Name: 器官培养和鼠标沃尔弗导管的全山免疫染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习小鼠沃尔弗导管器官培养与全山免疫染色技术，用于发育生物学研究。该方法模拟体内环境，可精确观察导管卷曲与分化过程，为器官形态发生机制提供可靠实验手段。

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我们感谢妇科肿瘤学组成员对本文稿的审阅。本工作部分得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会、澳大利亚研究理事会以及新南威尔士州癌症研究所（P.S.T）的资助。M.K. 获得了纽卡斯尔大学研究生研究奖学金。

动物护理和实验操作均遵循纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会的指南，并符合新南威尔士州动物研究法、新南威尔士州动物研究条例以及《澳大利亚科学用途动物护理与使用规范》。所有在小鼠上进行的操作均经纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准。
1. 定时交配
<ol>
	<li>在光照周期即将结束前，将6至8周龄的雄性和雌性小鼠进行配对。</li>
	<li>每天清晨（上午8:00或更早）检查雌鼠是否有阴道栓存在。发现阴道栓的当天记为0.5 dpc（days post coitum）。</li>
	<li>将带有阴道栓的雌鼠转移至新笼子（不带雄鼠），并标记发现阴道栓的日期。</li>
</ol>
2. 小鼠胚胎性腺嵴的分离
<ol>
	<li>按照文献9所述方法并稍作修改，从15.5 dpc&#160;妊娠雌鼠中分离小鼠胚胎性腺嵴。</li>
	<li>应在中午之前完成解剖，因为妊娠雌鼠在下午即被视为进入妊娠的下一天&#160;。</li>
	<li>采用颈椎脱臼法（或根据机构动物伦理委员会批准的方案）处死15.5 dpc&#160;妊娠雌鼠。</li>
	<li>将小鼠仰卧置于吸水性纸巾上，并用70%乙醇喷洒腹部腹侧。</li>
	<li>用镊子提起下腹部皮肤（腹侧），使用手术剪沿侧向切开，从泌尿生殖孔延伸至肋骨末端。将皮肤向动物头部方向拉开，以暴露腹部。</li>
	<li>用手术剪剪开腹肌以暴露腹膜腔。用镊子夹住子宫颈上方的妊娠子宫并剪开。然后握住膀胱提起子宫，剪断子宫阔韧带，再在子宫输卵管交界处进行剪切，使子宫脱离腹膜附着。</li>
	<li>将子宫转移至含有冰上预冷的HBSS（Hank's平衡盐溶液）的50 mL离心管中。用冰上预冷的HBSS轻轻冲洗妊娠子宫，以去除多余血液。</li>
	<li>将子宫置于含有冰上预冷HBSS的培养皿中并保持在冰上。切开子宫壁，取出胚胎，并将胚胎置于另一盛有HBSS并置于冰上的新鲜培养皿中。</li>
	<li>取一张洁净无菌的纸巾，铺在新的培养皿中，并喷洒70%乙醇。将胚胎侧向放置于该纸巾上，使用无菌刀片沿图1中虚线所示方向从下腹部切开。</li>
	<li>用针固定脊柱，将胚胎固定在无菌海绵基座上。</li>
	<li>将其置于解剖体视显微镜下，沿腹侧中线小心剪开。移除肝脏和肠道。此时应可见小鼠泌尿生殖系统（肾脏、输尿管、睾丸、Wolffian管及输精管）。</li>
	<li>切除睾丸和Wolffian管，并将其置于盛有HBSS并置于冰上的新鲜培养皿中。取出Wolffian管和睾丸时，需在输精管与尿道连接处附近剪断，并剪断Wolffian管下部与引带之间的连接。</li>
	<li>将同组胚胎的睾丸和Wolffian管合并收集（具体分组可根据实验设计而定）。</li>
</ol>
3. 胚胎性腺嵴的培养（图2）
<ol>
	<li>通过在DMEM/F12培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺，配制用于培养胚胎性腺嵴的培养基。将培养基在水浴中预热至37 °C。</li>
	<li>向24孔细胞培养板的每孔中加入300 µL培养基。</li>
	<li>取一个新的培养皿，在其中滴加少量无菌HBSS。将一张聚碳酸酯核孔膜（0.8 µm）置于HBSS液滴上，使其&#160;光亮面朝向HBSS。</li>
	<li>使用洁净的镊子将两根WDs和性腺放置在膜的粗糙面（朝上），并用无菌擦拭纸或吸水纸尽可能吸除多余的HBSS。切勿用吸水纸接触组织，否则会损伤组织。</li>
	<li>确保WDs与性腺之间互不接触，否则在后续孵育过程中它们会粘连在一起。</li>
	<li>将带有组织的膜转移至含有300 µL培养基的24孔板孔中，在气液界面进行培养。膜上培养基过多会导致WDs出现囊状生长。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育。</li>
	<li>每天更换培养基。使用移液器更换培养基时，先将孔中的旧培养基吸出，再加入300 µL预热的新鲜培养基。 
	注意：若需研究不同信号通路对WD形态发生的影响，可将相应浓度的化学激活剂和/或抑制剂加入培养基中。</li>
