Name: 表征形态变化的议定书艰难梭菌应对抗生素治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 了解扫描电子显微镜结合体外细胞培养技术用于研究艰难梭菌对抗生素的形态学反应。该方法可详细观察抗生素杀菌作用，为优化CDI治疗策略提供依据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

这些实验得到了默克公司和Summit PLC研究资助的支持。

1. 从不同环境或临床来源分离 C. difficile
<ol>
	<li>环境分离物：使用预先灭菌的棉签（用0.85% NaCl轻微润湿），擦拭任何目标区域的表面（地面、门、把手、货架） 等。).8 确保佩戴无菌手套，采样完成后将拭子放入无菌管中。</li>
	<li>临床分离株（粪便）：使用接种环将10至100 mg临床粪便样本划线接种于头孢西丁-环丝氨酸-果糖琼脂（CCFA）平板，于严格厌氧条件下培养48–72小时。保存分离的单个菌落于 C. difficile 将样品分装至冻存管中，于 -80 °C 保存，以备后续分析。7,9,10</li>
	<li>将环境拭子样本在含0.05%牛磺胆酸钠的脑心浸液（BHI）肉汤中增菌，置于37 °C厌氧环境中培养5天。取1 mL培养物在10,000 x g离心，将沉淀重悬于100 µL乙醇中。</li>
	<li>将重悬的细胞（50 µL）接种至环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（CCFA）平板上，置于厌氧培养箱中，37 °C 培养 40–48 小时。保存分离的菌落于 C. difficile 将样品分装至冻存管中，于 -80 °C 保存，以备后续分析。</li>
	<li>测试疑似 C. difficile 使用乳胶凝集试剂或PCR鉴定菌落。</li>
</ol>
2. C. difficile 的培养及杀灭动力学实验步骤
<ol>
	<li>在厌氧培养箱中，将纯化的环境或临床来源的 C. difficile 菌株接种于血琼脂平板上，37 °C 培养 48 小时。</li>
	<li>用接种环挑取一个单菌落，转移至含有 5 mL BHI 培养基的 15 mL 离心管中，在厌氧培养箱中 37 °C 培养 24 小时。</li>
	<li>将预培养物按 1:100 比例稀释至约 106 个菌落形成单位（CFU）/mL，稀释液为新鲜预还原的 BHIS 培养基（BHI 加 5 g/L 酵母提取物和 1% L-半胱氨酸），并添加 0.1% 牛磺胆酸钠及适当浓度的抗生素（T0 时点）。</li>
	<li>在每个时间点（T0、T6、T24、T48），用移液器吸取 1 mL 样品，取少量等分试样（100 µL，进行系列稀释）涂布于血琼脂平板上。将平板置于厌氧培养箱中，37 °C 培养 48 小时，计数形成的菌落数量以确定 CFU。</li>
</ol>
3. 扫描电子显微镜样品制备
<ol>
	<li>在微量离心管中收集每个时间点的1 mL细胞，于10,000 × g离心10分钟。弃去上清液，并用PBS洗涤细胞。</li>
	<li>再次于10,000 × g离心样品10分钟，弃去上清液。将细胞重悬于1 mL的4%多聚甲醛中，在室温下孵育1小时。</li>
	<li>再次于10,000 × g离心样品10分钟，弃去上清液。用蒸馏水洗涤细胞两次，然后重悬于100 µL蒸馏水中。根据溶液的浊度调整体积。 
	注意：建议进行多个连续稀释。</li>
	<li>标记盖玻片，并在其上加入40 µL样品。在通风橱中孵育15分钟，使液体蒸发，并使细胞附着于盖玻片上。若仍有液体残留，可使用吹风机去除。</li>
	<li>将带有细胞的标记盖玻片放入台式溅射仪中并固定。将纯金安装至溅射仪内。开启仪器，在低压（50 mTorr）下开始溅射。在80 mA条件下溅射30秒，相当于形成20 nm厚的金涂层。</li>
	<li>将镀膜后的样品转移至扫描电子显微镜中进行观察。</li>
</ol>
4. 在扫描电子显微镜下成像 C. difficile 细胞
<ol>
	<li>通过点击计算机软件上的“vent”按钮，正确对扫描电子显微镜（SEM）进行放气。</li>
	<li>使用碳导电胶带将镀膜的盖玻片固定在金属载物台上。当SEM完成放气后，舱门应能轻松打开。通过旋转将金属载物台锁入SEM腔室中。</li>
	<li>点击计算机软件上的“PUMP”按钮。当系统显示&#34;Vac OK&#34;时，SEM即可使用。</li>
	<li>在探测器选项卡下点击SE探测器。点击显示电压的按钮以开启电子束。成像时先从较低电压（5 kV）开始，再逐步升高电压（最高至15 kV）。开启电子束后，图像将出现在屏幕上。</li>
	<li>利用追踪功能，在镀膜的盖玻片上寻找待成像区域。放大目标区域并寻找杆状结构；这些即为clostridium difficile。</li>
	<li>进一步放大并聚焦图像以校准系统。此步骤应在多个工作距离下进行：15 mm、9 mm 和 5 mm。最终在5 mm的工作距离下获取图像。</li>
	<li>开启超高清成像模式，并开始聚焦及优化像散。</li>
	<li>在高倍率下开始聚焦。使用粗调和微调聚焦开关进行操作。同时调整像散，以获得更清晰的图像。
	<ol>
		<li>在高倍率下调整像散。为此，调节像散控制开关（其外观与粗/微聚焦开关相似），并通过计算机软件中的数字放大功能检查图像清晰度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用慢扫描功能采集高质量图像。将采集的图像保存为.TIFF文件，用于后续分析。若分析过程中需要进行测量，请确保选中数据标尺栏。</li>
	<li>通过手动旋转SEM上的倾斜角度，采集不同角度的图像（最大可达52°）。倾斜成像通常能提供更多深度信息。</li>
	<li>根据所成像的细胞类型调整电子束电压。所有实验中，电压应主要保持在5–15 kV范围内。</li>
	<li>成像完成后，关闭电子束并将工作距离提升至20 mm。随后可对腔室放气并取出载物台。将所有图像复制到存储设备中，用于进一步分析。</li>
</ol>
5. 图像处理与分析
<ol>
	<li>下载并安装免费提供的软件 FIJI（http://fiji.sc）到计算机上。</li>
	<li>在 FIJI 中打开图像文件。</li>
	<li>使用直线工具，精确地沿标尺（scale bar）描迹。</li>
	<li>点击 FIJI 程序中的“Analyze”选项卡，然后选择“Set Scale”功能。此时将弹出一个窗口，要求根据标尺设置已知距离。同时更改长度单位，然后点击“OK”。</li>
	<li>完成距离校准后，使用直线工具测量细胞长度。为获得长度值，需用直线工具完整描迹整个细胞。再次选择“Analyze”选项卡，然后点击“Measure”。长度值将以先前设定的单位显示。</li>
</ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li>
<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

