Name: 简捷方法对硫甙的提取与分析用高压液相色谱法（HPLC） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习使用高压液相色谱法从植物材料中提取和分析硫甙的简捷方法。该技术经过充分验证，可广泛应用于植物昆虫生态学、植物病理学和食品科学等领域的研究。

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NMvD 感谢德国耶拿马克斯·普朗克化学生态研究所的 Michael Reichelt 博士，16 年前她刚开始使用该方法时，Reichelt 博士提供了最初的参考样品。感谢荷兰瓦赫宁根 NIOO-KNAW 的 Ciska Raaijmakers、荷兰奈梅亨 B-Ware 的 Sebastian Krosse 以及德国莱比锡 iDiv 的 Christian Ristok 多年来对实验方案的改进。感谢德国图宾根大学的 Mirka Macel 和 Martine Huberty 允许使用 Rorippa 的色谱图。作者衷心感谢德国研究基金会（FZT 118）资助的德国整合生物多样性研究中心（iDiv）哈勒-耶拿-莱比锡在本研究中提供的支持。

1. 芥子油苷提取所需溶液的制备
<ol>
	<li>在玻璃瓶中配制 500 mL 70% 甲醇（MeOH）水溶液（超纯水）。每 100 个样品和 5 个标准品需使用 420 mL 70% MeOH。</li>
	<li>配制 20 mM 醋酸钠（NaOAc）（pH = 5.5），通过加入 0.82 g NaOAc 或 1.36 g NaOAc·3H₂O2将 NaOAc 溶于 500 mL 水中；用盐酸（HCl）调节 pH。将 NaOAc 储存于冰箱中。配制 100 个样品和 5 个标准品所需溶液为 370 mL 的 20 mM NaOAc 水溶液（pH = 5.5）。</li>
	<li>为制备柱材料，将10 g交联葡聚糖凝胶（G-25型）与125 mL超纯水混合。将所得混合物置于冰箱中保存（4 °C).</li>
	<li>硫酸酯酶溶液的制备
	<ol>
		<li>溶解10,000单位芳基硫酸酯酶（H-1型，来自 Helix pomatia) 溶于30 mL超纯水中，加入30 mL无水乙醇（EtOH）。充分混匀后，转移至一个250 mL离心管或多支较小离心管中，根据实际条件选择。</li>
		<li>在室温（RT）下，以 2,650 × g 离心混合物 20 分钟。将上清液转移至烧杯中，加入 90 mL 乙醇（EtOH），混匀。将混合物分装至一个或多个离心管中，在室温（RT）下以 1,030 × g 离心 15 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。将沉淀物溶解并合并于总共 25 mL 超纯水中。充分涡旋混匀，分装至 1 mL 离心管中，于 -80 °C 冰箱中保存。20 °C；可保存至少一年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>芥子油苷标准溶液的制备
	<ol>
		<li>称取约 9 mg 的芥子苷一水合物，加入 1-µg 准确度例如， 8.769 mg）。转移至10 mL容量瓶中，用10.0 mL超纯水溶解芥子苷一水合物。</li>
		<li>计算母液的摩尔浓度，并配制5种芥子油苷标准品，浓度范围在50–750 µM 通过稀释储备液进行。具体示例参见 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">补充文件 S1</a>.</li>
		<li>将不同的芥子苷标准品分别加入1.5 mL反应管中，并于 20 °C每次提取批次中均需包含一系列五个芥子油苷（sinigrin）标准品。计算浓度时，务必使用当前所用芥子油苷（sinigrin）标准品的正确摩尔浓度值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 提取装置的准备
<ol>
	<li>为巴斯德移液管柱准备一个柱架（柱的制备参见步骤 3.1）。标记柱架或柱子，以便追踪样品编号（见图 1）。</li>
	<li>准备一个可容纳相同数量已标记 2 mL 微离心管的管架（参见步骤 3.3 和 图 1）</li>
</ol>
<img alt="DNA分离色谱系统；装置包括样品孔和移液管，科研示意图。" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于芥子油苷提取的支架。 芥子油苷提取所用自制柱支架和支撑块的前视图（左）和俯视图（右）。高度：100 mm，错位孔之间的距离（用于固定巴斯德移液管柱）：30 mm（x轴）× 15 mm（y轴）。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 准备色谱柱和微量离心管
<ol>
	<li>每个样品准备一列，另加五列用于五个芥子油苷参考样品。
	<ol>
