A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

这种微生物成像方法的总体目标是提供一种更具描述性的方法来区分药物治疗的表型效应。所以这种方法在传染病领域确实有帮助。专门研究某些抗生素的形态学影响以及它如何杀死艰难梭菌。

该技术的主要优点是它将高分辨率成像与体外细胞培养技术相结合，以提供药物杀伤作用的详细前景。该技术的含义可能延伸到艰难梭菌感染的治疗，简称 CDI。原因是这种技术可能为确定抗生素如何有益于治疗 CDI 提供了一种方法。

虽然这种方法可以提供对药理作用的见解，但它也可以应用于其他系统，例如混合培养模型或体内动物研究。通常，个体对这种新方法感到困难，因为培养艰难梭菌和作扫描电子显微镜具有挑战性。当我们试图区分不同抗生素的作用模式时，我们第一次想到了这种方法。

我想向您介绍您今天将要见到的研究团队。贾汉吉尔·阿拉姆 （Jahangir Alam） 是一位教授和微生物学家。他负责协调您今天将看到的所有实验室活动。

Tasnuva Rashid 是该实验室的一名研究生。她做了很多日常微生物学工作。Eugenie Bassere 是一名博士后研究员。

她确实教会了 Tasnuva 许多技能，并在实验室提供协助。Brad Endres 是实验室的另一位博士后。他将在 Long Chang 的帮助下进行大量显微镜检查。

要在戴无菌手套的情况下制备环境隔离物，请使用预先消毒的棉纱布擦拭任何感兴趣区域的表面，例如地板、门、把手或架子。然后将棉签放入消毒管中。在样品之间更换手套。

制备临床分离株时，使用接种环将 10 至 100 毫克临床粪便样本接种到头孢西丁环丝氨酸果糖琼脂 （CCFA） 上，并在严格的厌氧条件下对样本进行插管 48 至 72 小时。将分离的艰难梭菌原液菌落储存在零下 80 摄氏度的冷冻小瓶中，以用于进一步分析。用 05% 牛磺胆酸钠富集脑心输注或 BHI 肉汤中的环境拭子样本，并将样本置于 37 摄氏度的厌氧室中 5 天。

10， 000 倍 G 离心 1 毫升培养物，并使用 100 微升乙醇重悬沉淀。将 50 微升重悬细胞接种到 CCFA 平板上，并在 37 摄氏度的厌氧室中孵育培养物 40 至 48 小时。将分离的艰难梭菌原液菌落储存在零下 80 摄氏度的冷冻小瓶中，以用于进一步分析。

使用乳胶凝集试剂或 PCR 检测可疑的艰难梭菌集落。在 37 摄氏度的厌氧室中，在血琼脂平板上培养纯化的环境或临床艰难梭菌菌株 48 小时。使用接种环取一个分离的菌落，并将其转移到 15 mL 试管中的 5 mL BHI 培养基中。

然后在 37 摄氏度的厌氧室中培养培养物 24 小时。使用新鲜的预还原 BHIS，并补充有牛磺胆酸钠和适当浓度的抗生素，将预培养物稀释 1 至 100 至约 10 至每毫升 6 CFU。用移液管在每个时间点收集 1 毫升样品并铺板或将小等分试样涂抹在血琼脂板上。

将板在 37 摄氏度的厌氧室中孵育 48 小时，并计算所得菌落数以确定 CFU。在微量离心管中收集每个时间点的 1 毫升细胞，并以 10， 000 倍 G 离心 10 分钟。弃去上清液，用 PBS 洗涤细胞。

再次旋转样品并弃去上清液。然后使用 1 毫升 4% 多聚甲醛重新稀释细胞，并在室温下孵育试管 1 小时。再次离心样品并弃去上清液后，用蒸馏水洗涤细胞两次，然后在 100 微升蒸馏水中重新稀释细胞。