KWG 过去和现在均获得默克公司（Merck &amp; Co.）和 Summit, PLC 的研究资助。

本研究的目的是建立一种高通量方法，用于分离C. difficile并利用扫描电子显微镜（SEM）检测其对抗生素的敏感性，从而更全面地表征抗生素的药理作用。通过采用此处所述的实验方案，我们已证明，对细胞在抗生素处理后的表型反应进行成像，能够揭示药物药理作用的深入信息。总体而言，在收集细胞后，该方案的成像部分大约需要2小时，但其分辨能力远高于传统的杀菌动力学研究。尽管学习使用扫描电子显微镜在技术上具有一定挑战性，但样品制备过程相对简单且快速。我们认为，本文所述的这些实验方案将为评估抗生素治疗的药理作用提供一种客观的方法。
鉴于抗生素杀菌曲线之间的相似性（图2），我们试图确定细胞对药物处理的反应是否存在差异。通过扫描电镜（SEM）分析，我们发现甲硝唑在高于最低抑菌浓度（supraMIC）时对细胞长度产生影响。尽管这些表型此前未见报道，但它们与抗生素的作用机制一致，提示其对细胞代谢和生长具有影响。相比之下，万古霉素对细胞壁具有显著影响，这也与其已知的作用机制相符。13 尽管这些抗生素的杀菌动...