		<li>在每个玻璃移液管中放入一块约1 cm × 1 cm的玻璃棉。使用木棒或玻璃棒将玻璃棉推至移液管变窄处。玻璃棉可防止柱材料流出，但用量不宜过多，否则会减慢洗脱速度。操作玻璃棉时应佩戴手套。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将柱子放置在柱架上（见图1）。将柱架置于实验托盘（废液托盘）中，以收集连续柱洗涤过程中使用的洗脱液。</li>
	<li>剪去一个塑料1 mL移液枪头尖端最前端5 mm，然后向每根柱中加入0.5 mL已制备的柱材料（水中的G-25凝胶，参见步骤1.3）。移液前需充分振荡盛有柱材料的瓶子。若柱材料从玻璃棉层中漏出，则丢弃该漏液的柱子，并更换新的柱子。
	<ol>
		<li>将柱材料加入各柱后，加入1 mL超纯水以冲洗并沉降柱材料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为每个样品准备一个2 mL反应管，另加五个反应管用于五个芥子油苷参考样品，并做好标记。使用解剖针在管盖上打孔，以便后续冻干。将准备好的反应管按照与柱子完全相同的排列方式放入试管架中（步骤2.2，见图1）。</li>
</ol>
4. 芥子油苷的提取
<ol>
	<li>称取冻干并充分研磨的植物材料（通常为50.0–100.0 mg干重；提取液中最终硫代葡萄糖苷浓度应处于标准曲线范围内），精确至0.1 mg，放入已标记的2 mL圆底反应管中。每管加入两颗直径为3 mm的小金属球作为防沸颗粒。 
	注意：该方案也可用于新鲜的、经液氮速冻并研磨、且在提取前始终保持冷冻状态的材料。为补偿材料中水分造成的稀释，需增加提取时称取的材料量，并将提取液中甲醇的比例提高至85%。19.</li>
	<li>用移液器向每支试管中加入1 mL 70%甲醇，短暂涡旋。盖紧试管并用安全帽密封，然后尽快放入90–92 °C静置几分钟（约5分钟），直至70%甲醇刚好沸腾。注意：此步骤中请佩戴安全护目镜！</li>
	<li>将样品管放入超声波水浴中处理 15 min。同时，从冷冻箱中取出硫酸酯酶和五种芥子苷标准品，在室温下解冻。</li>
	<li>超声处理后，在室温下以2,700 × g离心样品管10分钟；每管中应形成沉淀。将上清液转移至标记好的层析柱中，并用移液器将五种参考样品分别加至不同的柱子上。
	<ol>
		<li>移取上清液时，移液枪枪头应始终位于沉淀物上方，避免吸入植物材料。注意，若使用干燥样品，上清液体积将少于1.0 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向样品管中剩余的沉淀物加入1 mL 70% MeOH，涡旋混匀后置于超声波水浴中15 min。再次按照步骤4.4进行离心，并将上清液加入相应的层析柱中；由于柱材料的特性，芥子油苷的带负电荷的硫酸根会特异性地保留在柱上。</li>
	<li>用提取物按三个连续步骤洗涤层析柱。
	<ol>
		<li>用移液器将 2 × 1 mL 的 70% MeOH 加入每根色谱柱中。每次加入 1 mL 后需等待柱子流干再加下一次，以去除提取物中更多的非极性化合物。例如， 叶绿素</li>
		<li>通过向每根柱中加入1 mL超纯水冲洗甲醇。</li>
		<li>向每根柱中加入 2 × 1 mL 的 20 mM NaOAc 缓冲液，以建立硫酸酯酶反应的最佳条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装有层析柱的支架从废液盘中取出，用纸巾擦干支架底部。将支架置于装有小瓶和已标记试管的支架上，确保每个层析柱的尖端都对准相应的、已标记的2 mL试管（参见 图1).</li>
	<li>添加 20 µL 向柱中加入硫酸酯酶溶液。确保硫酸酯酶溶液到达柱材料表面。用移液器 50 µL 将 NaOAc 缓冲液加至每个柱子上，以洗脱硫酸酯酶。用铝箔覆盖柱子，并静置过夜。 
	注意：由于硫酸酯酶的作用，硫酸基团将被去除，从而使脱硫葡萄糖苷酸从柱上释放，随水洗脱。详细描述参见 Crocoll 等19.</li>
	<li>第二天，用移液器向每根柱子中加入2 × 0.75 mL超纯水，洗脱脱硫硫代葡萄糖苷。待所有柱子流干后，抬起柱架并将其从反应管上取下。
	<ol>
		<li>盖上管盖（确保管盖上有孔），并在液氮或 -80 °C 超低温冰箱中冷冻80 °C -80°C 冷冻 30 分钟。冷冻干燥样品 12–24 小时（根据样品数量和冷冻干燥机的容量而定），以完全去除水分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻干后，用精确体积（通常为1.0 mL）的超纯水重新溶解残留物。将样品和5个芥子苷标准品转移至已标记的HPLC小瓶中。将样品置于冰箱中保存（4 °C）最长可保存两周或置于冰箱（-20 °C) 可在使用 HPLC 分析前保存长达一年。</li>
	<li>让玻璃柱在通风橱中过夜晾干，干燥后予以丢弃。从第4.5步中使用的样品管中回收金属小球以重复使用，并将样品管放入废弃物处理箱中。</li>