	<li>培养组织3天。来自15.5 dpc&#160;胚胎的未盘绕WDs在3天内可转变为高度盘曲的管状结构（图3B）。加入Wnt抑制剂IWR1&#160;后，WDs的盘绕过程受到抑制（图3C）。</li>
	<li>收获组织时，准备一个盛有冰冻PBS的培养皿。将培养后的性腺和WD连同膜一起转移至该培养皿中。膜会漂浮在PBS表面，轻压使其沉入PBS，然后取出性腺和WD。</li>
	<li>用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C过夜或在室温下固定1小时。如需，可在固定前拍摄WDs的明场图像。</li>
</ol>
4. 全胚胎免疫荧光染色
<ol>
	<li>在室温下，用 PBS-T（PBS + 1% Triton X-100）轻轻振荡洗涤固定组织，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，用梯度乙醇（25%、50%、75% 和 100%）对组织进行脱水处理，每步 10 分钟，同时轻轻振荡（约 30 rpm）。此步骤中，组织可在 75% 乙醇中于 4 °C 保存。
	<ol>
		<li>更换乙醇时，静置组织 2 分钟使其沉降，尽可能吸除上清液，然后加入下一浓度更高的乙醇。为避免损伤组织，移液器吸头在任何阶段均不得接触组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水完成后，在 4 °C 条件下，用梯度乙醇（100%、75%、50% 和 25%）对组织进行复水处理，每步 10 分钟，同时轻轻振荡。</li>
	<li>用 PBS-T（PBS + 0.1% Triton X-100）在室温下轻轻振荡洗涤组织 4 次，每次 20 分钟（约 30 rpm）。</li>
	<li>用封闭缓冲液（PBS + 1% BSA + 0.2% 脱脂奶粉 + 0.3% Triton X-100）在室温下封闭组织 1 小时。</li>
	<li>封闭后，将组织转移至一抗溶液（用封闭缓冲液稀释）中，于 4 °C 轻轻振荡孵育过夜&#160;（约 30 rpm）。所用一抗的稀释比例详见材料表。</li>
	<li>次日，用 PBS-MT（PBS + 2% 脱脂奶粉 + 0.5% Tween-20）在室温下轻轻振荡洗涤组织 4 次，每次 30 分钟（约 30 rpm）。</li>
	<li>完成上述洗涤步骤后，将二抗按 1:250 的比例（此步骤需根据具体抗体进行优化）溶于封闭缓冲液中，加入组织并室温孵育 1 小时，同时轻轻振荡。</li>
	<li>从此时起，需用铝箔覆盖组织以避光，因为二抗标记的荧光染料对光敏感。</li>
	<li>用 PBS-T（PBS + 0.1% Tween-20）轻轻振荡洗涤组织 3 次，每次 30 分钟&#160;。</li>
	<li>准备载玻片以封片染色后的组织。
	<ol>
		<li>为此，使用金刚石笔将盖玻片切割成细条，并用指甲油将两条细条叠加粘附于载玻片上，形成两个边界，将组织置于两边界之间。</li>
		<li>加入含 DAPI 的封片剂，盖上盖玻片，并在盖玻片四角涂抹指甲油以固定。 
		注意：组织现已准备好用于成像。将这些载玻片于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian%2Fepididymal+duct%2C+more+twists+and+turns%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li>
<li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian%2Fepididymal+duct+by+using+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li>
<li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li>
<li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Wnt%2F%CE%B2catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li>
<li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li>
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<li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343(2015).</li>
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<li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li>
<li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

