简捷方法对硫甙的提取与分析用高压液相色谱法（HPLC）
2017年3月15日
在这里，我们非常详细地描述了一种已建立且稳健的方案，用于从地面植物材料中提取硫代葡萄糖苷。在对提取物进行柱上硫酸酯酶处理后，洗脱脱硫代葡萄糖苷并通过高压液相色谱法进行分析。
该方案的总体目标是对植物和其他生物样品中的硫代葡萄糖苷进行简单直接的分析。这种提取和分析硫代葡萄糖苷的方法可用于回答植物昆虫生态学、植物病理学、植物育种和食品科学中的关键问题。该技术的主要优点是经过充分验证，并广泛适用于各种生物样品。
虽然这种方法主要用于定量植物材料中的硫代葡萄糖苷，但它也可以应用于土壤或预制食品。这种提取程序几乎可以在任何实验室中进行，因为您主要使用标准实验室设备。一般来说，刚接触这种方法的人在至少阅读和观察电影一次时会更好地进行分析和检查。
要开始该程序，请将 10 克 G-25 交联糊精凝胶与 125 毫升超纯水混合。将混合物储存在 4 摄氏度的带盖瓶子中。然后，将 10， 000 单位的 H-1 型芳基硫酸酯酶溶解在 30 毫升超纯水中。
加入 30 毫升无水乙醇中，充分搅拌混合物。在室温下以 2， 650 倍 G 离心混合物 20 分钟。将上清液与 90 毫升无水乙醇混合在烧杯中。
混合并倒入新的离心管中。在室温下以 1， 030 倍 G 离心混合物 15 分钟。丢弃上清液。
将沉淀溶解并混合在总共 25 毫升的超纯水中。充分涡旋混合物，然后将混合物转移到 1 毫升试管中。将硫酸盐样品在 20 摄氏度下储存长达一年。
接下来，称量约 90 毫克的 singram 并记录重量以达到 1 微克的精度。然后，将 sinangel 一水合物溶解在 10 毫升超纯水中。从该 sinan 储备溶液制备浓度范围为 50 至 750 微摩尔的五种参比溶液。
将参比溶液储存在 20 摄氏度的 1.5 毫升管中。接下来，对于每个样品和参比，在柱架位置标记 2 mL 微量离心管。用解剖针刺穿每个微量离心管盖，以便稍后冷冻干燥。
将已标记的管子放置在与已标记的列相同的配置和间距的块中。要制备玻璃移液器柱，请使用木棒或玻璃棒将一块 1 厘米 x 1 厘米的玻璃棉轻轻压入移液器中。在移液器桶到杆的过渡处填充玻璃棉。
将移液器柱放在架子上每个标记的位置。将样品架放在废液托盘上。切掉塑料 1 ml 移液器吸头的末端。
充分摇晃准备好的糊精凝胶。然后使用加宽的移液器吸头将 0.5 毫升制备的糊精凝胶加载到每列中。检查色谱柱是否有泄漏的糊精凝胶，并更换任何泄漏的色谱柱。
所有色谱柱都用糊精凝胶加载后，用 1 mL 超纯水洗涤每个色谱柱。称量 50 至 100 毫克自由步幅，在带安全帽的 2 毫升反应管中精细研磨植物材料，并以 0.1 毫克的精度记录重量。在每个试管中放置两个直径为 3 毫米的金属球。
向每管中加入 1 毫升 70% 甲醇的超纯水溶液，并短暂涡旋每种混合物。用额外的安全帽盖住试管，并立即将它们放入 90 至 92 摄氏度的水浴中。加热管子，直到锯料开始沸腾。
将试管转移到超声波浴中，对样品进行声波加热 15 分钟。在超声处理过程中，开始解冻硫酸盐样品和 sinan 图参考。超声处理后，在室温下以 2， 700 倍 G 离心样品 10 分钟。
将上清液和解冻的 sinogram 参考加载到相应的色谱柱上，注意不要将植物物质吸入移液器中。向每管中加入 1 毫升 70% 甲醇。涡旋混合物。
并用超声波加热混合物 15 分钟。在与以前相同的条件下再次离心管。将上清液上样到相应的色谱柱上。
向每根色谱柱中加入两份 1 mL 的 70% 甲醇，使每份色谱柱之间干燥。用 1 ml 超纯水清洗每根色谱柱中的残留甲醇。然后，用两份 1 mL 的 20 毫摩尔乙酸钠缓冲液 （pH 5.5） 洗涤每根色谱柱。
将最后一部分乙酸钠缓冲液排入废液架后，从废液盘中取出废液架，并用纸巾擦干废液架的支脚。将架子放在标记的微量离心管块上，使柱头位于相应的管中。将 20 μL 硫酸盐溶液加载到每根色谱柱上，确保溶液到达色谱柱材料的表面。
用 50 μL 乙酸钠缓冲液将硫酸盐溶液冲洗到柱材料中。将硫酸酯冲洗到色谱柱中非常重要。酶必须位于色谱柱上，才能与色谱柱上结合的完整硫代葡萄糖苷发生反应。
将硫酸酯溶液冲洗到每根色谱柱上后，用铝箔覆盖色谱柱。让色谱柱静置过夜。接下来，用两份 0.75 毫升的超纯水来暗示每根色谱柱中的脱硫代硫代葡萄糖苷。
色谱柱干涸后，取下色谱柱架并盖上每根试管。将试管置于液氮中或 80 摄氏度冷冻至少 30 分钟。将样品冷冻干燥 12 至 24 小时。
将每个残留物溶解在 1 毫升超纯水中。然后将每个样品和参比转移到标记的 HPLC 样品瓶中。在反相 CAT 色谱柱上分离提取物。
使用 229 纳米的检测波长。通过 HPLC 分离后，可以通过将保留时间和 UV 光谱与已知的硫代葡萄糖苷标准品进行比较来鉴定硫代葡萄糖苷。样品中的硫代葡萄糖苷浓度是根据 sinogram 校准曲线和响应因子的文献值计算的。
由此，可以确定原始植物样品中的硫代葡萄糖苷浓度。在所使用的 HPLC 条件下，不健康的原子红很早就暗示了，并与对生物有益的萝卜硫素分开。内层硫代葡萄糖苷也分离得很好。
观察到溶出性系列，醛醇、甲基叶醇-醛醇和长链甲基-solfinol-硫代葡萄糖苷的侧链连接增加。因此，可以根据这些溶出系列和紫外线光谱对未知的硫代葡萄糖苷进行初步分类。如果准备得当，一个人可以在一个工作日内提取 150 至 200 个样本。
还需要一天时间才能提到色谱柱：对样品进行冷冻干燥，并为 HPLC 做准备。按照此程序，可以应用其他方法（例如 LCMS）来识别色谱图中未知的脱硫硫代葡萄糖苷。观看此视频后，您应该对如何从生物样品中提取硫代葡萄糖苷并通过 HPLC 进行分析有很好的了解。
不要忘记，使用甲醇可能非常危险，应始终在通风橱下进行。
概述
本文介绍了一种使用高压液相色谱法从植物材料中提取葡糖苷酸盐的详细协议。该方法设计简单，适用于各种生物样本。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物-昆虫生态学
- 植物病理学
- 食品科学
背景
- 葡糖苷酸盐是植物中的重要化合物。
- 它们在植物防御机制中发挥作用。
- 了解它们的浓度可以帮助进行各种生物学研究。
- 该协议适用于广泛的样本。
研究目的
- 提供一种可靠的葡糖苷酸盐提取和分析方法。
- 促进植物相关领域的研究。
- 能够在不同样本中定量葡糖苷酸盐。
使用的方法
- 制备糊精凝胶和磺酸酯酶溶液。
- 使用甲醇和超声波进行样品提取。
- 高压液相色谱法进行分析。
- 比较保留时间和紫外光谱与标准物质。
主要结果
- 成功从植物材料中提取葡糖苷酸盐。
- 在各种生物样本中验证了该方法。
- 通过HPLC识别葡糖苷酸盐。
- 在生态学和食品科学中的潜在应用。
结论
- 该协议对葡糖苷酸盐分析有效。
- 可以在各种研究环境中使用。
- 进一步的研究可以扩展其在植物科学中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of glucosinolates supports target validation in plant-based bioactive compound discovery, enabling mechanistic de-risking of nutraceutical and crop protection candidates. This method provides predictive confidence in identifying beneficial versus detrimental glucosinolate profiles, informing lead identification and portfolio triage in agricultural biotechnology and functional food development. Its broad applicability across plant tissues and biological samples enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific glucosinolate structures to biological activities such as progoitrin (detrimental) or glucoraphanin (beneficial).