艰难梭菌 是一种革兰氏阳性、可形成芽孢的细菌，每年在美国导致约50万例感染，被美国疾病控制与预防中心（CDC）列为威胁等级最高的紧急病原体，即最高风险级别。1 过去十年中，针对具有抗菌活性的抗菌药物研发取得了显著进展 C. difficile.2,3体外 研究是药物开发过程中的必要组成部分。4 传统上， 体外 敏感性与时间-杀菌研究用于验证未来的动物实验及其他研究 体内 研究。
尽管这些方法在评估杀菌作用方面具有重要作用，但它们无法捕捉细胞对药物处理的表型响应。通过将扫描电子显微镜（SEM）与标准的杀菌动力学研究相结合，可以更全面地表征抗生素的直接效应。5,6,7 本文介绍了一种利用SEM来分析抗生素治疗效果的方法。

<table><tbody><tr><td>棉质纱布&amp;nbsp;</td><td>卡瑞</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>麦克朗</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>费尔康</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液培养基（BHI）&amp;nbsp;</td><td>准则</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>阿尔法埃瑟</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>准则</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>牛磺胆酸钠</td><td>阿尔法埃瑟</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>厌氧培养箱</td><td>科伊</td><td></td><td>乙烯厌氧培养箱</td></tr><tr><td>环丝氨酸-头孢西丁果糖琼脂（CCFA）平板</td><td>厌氧系统</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>血琼脂平板</td><td>哈迪诊断</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>乳胶凝集试剂</td><td>奥克oid</td><td>DR1107A</td><td>C. diff 检测试剂盒</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>艾本道夫</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>吉布科</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>菲舍尔科技</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>J. 梅尔文·弗里德品牌</td><td>7525M</td><td>75 × 25 mm</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>莱博康科</td><td>II 级 A2 型&amp;nbsp;</td><td>生物安全柜</td></tr><tr><td>桌面溅射仪</td><td>登顿真空</td><td>Desk II</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>塑料核心</td><td>05072-AB</td><td>SPI 双面导电碳胶带</td></tr><tr><td>金</td><td>登顿真空</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375&amp;rdquo; 直径 × 0.002&amp;rdquo; 厚金箔</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

一种表征形态学变化的实验方案 艰难梭菌 对抗生素治疗的响应

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

针对厌氧菌的新药研发中，评估抗生素作用具有较高难度且技术要求较高。为了深入了解可能的作用机制（MOA），可通过扫描电子显微镜（SEM）观察抗生素暴露后引起的形态学变化。将SEM成像与传统的杀菌曲线相结合，可能加深我们对药物作用机制的理解，并推动药物研发进程。为验证这一设想，本研究采用具有已知但不同作用机制的药物（万古霉素和甲硝唑）进行了杀菌曲线和SEM研究。C. difficile 细胞（R20291）在有或无抗生素的条件下培养长达48小时。在48小时的时间范围内，于多个时间点收集细胞，以评估抗生素效力并进行SEM成像。与既往报道一致，通过菌落形成单位（CFU）计数测定，万古霉素和甲硝唑在处理24小时后均表现出显著的杀菌活性。通过SEM成像分析发现，与对照组及万古霉素组相比，甲硝唑对细胞长度具有显著影响（每种抗生素均使其细胞长度减少超过&#62;50%；P&#60;0.05）。尽管此前尚未以这种方式系统记录过药物处理后的表型反应，但本结果与其已知药物作用机制相符，表明该成像与测量方法具有良好的通用性和可靠性，适用于其他实验性化合物的研究。

Clostridium difficile 是一种产孢细菌，因此在进行任何功能分析之前，确定营养细胞与孢子细胞之间的形态学差异至关重要。图1展示了在生长曲线对数期拍摄的代表性营养细胞和孢子细胞图像。如图所示，营养细胞呈细长、光滑的杆状结构，而孢子则为体积较小、外表面粗糙的椭圆形结构。从功能上看，营养细胞生长和分裂迅速，并通过分泌毒素介导C. difficile感染的致病性；而孢子通常处于休眠状态，代谢活性极低。因此，抗生素主要对营养细胞有效，而孢子由于具有多层保护结构包裹着含DNA的核心，且缺乏生理活性，通常对抗药物治疗。基于上述原因，大多数形态学分析均集中于营养细胞。11,12
抗生素杀灭曲线是用于证明抗生素对生长中细菌杀灭效果的标准方法。所用浓度基于艰难梭菌R20...