器官培养系统相较于传统细胞培养系统具有诸多优势。该系统可保留不同类型细胞之间原有的结构关系和相互作用，能够模拟 体内 相较于缺乏微环境因素的细胞培养研究，类器官培养系统能提供更准确的信息，甚至比使用整体动物还具优势。这些优势包括使用整体动物的成本较高，而类器官培养系统则易于护理和维护。 等等。 此外，可在离体或培养的器官上测试多种药理学试剂或药物，从而研究器官本身的直接反应，而非整个机体的反应。
要成功培养胚胎期肾单位（WDs），需考虑若干关键步骤。组织采集时必须小心操作，避免破坏其完整性，因为受损的组织生长不良且易形成囊肿。滤膜表面培养基过多也会导致肾单位出现囊性生长。我们在组织培养超净台外进行组织分离和培养，未发生任何污染。培养基的配制及添加至24孔板的操作在组织培养超净台内完成。因此，只要采用适当技术、操作迅速并采取必要预防措施，在超净台外采集的肾单位仍可无污染地进行培养。收获培养后的组织时应格外小心，因其极为脆弱，不可直接用镊子夹取。应使用镊子两臂之间形成的薄层PBS液体将组织轻轻拾起。
<p class="jove_conten...

雄性生殖系统主要由睾丸（生精细胞发育和分化的场所）以及一个复杂的导管系统组成，后者负责精子的成熟、运输和储存。附睾是一种连接睾丸与输精管的管状器官，主要参与睾丸后生精细胞的发育与成熟1。成年小鼠高度盘绕的附睾由一条简单而笔直的前体导管——中肾管（Wolffian duct, WD）发育而来1。附睾复杂的盘绕结构对于精子获得受精能力至关重要2。然而，目前对这一影响雄性生育能力的关键器官如何发育并形成其特定形态仍缺乏充分理解。已有研究表明，多种信号通路参与了中肾管的发育过程，例如Wnt信号通路3,4和雄激素信号通路5。我们近期的研究已证实，产前发育过程中中肾管盘绕依赖于Wnt信号的平衡&#160;4。然而，仍需进一步研究以阐明出生后附睾盘绕的机制、附睾上皮细胞的分化过程，以及上皮细胞之间和上皮细胞与间质细胞之间的细胞间通讯。
转基因小鼠模型已被证实是识别和验证多种器官系统发育及疾病相关分子机制的有力工具 6尽管转基因小鼠模型被广泛使用，但其仍存在显著局限性，包括：靶向突变小鼠的表型与预期基因功能不符，某些模型中基因敲除突变体无表型，遗传和环境因素的影响，以及小鼠模型构建过程耗时耗力。因此，仅基于转基因小鼠模型所得结果的意义解读并不总是一目了然 6这些局限性可通过使用 体外 器官培养系统，可在受控的培养条件下实时灵活操控多种信号通路。该系统对于研究完整器官的生理学与病理学具有重要作用 7此外，对经荧光标记抗体染色的完整器官进行成像，可使我们能够在三维环境中可视化目标标志物，正如其真实存在状态所示 体内 从而更深入地理解器官的形态、结构和功能 8.
本文描述了小鼠胚胎性腺隆起的分离方法， 体外 培养&#160;以及对输尿管芽进行整体免疫荧光成像，可用于回答有关输尿管芽等管状器官形态发生过程中的多种问题。在本方案中，我们从交配后15.5天（dpc）的孕鼠中分离出胚胎期泌尿生殖嵴，并进行为期3天的培养&#160;随后进行免疫染色，检测上皮细胞标志物（细胞角蛋白8，CK8）、细胞增殖标志物（磷酸化组蛋白3，PH3）以及活化型β-catenin。

<table><tbody><tr><td>24孔板</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>可从其他供应商购买</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s平衡盐溶液（HBSS）</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>可从其他供应商购买</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>使用前在37 &amp;deg;C水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Interpath,&amp;nbsp; 澳大利亚</td><td>SH30034.02</td><td>培养基中使用10% FBS</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>使用浓度为1%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>使用浓度为1%</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore 聚碳酸酯径迹蚀刻膜&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>膜（0.8 &amp;micro;m）</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>使用浓度为100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>储备液为16%，使用时配制成PBS中4%。有毒——需戴手套操作，且&lt;br/&gt; 不可排入水槽</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>纯乙醇，用超纯水配制25%、50%和75%溶液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>黏度高，分装时需小心</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>黏度高，分装时需小心</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>可从其他供应商购买</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>可从其他供应商购买</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>可从其他供应商购买</td></tr><tr><td>细胞角蛋白8/Troma I</td><td>发育研究杂交瘤库，美国（DHSB）</td><td>TROMA-I</td><td>封闭液中稀释1:250</td></tr><tr><td>活化 &amp;beta;连环蛋白&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>封闭液中稀释1:200</td></tr><tr><td>磷酸化组蛋白3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>封闭液中稀释1:200</td></tr><tr><td>Alexa488 山羊抗兔IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>封闭液中稀释1:250</td></tr><tr><td>Alexa594 山羊抗大鼠IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>封闭液中稀释1:250</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>可从其他供应商购买</td></tr><tr><td>正丙基没食子酸酯</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-甲脒（DAPI）</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>用于核酸（DNA）染色</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>盖玻片（24 × 50 mm）</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