</ol>
5. 提取样品的高效液相色谱检测
<ol>
	<li>使用反相C18色谱柱（4.6 x 150 mm，3 µm，300 Å），以乙腈-水梯度洗脱（见表1），流速为0.75 mL/min，柱温为40 °C，分离芥子油苷。在229 nm波长下进行检测与定量。</li>
	<li>在同一色谱柱上测定芥子苷标准品，但采用优化的梯度方法以减少溶剂消耗（见表2）。首先依次进样五种芥子苷标准品，从最低浓度的标准品开始。随后进样待测样品，每分析十个样品后插入一次甲醇进样（空白），以清洗色谱柱并防止峰拖带。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间 [min]</td>
			<td>流速 [mL/min]</td>
			<td>% A 水</td>
			<td>% B 乙腈</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.750</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35</td>
			<td>0.750</td>
			<td>65</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>0.750</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">色谱柱温度 40 °C。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：反相高效液相色谱法分离与分析芥子油苷的乙腈-水梯度洗脱程序。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间 [min]</td>
			<td>流速 [mL/min]</td>
			<td>% A 水</td>
			<td>% B 乙腈</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.750</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.750</td>
			<td>89.3</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>0.750</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">色谱柱温度 40 °C。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用于芥子油苷定量分析的五种芥子苷参比物质的缩短型乙腈-水梯度洗脱程序。
6. 芥子油苷的鉴定与定量
<ol>
	<li>鉴定
	<ol>
		<li>将样品中各峰的紫外光谱（UV）与市售的纯芥子油苷标准品的保留时间进行比对。各种芥子油苷类别的紫外光谱示例见图2。</li>
		<li>尽可能使用标准品或液相色谱-质谱联用（LC-MS）18,19对未知芥子油苷进行鉴定。</li>
		<li>若条件允许，可采用核磁共振（NMR）技术对未知芥子油苷进行鉴定。</li>
		<li>将样品中各峰的紫外光谱和保留时间与图2和表3、数据库或文献资料中的数据进行比对。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示不同样品光谱特性分析的紫外-可见吸收光谱图" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图2. 最常见的硫代葡萄糖苷类化合物的紫外光谱。 六种去硫酸化硫代葡萄糖苷（GSL）的紫外吸收光谱（200–350 nm），其溶液由商业可得的标准品配制而成，标准品按本文所述方法提取，代表了最常见的结构类别。图中标注了通用名称、结构名称（括号内）以及结构类别。（A）芥子硫苷（2-丙烯基GSL），烯基；（B）萝卜硫苷（4-甲硫基丁基GSL），硫代烯基；（C）莱菔硫苷（4-甲亚砜基丁基GSL），亚砜基；（D）芥焦油苷（吲哚-3-基甲基GSL），吲哚类；（E）黑芥子苷（2-苯乙基GSL），芳香族；（F）白芥苷（4-羟基苄基GSL），芳香族。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>定量分析
	<ol>
		<li>对五种芥子油苷标准品及样品的峰面积进行积分。</li>
		<li>根据五个测定的芥子碱参考物的积分面积计算校准曲线。利用回归直线方程（见公式1）计算硫代葡萄糖苷的插值含量（见公式2）。</li>
		<li>为计算不同芥子油苷的浓度，将插值结果（x）乘以 EC（1990）中提供的在 229 nm 处检测的响应因子（M）16，Buchner (1987)15，或棕色 等 (1993)17；最常检测到的脱硫芥子油苷的共识响应因子如下所示 表3. 