抗生素疗效通常通过进行杀菌动力学研究并测定菌落形成单位（CFUs）来确定。通过将扫描电子显微镜（SEM）与这些标准方法相结合，我们可以区分不同抗生素治疗的药理学效应。

针对厌氧菌的新药研发中，评估抗生素作用具有较大难度且技术要求较高。为深入了解……

该微生物成像方法的总体目标是提供一种更具描述性的手段，以区分药物治疗的表型效应。因此，该方法可在感染性疾病领域发挥重要作用，特别是用于观察特定抗生素对艰难梭菌的形态学影响及其杀菌机制。该技术的主要优势在于，它将高分辨率成像与体外细胞培养技术相结合，能够详细揭示药物的杀菌作用机制。该技术的应用前景可能延伸至艰难梭菌感染（简称CDI）的治疗领域，原因在于该方法可为阐明抗生素在治疗CDI中的潜在益处提供有效手段。尽管该方法可为药物作用机制提供见解，但也适用于其他系统，例如混合培养模型或体内动物研究。通常情况下，人们在使用这一新方法时会遇到困难，因为艰难梭菌的培养以及扫描电子显微镜的操作均具有挑战性。我们最初萌生这一方法的想法，是在尝试区分不同抗生素作用模式的过程中。今天，我想向您介绍您将见到的研究团队。Jahangir Alam 是一位教授兼微生物学家。他负责协调您今天将看到的所有实验室工作。塔斯努瓦·拉希德（Tasnuva Rashid）是本实验室的研究生，负责大量的日常微生物学工作。尤金妮·巴斯雷（Eugenie Bassere）是博士后研究员。她教会了塔斯努瓦许多技能，同时也在实验室中提供协助。布拉德·恩德雷斯是实验室的另一位博士后，他将在张龙的帮助下进行大量的显微镜工作。在佩戴无菌手套的情况下制备环境分离样本时，使用预先灭菌的棉纱布擦拭任意感兴趣区域的表面，例如地板、门、把手或架子。然后将拭子放入灭菌试管中。每处理一个样本之间需更换手套。为制备临床分离株，使用接种环将10至100毫克的临床粪便样本接种于头孢西丁环丝氨酸果糖琼脂（cefoxitin cycloserine fructose agar，CCFA）平板上，并在严格厌氧条件下培养48至72小时。将分离得到的艰难梭菌（C. Difficile）菌株菌落保存于冻存管中，置于-80摄氏度冰箱中以供后续分析。使用含0.5%牛磺胆酸钠的脑心浸液（brain heart infusion，BHI）肉汤对环境拭子样本进行增菌处理，并将样本置于37摄氏度的厌氧培养箱中培养5天。取1毫升培养物在10,000 × g条件下离心，用100微升乙醇重悬沉淀。取50微升重悬的细胞接种至CCFA平板，在厌氧环境中37摄氏度培养40至48小时。将分离的艰难梭菌菌株菌落保存于冻存管中，置于负80摄氏度冰箱中以备后续分析。使用乳胶凝集试剂或 PCR 检测疑似艰难梭菌（C.difficile）菌落。将纯化的环境或临床艰难梭菌（C.difficile）菌株接种于血琼脂平板上，在厌氧培养箱中 37 摄氏度培养 48 小时。用接种环挑取一个单菌落，转移至 15 毫升离心管中含 5 毫升 BHI 培养基的液体中。然后将培养物置于37摄氏度的厌氧环境中培养24小时。使用新鲜的、预先还原的添加了牛磺胆酸钠和适当浓度抗生素的BHIS培养基，将预培养物按1:100稀释，使其浓度约为每毫升10的6次方CFU。用移液器在每个时间点收集1毫升样品，并取少量等分试样接种或涂布于血琼脂平板上。将培养板置于37摄氏度的厌氧环境中孵育48小时，计数形成的菌落数量以确定菌落形成单位（CFUs）。在每个时间点收集一毫升细胞至微量离心管中，在10,000 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，并用PBS洗涤细胞。再次离心样品并弃去上清液。然后用1毫升4%多聚甲醛重悬细胞，在室温下孵育1小时。再次离心样品并弃去上清液后，用蒸馏水洗涤细胞两次，再将细胞重悬于100微升蒸馏水中。