小鼠中肾管的器官培养与整体免疫荧光染色

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

输卵管形态发生是大多数哺乳动物器官发育的基本要求，包括雄性生殖系统。附睾作为雄性生殖道的重要组成部分，负责精子的储存、成熟和运输。成年附睾是一条高度盘绕的管道，起源于一种简单而笔直的胚胎前体结构，称为中肾管（Wolffian duct, WD）。附睾的正常盘绕对雄性生育能力至关重要，因为睾丸中的精子尚不具备使卵子受精的能力。然而，附睾发育与盘绕的机制仍不明确，部分原因在于缺乏完整的器官培养与成像方法。在本研究中，我们描述了一种体外（in vitro）培养系统及整体免疫荧光染色方案，可更清晰地观察中肾管盘绕与发育过程，该方法也可应用于其他管状器官的研究。

在发育过程中，输尿管芽（WD）经历显著变化，从一个简单且笔直的管道转变为高度复杂且盘绕的导管结构。利用上述方法，在体外培养条件下，WD也经历了类似的变化。本文展示了输尿管芽在培养3天后的结果（图3为了研究参与WD形态发生的分子机制，可在培养基中添加针对不同信号通路的抑制剂和激活剂。 图3C 在含有Wnt信号通路特异性抑制剂IWR1的条件下培养3天后，显示WD未盘绕 10。箭头标记卷曲（图3B）和未缠绕的WDs（图3A 和 C) 表明Wnt信号通路的抑制会导致WD盘绕受阻（图3C因此，该培养系统可用于解析WDs（或其他器官）发育过程中涉及的分子机制。 
 
为了标记不同类型的细胞，我们对WDs进行了整体免疫染色图4)。本文展示了验证该方案用于标记细胞骨架、细胞质和细胞核蛋白的数据。 图 4A 显示了培养三天的WDs（箭头标记）细胞角蛋白8...

我们介绍了一种分离和培养小鼠中肾管（WD）的方法。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体对培养后或新鲜分离的中肾管进行整体免疫染色的详细操作步骤。这些技术相结合，可实现对中肾管发育、盘绕及分化过程的研究。

输卵管形态发生是大多数哺乳动物器官发育的基本要求，包括雄性生殖系统。附睾是一种……

本器官培养与整体免疫荧光方法的总体目标是更清晰地观察并深入理解中肾管诱导盘绕及发育的过程。该方法将有助于解答发育生物学领域中关于器官形态、结构和功能发育机制的关键问题。该技术的主要优势在于其能够模拟体内系统，相较于缺乏微环境因子的细胞培养研究，可提供更为准确的信息。在妊娠第15天中午之前，将怀孕小鼠仰卧置于吸水性纸巾上，并用70%乙醇喷洒腹部腹侧。用镊子提起动物腹侧下腹部的皮肤，使用手术剪做一个横向切口，从泌尿生殖道开口延伸至肋骨 cage。用镊子在宫颈上方夹住膀胱，并在子宫上做一切口。握住膀胱，切开子宫阔韧带及子宫输卵管连接处，以使子宫脱离韧带附着。将子宫放入含有冰冻 HBSS 的 50 毫升离心管中，轻轻振荡组织以去除多余血液。将清洗后的子宫转移至盛有新鲜冰冻 HBSS 并置于冰上的培养皿中，切开子宫壁取出胚胎，并在收获时将其放入另一盛有新鲜 HBSS 并置于冰上的新培养皿中。将胚胎侧放于新培养皿中经乙醇浸泡的无菌滤纸上，使用无菌刀片在动物下腹部进行斜向切口。沿脊柱方向将胚胎固定于无菌海绵基底上，并将其置于体视显微镜下。沿腹侧中线小心剪开，取出肝脏和肠道。此时应可见泌尿生殖系统。在输精管处做一剪口，并结扎其尿道连接处。接着切开附着于引带的中肾管下部，以获取睾丸和中肾管。将收集的组织置于新的培养皿中，并加入预冷的新鲜HBSS，置于冰上。培养胚胎性腺隆起时，首先向24孔细胞培养板的每孔中加入300 µL培养基。接下来，在一个新的培养皿中加入一滴无菌的 HBSS，并将一片孔径为 0.8 微米的聚碳酸酯径迹蚀刻膜放置在液滴上，使膜的光面朝向 HBSS。始终将膜置于 HBSS 液滴顶部，以保持组织湿润，同时确保膜的粗糙面朝上。使用洁净的镊子将两个生殖嵴放置在膜的粗糙面上，注意使组织彼此不接触。使用无菌擦拭纸去除多余的HBSS。在将生殖嵴转移至膜上时，用镊子的两个臂之间夹取样本，并注意在转移后去除膜上多余的HBSS，以防止中肾管发生囊性生长。然后将膜放入24孔板的一个孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下于培养基-空气界面培养组织，每天完全更换培养基，持续三天。培养至第四天时，未盘绕的中肾管将转变为高度盘曲的管状结构。为进行整体免疫荧光染色固定组织，需将带有培养性腺和中肾管的膜转移至含有冰冷 PBS 的新培养皿中。这些膜会漂浮在 PBS 液面上。用镊子尖端将膜组织浸入。将培养的性腺组织转移至4%多聚甲醛中。固定后，在含Triton X的PBS中于室温轻轻振荡洗涤三次，每次10分钟。然后在4摄氏度、每分钟30转的条件下，将组织依次浸入梯度乙醇中脱水，每次浸入持续10分钟。在每次脱水步骤的最后两分钟，让组织自然沉降以进行样本转移。随后在不接触组织的前提下尽可能吸除酒精，并加入下一更高浓度的乙醇。最后一次脱水后，按上述相同方法将组织在梯度递减的乙醇溶液中重新水化。随后将组