		注意：不同系统之间的响应因子可能存在差异，这可能是不同参考文献中给出的数值不同的原因（参见参考文献15-17）。尽管如此，这些数值大多较为接近，且在具有相似结构类别的化合物中处于相近范围。按照惯例，将未鉴定的芥子油苷的响应因子设为1，尽管对于紫外光谱与葡萄糖苷芥子油苷（glucobrassicin）及其他吲哚类芥子油苷相似的未知吲哚类芥子油苷，图2），建议使用0.25作为响应因子，以获得浓度的合理估算（表3).</li>
		<li>为了计算硫代葡萄糖苷的最终含量（xt) 时，需考虑分析中所用样品的稀释倍数（D）和质量（w）（见公式3）。 
		<img alt="线性方程 y=mx+c 表示图形的斜截式，是代数学习的关键。" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> (1) 
		<img alt="线性方程求解 x，公式：\(x=\frac{y-c}{m}\)" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> (2) 
		<img alt="静态平衡方程，包含教育公式中的变量与符号。" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> (3) 
		y = 峰面积 
		m = 参考5点回归曲线的斜率 
		c = 回归直线与 y 轴的截距 
		x = 提取物中芥子油苷的含量 
		xt = 植物样品中芥子油苷的浓度 
		D = 稀释倍数 
		M = 根据Buchner（1987）或Brown在229 nm检测处的响应因子 等 (1993) 
		w = 提取所用样品的质量</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hartmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+waste+products+to+ecochemicals%3A+Fifty+years+research+of+plant+secondary+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism.</a> Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).</li>
<li>Will, H., Laubenheimer, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jlac.18791990109/abstract">Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens.</a> Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).</li>
<li>Agerbirk, N., Olsen, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22405332">Glucosinolate structures in evolution.</a> Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).</li>
<li>Halkier, B. A., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16669764">Biology and biochemistry of glucosinolates.</a> Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).</li>
<li>Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glucosinolates+-+gene+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22TIPS%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond.</a> TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).</li>
<li>Kliebenstein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+natural+variation+in+Arabidopsis+glucosinolate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation.</a> Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).</li>
<li>van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+glucosinolate+polymorphism+within+natural+populations+of+Barbarea+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris.</a> Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).</li>
<li>Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+immunolocalization+of+the+glucosinolate+sinigrin+in+seedlings+of+Brassica+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea.</a> Planta. 206 (3), 370-377 (1998).</li>
<li>van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11101-008-9101-9">Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems.</a> Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).</li>
<li>Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12161563">Disarming the mustard oil bomb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).</li>
<li>Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittstock%2C+U+%22Integrative+Phytochemistry%3A+From+ethnobotany+to+molecular+ecology%3A+Recent+Advances+in+Phytochemistry%22">Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry</a>. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).</li>
<li>Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+glucosinolates+in+insect-plant+relationships+and+multitrophic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions.</a> Ann Rev Entomol. 54 (1), 57(2009).</li>
<li>Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+trait+loci+mapping+of+aliphatic%2C+indolic+and+benzylic+glucosinolate+production+in+Arabidopsis+thaliana+leaves+and+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds.</a> Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).</li>
<li>Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucosinolate+biochemical+diversity+and+innovation+in+the+Brassicales%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales.</a> Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).</li>
<li>Buchner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchner%2C+R+%22Glucosinolates+in+rapeseed%22">Glucosinolates in rapeseed</a>. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).</li>
<li>Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Official+Journal+of+the+European+Communities%22">Official Journal of the European Communities</a>. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).</li>
<li>Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+glucosinolate+accumulation+among+different+organs+and+developmental+stages+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).</li>
<li>Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Profiling+of+Intact+Glucosinolates+in+Arabidopsis+Leaves+by+UHPLC-QTOFMS+Using+a+Charged+Surface+Hybrid+Column%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column.</a> Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).</li>
<li>Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrocoll%2C+C+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22">Current Protocols in Plant Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).</li>
<li>Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. <a target="_blank" href="https://pubag.nal.usda.gov/pubag/article.xhtml?id=1446175">Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates.</a> Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).</li>
<li>Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11101-008-9105-5">Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil.</a> Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).</li>
<li>Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+diversity+and+distribution+of+glucosinolates+and+isothiocyanates+among+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants.</a> Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).</li>
<li>de Graaf, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+4-%CE%B1-rhamnosyloxy+benzyl+glucosinolate+in+Noccaea+caerulescens+showing+intraspecific+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation.</a> Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).</li>
<li>van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00049-005-0323-7">Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea.</a> Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).</li>
<li>Gols, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1439179106000892">Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions.</a> Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法成熟且被广泛使用，其最大优势在于稳定性好、操作相对简单，且每个样品的成本较低。提取和分析所需的大部分设备在标准实验室中都具备，或可自行搭建，仅高效液相色谱-光电二极管阵列检测器（HPLC-PDA）除外。另一个优点是，脱硫芥子油苷溶于水后，若保存在低温、密闭的（HPLC）小瓶中，化学性质相当稳定，因此提取物可方便地寄送至其他地方进行HPLC分析。与液相色谱-质谱联用（LC-MS）平台相比，后者需要专门的培训以及丰富的软件操作和数据分析经验，而高效液相色谱-紫外/光电二极管阵列检测器（HPLC-UV/PDA）仅需短期培训即可操作。这不仅降低了操作成本，也使该方法更易于被广大科研人员（包括学生）所采用。
通常情况下，若严格按照上述步骤操作，应极少出现问题。一般而言，色谱图中的芥子油苷峰分离效果良好。若分离不佳，可通过降低洗脱液中乙腈浓度的上升速率来调整梯度程序。 alternatively，更换新的保护柱（200-500次进样后）或色谱柱（1,500-2,000次进样后）也可能解决此问题。有时，同一批次中的个别样品色谱图可能显示峰极小或无峰，这通常是由于添加硫酸酯酶时发生移液误差所致例如， 出现漏列或磺酸酯酶未充分洗脱至柱中）。或者，实验材料中的硫代葡萄糖苷浓度可能低于预期，导致提取所用材料量不足。若为后一种情况，可将进样体积增加至100 µL，或使用精确的等分试样（例如， 800 µL）的提取物可进行浓缩。后者可通过冷冻干燥提取物，然后将残留物溶解于较小体积中实现。例如， 100 µL）水，并使用相同的参考曲线重新进样。在计算提取物原始浓度时，所得数值应乘以稀释倍数。如果此方法仍无法解决问题，则应使用更多起始材料重新提取。若起始材料超过100 mg，应相应增加提取溶剂的体积和试管的规格，以保持提取效率。
另一个优点是该方法已得到充分验证。由于该方法已被描述为油菜籽中芥子油苷定量的标准方法，其操作步骤和准确性已在多个实验室中得到确认16此外，芥子油苷的遗传背景、生物合成及其生物学功能在模式植物物种中正受到广泛而深入的研究。 拟南芥 以及其他4,6,12因此，相对于芥子油苷，用于精确量化脱硫芥子油苷的多种响应因子均已明确定义并公开可查。15,17尽管基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法通量更高、灵敏度更高，并且能够（初步）鉴定尚无标准品的 glucosinolates18,19,20，液相色谱-质谱法缺乏通用的响应因子，限制了对芥子油苷浓度的准确定量18此外，这些方法通常不包含冷冻干燥步骤，且在计算中未考虑新鲜植物材料中的含水量，导致准确定量变得困难。最后，由于我们的提取方法包含基于层析柱的纯化和浓缩步骤，因此也可应用于 &#34;脏的&#34; 葡萄糖苷含量较低的样品，例如土壤21.