根据溶液的浑浊度调整体积。标记盖玻片后，向其上加入40微升样品。在通风橱内，将盖玻片孵育15分钟，使液体蒸发，并让细胞贴附于玻璃表面。如果仍有液体存在，请使用吹风机将其去除。将盖玻片放入台式溅射仪中，并用胶带固定。在溅射仪中固定纯金。然后开启设备，在低压条件下开始溅射。以80微安电流对样品镀膜30秒，相当于沉积约20纳米厚的金涂层。开始成像前，首先在计算机软件中点击“Vent”按钮，对扫描电镜进行正确放气。包被细胞后，将其转移至扫描电子显微镜（SEM）中。使用碳导电胶带将包被好的盖玻片固定在金属载物台上。当SEM腔体通气完毕后，门应可轻松打开。通过旋紧将金属载台锁定到扫描电镜腔室内。接着，在软件中点击“Pump”按钮。当系统反馈正常后，扫描电镜即可准备使用。在“探测器”选项卡下，单击SE探测器。通过点击显示电压的按钮来开启电子束。先在较低电压下开始成像，再逐步提高电压。打开光束后将出现图像。使用追踪功能，在镀膜的盖玻片上选择成像区域。放大该区域并寻找杆状结构，这些结构代表艰难梭菌。为校准系统，需放大图像，粗略聚焦，并将 Z 轴与自由工作距离关联。此步骤应在多个工作距离下进行，例如 15、9 和 5 毫米。然后切换至超高清分辨率成像模式。使用粗调和微调聚焦旋钮开始在高倍率下进行聚焦。调节像散校正旋钮以获得更清晰的图像，并通过计算机软件对图像进行数字放大，检查图像的清晰度。使用慢速扫描模式采集高质量图像。将采集的图像保存为 tiff 文件以供后续分析，并确保在分析过程中需要进行测量时选中数据栏。通过倾斜扫描电镜（SEM）的样品台，从不同角度采集图像，以获取更多的深度信息。在采集慢速扫描图像前，优化聚焦和像散。成像完成后，关闭电子束并将工作距离调至20毫米。随后对样品室通气，取出载物台。处理图像，在Fiji中打开图像文件。使用线条工具精确描记标尺。单击“分析”选项卡，然后选择“设定标尺”功能。此时将弹出一个窗口，要求根据标尺设置已知距离。同样更改长度单位，然后点击“确定”。最后，为了测量细胞长度，使用直线工具完整地沿细胞轨迹划线。再次选择“分析”选项卡，然后点击“测量”。长度应以先前标明的单位显示。这些图像展示了在生长曲线的指数生长期捕获的艰难梭菌营养细胞以及芽孢细胞。营养细胞呈长而光滑的杆状结构；而芽孢则为具有粗糙外表的小椭圆形结构。如图所示，对照组细胞生长并达到平台期；而经万古霉素和甲硝唑处理的细胞，其总菌落形成单位（CFU）下降至检测限，表明具有杀菌作用。结果表明，万古霉素和甲硝唑在高于最低抑菌浓度（MIC）的浓度下可有效杀灭艰难梭菌（C. difficile）。为展示扫描电镜（SEM）在成像艰难梭菌中的应用价值，对药物处理前后的细胞进行了成像，以确定其形态学变化。对于万古霉素，部分细胞的细胞壁受到影响，而经甲硝唑处理的某些细胞体积较小。为了检测细胞大小是否受到影响，使用 Fiji 程序分析了细胞长度。如本图像所示，在对照情况下，营养细胞的大小可能存在一定差异；但大多数细胞的长度约为 6 微米。然而，如本图所示，甲硝唑处理的细胞长度受到影响，而万古霉素处理的细胞则未受影响。掌握该技术后，可在两天内完成操作。在进行该操作时，需注意确保样品在镀膜和成像前已完全固定并彻底干燥。通过该实验流程，我们还可开展其他方法以回答更多问题，例如细菌对抗生素治疗的反应；这能够帮助我们进一步了解抗生素作用机制的相关细节。该技术具有巨大潜力，可能为微生物学领域的研究人员深入探索艰难梭菌的生理学与药理学特性提供新的途径。希望您今天喜欢观看本视频。希望您通过本内容掌握了艰难梭菌细胞的培养与鉴定方法、如何分析抗生素对艰难梭菌的杀灭动力学，以及如何利用高分辨率显微镜评估与该杀灭模式相关的形态学变化。尽管我们在操作艰难梭菌（Clostridium difficile）时需格外谨慎，并采取全部防护措施