根据溶液的浊度调整体积。标记盖玻片后，在其上加入 40 μL 样品。在流动罩下，将盖玻片孵育 15 分钟以蒸发液体并让细胞粘附在玻璃上。

如果仍然存在液体，请使用鼓风机将其清除。将盖玻片放入桌面溅射机中并用胶带粘住。将纯金固定在溅射机中。

然后打开机器并开始在低压下溅射。以 80 微安的剂量包被细胞 30 秒，相当于 20 纳米的金涂层。要开始成像，首先按下 Vent 按钮在计算机软件中正确通风 SEM。

涂布电池后，将它们转移到扫描电子显微镜或 SEM 中。使用碳带，将涂层的盖玻片固定到金属载物台上。一旦 SEM 通风，门应该很容易打开。

入金属载物台，将其锁定在 SEM 室中。接下来，点击 泵 软件中的按钮。当系统读取 okay 时，SEM 即可使用。

在 Detector's（检测器）选项卡下，单击 SE 检测器。通过单击显示电压的按钮打开光束。在增加电压之前，以较低的电压开始成像。

光束打开后，将出现图像。使用跟踪功能，在涂层盖玻片上找到一个区域进行成像。放大该区域并找到代表艰难梭菌的杆状结构。

要校准系统，请放大图像，粗略聚焦图像，并将 Z 链接到自由工作距离。这应该在多个工作距离下进行，例如 15 毫米、9 毫米和 5 毫米。然后切换到超高分辨率成像模式。

使用粗调和精细对焦切换开始以高放大倍率进行对焦。调整像散切换以获得更清晰的图像，并使用计算机软件以数字方式放大图像来检查图像的清晰度。使用慢速扫描可收集高质量的图像。

将收集的图像另存为 tiff 文件以供以后分析，确保在分析期间进行测量时选择数据栏。通过倾斜 SEM 上的载物台，以不同角度收集图像以揭示更多深度信息。在收集慢速扫描图像之前优化聚焦和散光。

成像完成后，关闭光束并将工作距离提高到 20 毫米。然后对腔室进行通风并取下载物台。处理图像，在斐济打开图像文件。

使用 line 函数，精确跟踪比例尺。点击 分析 标签;，然后选择 Select Scale 函数。将出现一个窗口，该窗口需要根据比例尺设置已知距离。

同时更改长度单位，然后单击 Ok。最后，要测量像元长度，请使用 line 函数来追踪整个像元。再次选择 Analyze 选项卡，然后单击 measure。

长度应以前面表示的单位显示。这些图像显示了在生长曲线的指数阶段捕获的艰难梭菌营养细胞，以及孢子细胞。营养细胞是长而光滑的杆状结构;而孢子是小的椭圆形结构，外部粗糙。

如图所示，对照细胞生长并达到平台期;而用抗生素万古霉素和甲硝唑处理的细胞总 CFU 降低至检测限，表明具有杀菌作用。如证明的那样，万古霉素和甲硝唑可有效杀死超级 MIC 浓度的艰难梭菌。为了证明使用 SEM 对艰难梭菌成像的效用，在药物治疗前后对细胞进行成像，以确定形态如何变化。

在万古霉素的情况下，一些细胞壁受到影响，一些甲硝唑处理的细胞体积较小。为了测试细胞大小是否受到影响，使用程序 Fiji 分析了细胞长度。如图所示，在对照情况下，营养细胞大小可能会有所不同;但大多数的长度约为 6 微米。

然而，如图所示，细胞长度在甲硝唑处理的细胞中受到影响，但在万古霉素处理的细胞中不受影响。一旦掌握，这项技术可以在两天内完成。在尝试此程序时，请务必记住，在涂层和成像之前，您的样品是固定的并完全干燥的。

按照此程序，我们可以执行其他方法来回答其他问题，例如细菌对抗生素治疗的反应;例如，这可以让我们更深入地了解抗生素的作用机制。这项技术具有巨大的潜力，可能为微生物学领域的研究人员进一步探索艰难梭菌的生理学和药理学铺平道路。希望您今天观看此视频时喜欢。

我希望您从中获得的是如何生长和表征艰难梭菌细胞，如何观察抗生素对艰难梭菌的杀伤动力学，以及如何使用高级显微镜评估与该杀伤模式相关的形态变化。当我们与艰难梭菌合作时，我们必须采取额外的预防措施并使用所有保护措施