与通常采用新鲜冷冻材料、使用96孔板进行提取且不包含硫酸酯酶步骤的基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法相比18,19，本方法相对耗时较长且劳动强度较大。借助本文所述的柱架装置，单人每天可处理约100至150个样品。洗脱（次日）、冷冻干燥（过夜）及重新溶解过程可在接下来的两天内完成。若使用自动HPLC进样器，每次进样的运行与平衡时间为40至45分钟，且无意外情况发生，则获取该样本集数据需时3至4天。当HPLC软件支持基于芥子苷标准曲线的自动定量时，对100个样品的色谱图及峰归属进行人工核查可能仅需额外1至2小时，之后数据即可用于统计分析。
尽管芥子油苷标准品的可获得性日益增加，但目前130多种候选化合物中仅有少数可商业购得。然而，若每种生物合成类别均有若干参考文献，并可获取文献数据库中关于此前已在该植物物种中发现的化合物信息，例如， 法黑 等22）；色谱原理的基础知识，例如洗脱剂系列的原理（例如， 随着脂肪族化合物侧链上Cs数目的增加， 图3 和 4）以及在液相色谱-质谱联用仪上对单个样品进行验证19 或分离的芥子油苷在核磁共振波谱中的分析23，人们可以轻松克服这一限制。大多数芥子油苷分析方案均采用内标标准曲线（即， 一定浓度的芥子油苷或白芥子苷提取溶剂16,17,19）。原则上，内参标准曲线更适用于校正各样品在处理过程中的个体误差，因此理论上具有更高的精确度。尽管具有这一优势，我们仍倾向于使用五点外参标准曲线，因为我们经常分析不同的野生种，其中一些含有较高水平的芥子油苷（sinigrin）例如，Brassica nigra24）或芥子苷（sinalbin）例如，Sinapis alba25），这两种葡萄糖苷类化合物已有可用的响应因子。此外，由于高纯度的葡萄糖苷类参考标准品通常价格昂贵，向每个样品中添加内标物会增加分析成本。
总之，尽管步骤较为耗时，该方案仍提供了一种简单且易于实施的方法，用于从植物样品中提取并定量芥子油苷。然而需要注意的是，芥子油苷含量本身仅能反映其潜在的生物活性，这种活性依赖于与黑芥子酶的反应，且单一芥子油苷可能产生不同的反应产物11。必须通过验证实验来确认其生物学相关性。

据估计，植物能够产生超过20万种不同的化学化合物1。其中只有少数化合物参与植物的初级代谢过程，为生长和繁殖提供能量；大多数化合物被称为次生代谢物。尽管名为“次生”，这些代谢物通常对植物的生存和繁殖至关重要，因为它们能够吸引传粉者，或帮助植物抵御病原体和草食性动物的侵害1。
芥子油苷是一类高度多样化的次生代谢产物，已有超过150年的研究历史2。迄今为止，已鉴定出130多种结构不同的芥子油苷3。总体而言，芥子油苷可根据其合成所来源的氨基酸分为不同的类别。例如，吲哚类芥子油苷由色氨酸合成，而苯丙氨酸则为芳香族芥子油苷的合成提供基本骨架4。在各类别内部，由于生物合成途径中的连续链延长步骤（如在脂肪族芥子油苷类别中）或侧链修饰（例如羟基化），存在高度的结构多样性4,5。一种含有芥子油苷的植物物种可能包含多达37种属于不同结构类别的芥子油苷6。尽管植物物种具有典型的芥子油苷谱型，但在个体和种群之间，芥子油苷的类型常表现出种内变异6,7。完整的芥子油苷储存在植物细胞的液泡中，可在地上或地下任何器官中发现7,8,9。当细胞破裂时（例如因植食性动物取食），芥子油苷被释放，并与酶黑芥子酶混合，从而触发“芥子油炸弹”反应10。由于黑芥子酶的活性，并取决于芥子油苷的结构、反应条件以及修饰酶的存在，会生成多种辛辣、有毒或有害的化合物，如腈类和（异）硫氰酸酯类11。这些反应产物具有高度的生物活性；例如，它们可作为广食性昆虫植食者的驱避剂12。芥子油苷的遗传性和生物合成途径已被广泛研究，这主要归因于其在抵御植食性动物和病原体方面的意义、其作为芥末和卷心菜等作物风味成分的价值，以及其对人类健康产生的负面（如前致甲状腺肿素）和正面（如萝卜硫苷）影响5,13,14。
由于人们对作为生物活性化合物的硫代葡萄糖苷具有极大兴趣，自20世纪80年代以来，通常采用配备紫外（UV）或光电二极管阵列（PDA）检测器的反相高效液相色谱（HPLC）方法进行其提取与检测15. 基于此方法，欧洲共同体发布了一项标准方案，并在多个实验室中对油料种子中芥子油苷的分析进行了测试与验证（Brassica napus，油菜，Canola16）。其他研究者对该方法进行了补充（例如， 通过测定油菜籽中不存在的硫代葡萄糖苷的额外响应因子17尽管用于芥子油苷分析的液相色谱-质谱联用（LC-MS）平台和高通量实验方案日益普及18,19尽管如此，原始的HPLC-UV/PDA方法仍被科学家广泛使用。主要原因在于该方法操作简便、成本低廉，且对缺乏完善化学分析知识体系的实验室而言具有较高的可及性。为服务这一科研群体，本文详细阐述了从植物材料中提取硫代葡萄糖苷并利用HPLC-PDA分析其脱硫形式的实验方案。

<table><tbody><tr><td>用于高效液相色谱的甲醇HiPerSolv CHROMANORM&amp;reg;梯度级</td><td>VWR</td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠（NaOAc）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>（&amp;minus;）-芥子碱水合物&lt;br/&gt;来自山葵&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>芳基硫酸酯酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃/木棒</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>2 mL反应管</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotilabo培养皿</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>废液盘</td></tr><tr><td>Rotilabo密封夹</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 