器官培养和鼠标沃尔弗导管的全山免疫染色

这种器官培养和全安装免疫荧光方法的总体目标是更好地可视化和理解 Wolffian 诱导卷曲和发育的过程。该方法将有助于回答发育生物学领域中有关器官形状、结构和功能发育所涉及的机制的关键问题。该技术的主要优点是它模拟体内系统，并且比缺乏生态位因子的细胞培养研究提供更准确的信息。

在受孕后第 15 天的中午之前，将怀孕的小鼠仰卧位放在吸收性纸巾上，并用 70% 乙醇喷洒腹部腹侧。使用镊子，提起动物腹侧的下腹部皮肤，并使用手术剪刀做一个从泌尿生殖道开口延伸到胸腔的侧切口。用镊子抓住子宫颈上方的膀胱，然后在子宫内切开一个切口。

握住膀胱，在子宫宽韧带和子宫输卵管交界处切开，将子宫从肌腱旁附着处分离。将子宫放入含有冰冷 HBSS 的 50 毫升管中，轻轻搅动组织以去除多余的血液。将冲洗过的子宫转移到含有新鲜冰冷 HBSS 的培养皿中，并在冰上切割子宫壁以去除胚胎，将它们放入新的培养皿中，并在收获时将新鲜的 HBSS 放在冰上。

将胚胎的侧面放在新培养皿中乙醇浸泡的无菌薄纸上。并使用无菌刀片在动物的下腹部做一个对角线切口。将胚胎沿脊柱固定在无菌海绵底座上，并在解剖立体显微镜下移动胚胎。

小心地沿腹侧中线切开，去除肝脏和肠道。泌尿生殖系统现在应该可见。在输精管上切开一个切口，关闭其尿道附件。

随后是一个切口，认为将 Wolffian 导管的下部连接到胸管上，以收获睾丸和 Wolffian 导管。收集组织时，将组织放入新的培养皿中，将新鲜的 HBSS 放在冰上。要培养胚胎性腺嵴，首先每孔向 24 孔细胞培养板中加入 300 微升培养基。

接下来，将一小滴无菌 HBSS 加入新的培养皿中，并将 0.8 微米的聚碳酸酯轨道蚀刻膜放在液滴上，闪亮的表面朝向 HBSS。始终将膜放在 HBSS 液滴的顶部，以保持组织水分，膜的粗糙面朝上。使用干净的镊子，将两个生殖器脊放在膜的粗糙面上，组织不要相互接触。

并使用无菌湿巾去除多余的 HBSS。当您将生殖器脊转移到膜上时，在镊子的两个臂之间拾取样本，注意在转移后从膜上去除任何多余的 HBSS，以防止 Wolffian 管的囊性生长。然后将膜放入 24 孔板的一个孔中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养耳培养基界面的组织，每天更换总培养基，持续三天。

到培养的第四天，展开的 Wolffian 导管将转变为高度曲折的管。为了固定组织以进行全安装免疫荧光，将带有培养的性腺和 Wolffian 导管的膜转移到含有冰冷 PBS 的新培养皿中。膜将漂浮在 PBS 上。

使用镊子尖端使膜下沉。并将培养的性腺组织转移到 4% 多聚甲醛中。固定后，在室温下轻轻摇动，在 PBS 和 Triton X 中洗涤 3 次，每次 10 分钟

然后将组织在分级乙醇系列中脱水 10 分钟，每次浸泡 4 摄氏度，每分钟旋转 30 次。要在浸泡之间切换样品，请让组织在脱水的最后两分钟内沉降。然后在不接触组织的情况下去除尽可能多的酒精，并加入下一个更高浓度的乙醇。

最后一次脱水后，如刚才所示，在逆向分级的乙醇系列中对组织进行再水化。然后在室温下用 PBS 加 Triton X 洗涤组织 4 次，持续 20 分钟。每次洗涤每分钟 30 转。

在室温下用印迹缓冲液封闭组织 1 小时，然后在 4 摄氏度下孵育过夜，并在感兴趣的一抗中每分钟旋转 30 次。第二天，在吐温下用 PBS 加脱脂奶粉洗涤组织 4 次，每次洗涤 30 分钟，每次洗涤每分钟旋转 30 次。最后一次洗涤后，用适当的二抗在室温下标记组织 1 小时，缓慢摇动并避光。

然后仅在 PBS 加补间中洗涤组织 3 次。并通过免疫荧光显微镜分析样品。在开发过程中，沃尔夫风管发生了重大变化，其中一个简单的直管变成了一个高度复杂的盘绕风管。

为了剖析 Wolffian 导管形态发生所涉及的分子机制，培养基中可以补充靶向不同信号通路的抑制剂和激活剂。例如，该 Wolffian 导管在 1 到 信号特异性抑制剂存在下培养 3 天后保持展开。一条显然参与卷曲的通路。

Wolffian 导管的全安装免疫染色揭示了细胞角蛋白-8 的表达，以及 PH3 阳性增殖细胞和三天培养组织的存在，以及 β 连环蛋白在受孕后第 18.5 天新鲜分离的整个安装组织中的表达。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在每个胚胎大约 5 到 10 分钟内完成。通过遵循此程序，可以在培养器官上测试药物或激素，以回答有关这些药物对特定性腺组织的直接影响的其他问题。

在尝试此程序时，重要的是要记住不要直接用镊子抓住生殖器脊。该技术发展后，为发育生物学领域的研究人员探索生殖系统先天性异常和异常发育的机制铺平了道路。看完这个视频后，您应该对如何培养外邦人脊和进行整体免疫荧光有很好的了解。

不要忘记，与多聚甲醛一起工作可能非常危险，并且在处理这种材料时应始终佩戴个人防护设备。