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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本视频介绍了对完整的前列腺癌类器官进行免疫荧光染色，并通过整体封片共聚焦显微镜成像的技术。该技术旨在评估基底细胞和腔内前列腺上皮细胞的体外分化能力。...

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本文所述的间接免疫荧光实验方案可用于检测和定位小鼠乳腺组织中的蛋白质。文中提供了完整的实验方法，包括乳腺组织样本的制备、免疫组织化学染色、荧光显微镜下组织切片的成像，以及图像的重建。...

小鼠乳腺组织冰冻切片的间接免疫荧光染色

的 离体 直立液滴培养是现有方法的一种替代方案 体外 和 体内 实验技术。该方案易于操作，所需试剂用量较少，同时能够操控并研究胎儿的血管形成、形态发生和器官发生。...

使用 离体 直立式液滴培养法培养小鼠胎儿完整器官以研究器官发生过程中的发育机制

本文介绍了一种无需连续切片即可定量培养后幼鼠卵巢中卵泡数量的实验方案。通过全器官免疫荧光染色结合组织透明化技术，以光学切片取代物理切片。该样品制备与成像方法可保持器官完整性，并有助于对特定细胞进行自动化定量分析。...

培养小鼠卵巢的全组织免疫荧光及卵泡定量

基因工程小鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。本文介绍了一种从小鼠泌尿生殖系统中识别并分离前列腺叶的方案，基于组织学特征对其进行区分，并分离和培养原代前列腺细胞 体外...

小鼠前列腺叶的鉴定、组织学表征及用于体外三维球体培养模型的分离

本文描述了四种利用新生小鼠睾丸原代细胞生成睾丸类器官的方法，即细胞外基质（ECM）依赖性和非依赖性的二维（2D）及三维（3D）培养环境。这些技术具有多种研究应用价值，尤其适用于体外研究睾丸的发育过程和生理功能。...

基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

本方案描述了利用透射 illumination...

透射光辅助分离小鼠生精上皮周期特定阶段用于后续免疫染色分析

本方案介绍了一种优化的小鼠成年雌性尿道上皮层分离方法，可用于后续分析，包括流式细胞术、免疫染色和类器官培养。实验结果表明，该方法可获得富集且具有活性的尿道上皮细胞，流式细胞术分析、整体组织成像以及高效的类器官形成均证实了这一点。...

一种优化的小鼠女性尿道上皮分离方法用于单细胞及免疫荧光分析

腭发育研究的动力源于腭裂的发生率，腭裂是一种出生缺陷，会给患者带来巨大的健康负担，并可能导致持久的畸形。本文展示了一种培养腭突的技术，可用于研究参与腭发育及融合过程中的不同信号通路。...

利用静态器官培养研究腭融合的方法

学习小鼠沃尔弗导管器官培养与全山免疫染色技术，用于发育生物学研究。该方法模拟体内环境，可精确观察导管卷曲与分化过程，为器官形态发生机制提供可靠实验手段。

小鼠中肾管的器官培养与整体免疫荧光染色

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