12 L冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>乙腈超梯度级</td><td>VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>pH电极</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2115</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Heraeus Multifuge X1离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>预柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;柱（4.6 × 10 mm，5 &amp;micro;m，300 &amp;Aring;）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acclaim 300色谱柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;柱（4.6 × 150 mm，3 &amp;micro;m，300 &amp;Aring;）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>配备柱温箱和紫外或PDA检测器</td></tr><tr><td>1,000 mL烧瓶</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>芥子油苷标准品</td><td>Phytoplan</td><td>多种</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

一种简便的芥子油苷提取与高效液相色谱（hplc）分析方法

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

芥子油苷是一类研究较为深入且结构高度多样的天然植物化合物。它们在植物抗性、油菜籽油品质、食品调味以及人类健康方面发挥着重要作用。当植物组织受损时，芥子油苷会与黑芥子酶（myrosinase）接触，从而释放其生物活性。这一过程产生具有辛辣味和毒性的降解产物，例如异硫氰酸酯和腈类化合物。目前已有超过130种结构不同的芥子油苷被鉴定。芥子油苷的化学结构决定了其降解产物的种类，进而影响其生物学活性。这种活性可能从有害（例如，前致甲状腺肿苷）到有益（例如，萝卜硫苷）不等。每种含芥子油苷的植物物种都具有其特有的芥子油苷谱型。因此，准确鉴定并可靠定量芸薹属叶、种子和根类作物中存在的不同芥子油苷，或在生态学研究中对其野生近缘种进行分析，显得尤为重要。本文介绍了一种经过充分验证、靶向性强且稳健的方法，可用于分析多种植物物种及植物器官中的芥子油苷谱型。将粉碎后的植物材料用甲醇-水混合液在高温下提取，以灭活黑芥子酶活性，从而获得完整的芥子油苷。随后，将所得提取物上样至离子交换柱进行纯化。经硫酸酯酶处理后，脱硫芥子油苷用水洗脱，洗脱液经冷冻干燥。残留物溶于精确体积的水中，通过高效液相色谱（HPLC）结合光电二极管阵列（PDA）或紫外（UV）检测器进行分析。通过与商业标准品的保留时间和紫外光谱进行比对，实现对目标物的检测与定量。浓度计算基于芥子油苷标准曲线以及已确立的响应因子。本文还讨论了该方法相较于更快、技术更先进的分析手段所具有的优缺点。

该方法能够检测和分离所有结构类别中常见的去硫酸根葡萄糖苷（图3）。有害的2-羟基葡萄糖苷前体——丙硫苷在色谱图中出峰较早，并与有益的葡萄糖苷萝卜硫苷（本样品中唯一的甲基亚砜基葡萄糖苷）实现了明显分离。芥子苷、葡萄糖苷芥子油苷和葡萄糖苷芥菜籽苷形成了一组随侧链长度增加（分别为C3、C4和C5）而依次洗脱的烯基葡萄糖苷系列。对于两种甲硫代烯基葡萄糖苷——葡萄糖苷异伯韦林（C3）和葡萄糖苷芥子油苷（C4），也可观察到类似的规律性洗脱顺序。三种吲哚类葡萄糖苷——葡萄糖苷芸苔素及其衍生物4-羟基葡萄糖苷芸苔素和1-甲氧基葡萄糖苷芸苔素（新葡萄糖苷芸苔素）的峰也得到了清晰分离。需要注意的是，由于在提取物混合过程中加入了根部提取物，该Brassica提取物中，新葡萄糖苷芸苔素和葡萄糖苷芥子油苷以及本样品中唯一的芳香族葡萄糖苷——葡萄糖苷旱金莲苷的峰特别高9。
<img alt="色谱分析；化合物；波谱数据；色谱图；峰鉴定" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：芥子油苷提取物的色谱图 高效液相色谱（HPLC）色谱图的细节（1–32 分钟），来源于根和茎样品混合物的分析结果 芥菜（Brassica nigra）、芜菁（B. rapa） 和 B. oleracea 峰标记表示保留时间及已鉴定的去硫酸化硫代葡萄糖苷（GSL）的缩写。PRO = 前告伊庭（2-OH-3-丁烯基 GSL）；RAP = 萝卜硫苷（4-甲基亚砜丁基 GSL）；SIN = 芥子苷（2-丙烯基 GSL）；GNA = 葡萄糖苷A（3-丁烯基 GSL）；4OH = 4-羟基葡萄糖基布拉西坎；IBV = 葡萄糖苷I（3-甲硫丙基 GSL）；GBN = 葡萄糖苷B（4-戊烯基 GSL）；ERU = 葡萄糖苷E（4-甲硫丁基 GSL）；GBC = 葡萄糖基布拉西坎（吲哚-3-基甲基 GSL）；NAS = 葡萄糖苷N（2-苯乙基 GSL）；NEO = 新葡萄糖基布拉西坎（1-MeOH-葡萄糖基布拉西坎）。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
长链甲基亚砜基葡糖苷（methylsulfinyl glucosinolates）在模式植物Arabidopsis中常见，也表现出洗脱序列规律，如在奥地利蔊菜（Rorippa austriaca）的根提取物中所见。葡糖橙皮素（glucohesperalin，C6）、葡糖芥子素（glucosiberin，C7）、葡糖粗毛芥素（glucohirsutin，C8）和葡糖芜菁苷（glucoarabin，C9）在色谱图上以规律的间隔依次出现（图4）。结合各峰的紫外光谱，此类具有洗脱规律的同系序列可用于对未知葡糖苷类化合物进行分类和初步鉴定。