- Operational Value: Supports biological de-risking through reliable quantification of intact glucosinolates after myrosinase inactivation and sulfatase treatment.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence in target validation by generating quantitative data for structure-activity relationship analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering desulfoglucosinolates suitable for HPLC-based detection and quantification.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through sinigrin-based calibration curves and established response factors.
- Scalability: Enables processing of 150–200 samples per person per day, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase glucosinolate profiling to preclinical validation through disease-relevant systems in plant pathology and food sciences.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying harmful breakdown products (e.g., nitriles) versus beneficial ones (e.g., isothiocyanates) based on glucosinolate profiles.
- Biomarker Alignment: Enables translational biomarker development by correlating glucosinolate concentrations with phenotypic outcomes in ecological and breeding studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly in nutraceutical and crop trait development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying glucosinolate profiles that determine bioactive breakdown product formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via HPLC with PDA/UV detection, enabling reliable compound evaluation across diverse plant matrices.
- Analytics: Provides measurable readouts (retention times, UV spectra, concentration calculations) that allow cross-condition comparison and structure-based classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through applications in food safety and plant health, where glucosinolate breakdown products influence biological outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical platform due to its reliance on standard lab equipment and broad sample compatibility (plant, soil, foodstuffs).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in bioactive compound identification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across laboratories using accessible equipment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bioactive compound development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated glucosinolate quantification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant sample preparation, enzymatic treatment, and HPLC operation.
- Depends on access to centrifuges, water baths, ultrasonic baths, freeze-dryers, and HPLC systems with PDA/UV detection.
- Necessitates cross-team standardization of extraction timing, sulfatase incubation, and reference curve preparation.
- Involves adaptation considerations for varying plant matrices (leaf, seed, root) and non-plant samples (soil, foodstuffs).
- Includes practical limitations such as methanol handling hazards requiring fume hood use and the 12–24 hour freeze-dry step affecting turnaround time.
