 小时，收集上清液以检测干扰素 γ（Interferon Gamma）。结果表明，葡聚糖对转导的自然杀伤细胞产生细胞因子的能力没有影响。此外，独立验证显示，用抗NKG2DA10单克隆抗体包被的培养板激活的经葡聚糖处理的自然杀伤细胞仍能够产生干扰素γ。在进行该操作时，重要的是要记住对转导后的细胞进行离心。在完成该操作后，其他方法（如转染）可能对于回答更多问题具有重要意义，例如如何提高基因递送效率。该技术一经建立，便为免疫学领域的研究人员探索自然杀伤细胞（NK细胞）中的基因操作铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何对NK细胞进行转导。

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免疫学与感染

葡聚糖增强小鼠和人原发性 NK 细胞的慢转导效率

我们提出了一种优化的高通量核转染方案，可高效转染人原代单核细胞来源的树突状细胞，导入质粒DNA或siRNA，且不会诱导细胞成熟。我们进一步提供了成功沉默靶基因RIG-I的证据，其mRNA水平和蛋白水平均显著下调。...

高效转染树突状细胞且不诱导细胞成熟的优化方案

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP...

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

慢病毒是研究基因功能的重要研究工具；然而，研究人员可能希望避免产生编码已知或疑似癌基因的泛嗜性慢病毒。作为替代方案，我们提出了一种更安全的策略，即在经过改造以表达嗜鼠性病毒受体 mSlc7a1...

利用聚合物复合的嗜生态慢病毒转导人细胞以增强生物安全性

本视频展示了一种用于评估阳离子聚合物介导的自然杀伤（NK）细胞病毒转导的实验方法。将细胞与编码荧光蛋白的转基因慢病毒载体共同孵育。加入阳离子聚合物可促进病毒与细胞结合，并将其RNA整合到宿主基因组中，从而表达荧光蛋白。通过定量荧光信号来评估聚合物对转导效率的增强作用。...

利用阳离子聚合物增强自然杀伤细胞中的病毒转导

本实验利用逆转录病毒转导和串联转染技术，构建一种可在无四环素条件下表达慢病毒载体（LV）各组分的细胞系。该慢病毒载体编码绿色荧光蛋白（GFP），并假型化携带一种糖蛋白SVGmu，后者特异性识别树突状细胞表面的受体。...

一种受四环素调控的细胞系可产生高滴度慢病毒载体，特异性靶向树突状细胞

本文提供了一种在小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中表达荧光融合蛋白的详细实验方案。该方法基于利用逆转录病毒载体转导骨髓前体细胞，随后将其分化为巨噬细胞和树突状细胞。 体外.

小鼠骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞中荧光融合蛋白的表达

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

本文介绍了一种用于逆转录病毒过表达及小鼠B-1a细胞过继转移的方法，以研究B-1a细胞在体内的迁移与定位。该方案可进一步扩展用于多种下游功能检测，包括定量分析供体B-1a细胞的定位，或在过继转移后检测供体细胞衍生的分泌因子。...

在小鼠B-1a细胞中通过逆转录病毒过表达CXCR4并进行过继转移，以实现B-1a细胞向骨髓的靶向迁移及IgM的产生

本方案描述了从小鼠胸腺中分离双阴性胸腺细胞，随后进行逆转录病毒转导，并在表达Delta样配体4的骨髓基质细胞系共培养系统（OP9-DL4）上进行共培养，以进一步开展功能分析。...

在表达Delta样4的基质细胞上共培养和转导小鼠胸腺细胞以研究T细胞白血病中的癌基因

本方案展示了如何在3D和2D培养条件下，从人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）中分化出具有轻度细胞毒性的CD3−/CD45+CD56+细胞。该方法可在不破坏复杂微环境的前提下，实现常规的表型验证。...

从人类扩展潜能干细胞生成自然杀伤细胞

我们展示了一种逐步研究腹膜组织驻留巨噬细胞中基因功能的实验方案 体内，使用慢病毒载体。...

用于高效调控腹腔组织基因与微小RNA的慢病毒载体制备&#45;组织驻留巨噬细胞 体内 在小鼠中

了解葡聚糖增强慢病毒转导技术在小鼠和人原代NK细胞中的应用。该方法显著提高基因转导效率，同时保持NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生能力，为免疫治疗研究提供可靠工具。

右旋糖酐提高小鼠和人原代NK细胞的慢病毒转导效率

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