<img alt="色谱结果，HPLC图谱，化合物保留时间，化学分析，峰鉴定。" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：Rorippa austriaca 根提取物中脱硫硫代葡萄糖苷的色谱图（9–30 分钟片段）。 峰标签标明了保留时间以及已鉴定脱硫硫代葡萄糖苷（GSL）的缩写。HES = 葡萄糖芸香苷（6-甲基亚砜己基 GSL）；SBE = 葡萄糖芥子苷（7-甲基亚砜庚基 GSL）；GBC = 葡萄糖莱菔子苷（吲哚-3-基甲基 GSL）；HIR = 葡萄糖毛芥子苷（8-甲基亚砜辛基 GSL）；ARA = 葡萄糖阿拉伯苷（9-甲基亚砜壬基硫代葡萄糖苷）；NEO = 新葡萄糖莱菔子苷（1-MeOH-葡萄糖莱菔子苷）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>通用名称</td>
			<td>侧链结构</td>
			<td>Rt (min)*</td>
			<td>229 nm</td>
			<td>参考文献编号</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脂肪族葡萄糖苷</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucocapparin</td>
			<td>甲基</td>
			<td>3.5</td>
			<td>1</td>
			<td>布朗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>芥子油苷</td>
			<td>2-丙烯基</td>
			<td>5.5</td>
			<td>1</td>
			<td>Brown, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconapin</td>
			<td>3-丁烯基</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.11</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucobrassicanapin</td>
			<td>4-戊烯基</td>
			<td>13.5</td>
			<td>1.15</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucoiberverin</td>
			<td>3-甲硫基丙基</td>
			<td>10.9</td>
			<td>0.8</td>
			<td>Brown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucoerucin</td>
			<td>4-甲基硫代丁基</td>
			<td>14.0</td>
			<td>0.9</td>
			<td>布朗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucoiberin</td>
			<td>3-甲基亚砜基丙基</td>
			<td>3.7</td>
			<td>1.2</td>
			<td>Brown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>萝卜硫苷</td>
			<td>4-甲基亚砜基丁基</td>
			<td>4.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>布朗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucoalyssin</td>
			<td>5-甲基亚砜基戊基</td>
			<td>7.6</td>
			<td>0.9</td>
			<td>Brown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucohesperin</td>
			<td>6-甲基亚砜基己基</td>
			<td>10.5</td>
			<td>1</td>
			<td>布朗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖苷酸内酯</td>
			<td>7-甲基亚砜基庚基</td>
			<td>13.5</td>
			<td>1</td>
			<td>布朗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucohirsutin</td>
			<td>8-甲基亚砜基辛基</td>
			<td>16.8</td>
			<td>1.1</td>
			<td>布朗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucoarabin</td>
			<td>9-甲基亚砜基壬基</td>
			<td>20.5</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucocheirolin</td>
			<td>3-甲基磺酰基丙基</td>
			<td>4.2</td>
			<td>0.9</td>
			<td>布朗</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progoitrin</td>
			<td>2(R)-OH-3-丁烯基</td>
			<td>4.5</td>
			<td>1.09</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconapoleiferin</td>