a-protocol-to-characterize-morphological-changes-clostridium

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

表征形态变化的议定书<em&gt;艰难梭菌</em&gt;应对抗生素治疗

来源：Winston, J. A. 等. 经头孢哌酮处理的小鼠模型感染临床相关性Clostridium difficile 菌株 R20291。J. Vis. Exp. (2016)本视频演示了利用选择性培养技术对感染小鼠模型粪便样本中的Clostridium...

在感染小鼠模型粪便样本中对Clostridium difficile进行定量分析

本视频展示了一种用于测量荧光抗生素探针在细菌细胞内蓄积的实验方法。首先使细菌细胞暴露于外排泵抑制剂，以破坏其跨膜质子梯度，随后加入荧光团标记的抗生素。由于质子梯度被破坏导致外排泵功能受抑，抗生素在细菌内部蓄积。之后裂解细菌细胞，通过测定荧光强度来确认抗生素的蓄积情况。...

一种用于检测荧光抗生素探针在细菌细胞中积累的测定方法

Clostridium difficile 是一种专性厌氧的致病菌，可引起抗生素相关性腹泻（AAD）。本文介绍了分离、培养和保藏 C. difficile 营养细胞及芽孢的方法。这些技术需要使用厌氧室，且需定期维护，以确保为 C. difficile...

在厌氧环境中培养与维持 Clostridium difficile

本方案概述了使用临床相关且遗传上易于操作的菌株 R20291 建立头孢哌酮诱导的小鼠Clostridium difficile感染（CDI）模型的方法。该方案详细描述了在小鼠模型中对临床疾病监测、C.

经头孢哌酮处理的临床相关小鼠模型 艰难梭菌 菌株 R20291

本文介绍了一种简单的蛋白质微阵列方法，用于分析体液免疫应答对高度纯化的7重蛋白组合的反应情况 艰难梭菌...

一种用于血清学检测抗原特异性抗体应答的蛋白质微阵列实验方法 艰难梭菌 感染

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

本文介绍了一种建立抗生素诱导的伪无菌右旋糖酐硫酸钠诱导结肠炎小鼠模型的实验方案，用于研究肠道微生物群在调控Bacillus...

探究缓解效应 Bacillus cereus 通过肠道微生物群调节治疗结肠炎

抗生素持留现象描述了敏感同基因群体中的少数亚群在短时间内耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。本实验方案结合多种方法，在将大肠杆菌（Escherichia...

Escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

目前的临床诊断中，抗菌药物敏感性检测依赖于病原菌在营养丰富且富氧条件下的浮游生长。本研究采用一种替代性的人工痰液培养基，以模拟囊性纤维化患者肺部更具代表性的富氧及微需氧环境，从而研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

使用人工痰液培养基在更贴近囊性纤维化肺部环境的条件下测试抗生素对Pseudomonas aeruginosa的疗效

本文重点介绍利用两种正交方法相结合的策略，鉴定宿主与病原体蛋白质之间高可信度相互作用数据集：酵母双杂交系统，随后进行一种称为高通量哺乳动物细胞相互作用检测（HT-GPCA）的高通量相互作用分析。...

宿主-病原体蛋白质-蛋白质相互作用图谱的比较研究方法

了解扫描电子显微镜结合体外细胞培养技术用于研究艰难梭菌对抗生素的形态学反应。该方法可详细观察抗生素杀菌作用，为优化CDI治疗策略提供依据。

一种表征形态学变化的实验方案艰难梭菌对抗生素治疗的响应

探索更多视频

一种表征形态学变化的实验方案 艰难梭菌 对抗生素治疗的响应

探索更多视频

一种表征形态学变化的实验方案艰难梭菌对抗生素治疗的响应