			<td>2-OH-5-戊烯基</td>
			<td>8.3</td>
			<td>1</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>吲哚葡糖硫苷</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-羟基葡萄糖基芸苔素</td>
			<td>4-羟基吲哚-3-基甲基</td>
			<td>11.2</td>
			<td>0.28</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucobrassicin</td>
			<td>吲哚-3-基甲基</td>
			<td>15.3</td>
			<td>0.29</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-甲氧基葡萄糖苷芥子酸</td>
			<td>4-甲氧基吲哚-3-基甲基</td>
			<td>18.2</td>
			<td>0.25</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>新葡萄糖苷芥子油苷</td>
			<td>1-甲氧基吲哚-3-基甲基</td>
			<td>22.5</td>
			<td>0.2</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>芳香族葡萄糖苷</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinalbin</td>
			<td>4-羟基苄基</td>
			<td>8.1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>布赫纳</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosibarin</td>
			<td>2(R)-OH-2-苯乙醇</td>
			<td>12.1</td>
			<td>0.95</td>
			<td>见下文</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucobarbarin</td>
			<td>2(S)-OH-2-苯乙醇</td>
			<td>12.7</td>
			<td>0.95</td>
			<td>Buchner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucotropaeolin</td>
			<td>苄基</td>
			<td>13.8</td>
			<td>0.95</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluconasturtiin</td>
			<td>2-苯乙基</td>
			<td>18.0</td>
			<td>0.95</td>
			<td>Buchner, EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未知——类似脂肪族/芳香族的紫外光谱</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未知—吲哚样光谱</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25</td>
			<td>EC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* 保留时间（Rt）约为最接近的0.1分钟（±0.3分钟，取决于色谱柱和洗脱液质量）。保留时间在配备C的ThermoFisher/Dionex Ultimate高效液相色谱平台测定18 色谱柱（150 x 4.6 mm，3 微米粒径）加 C18 预柱（10 × 4.6 mm，5 微米粒径）采用梯度程序，如 表1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5"># 反应因子参考文献：Buchner, R. 在 J.P. Wathelet（主编）《油菜籽中的芥子油苷》50-58（Martinus Nijhoff Publishers, 1987）；Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M. &amp; Gershenzon, J. 拟南芥不同器官及发育阶段中芥子油苷积累的变异。Phytochemistry. 62 (3), 471-481, doi:10.1016/S0031-9422(02)00549-6, (2003)；EC. 油料种子——芥子油苷的高效液相色谱测定。欧洲共同体官方公报. L 170/28. 附件VIII 03.07.27-34 (1990)。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：植物提取物中常见脱硫-硫代葡萄糖苷的响应因子及其在C18色谱柱上的近似保留时间。 流动相、梯度程序、柱温及流速同表1。

本文详细描述了一种从研磨的植物材料中提取芥子油苷的成熟且可靠的方案。提取物经柱上硫酸酯酶处理后，洗脱脱硫芥子油苷，并通过高压液相色谱进行分析。

一种简便的芥子油苷提取与高效液相色谱（HPLC）分析方法

硫代葡萄糖苷是一类经过深入研究且具有高度多样性的天然植物化合物。它们在植物抗性、油菜籽油……中发挥着重要作用。

本实验方案的总体目标是对植物及其他生物样品中的芥子油苷进行简便且直接的分析。该提取与分析芥子油苷的方法可用于解答植物-昆虫生态学、植物病理学、植物育种及食品科学领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于其经过充分验证，并可广泛适用于多种生物样品。尽管该方法主要用于定量植物材料中的芥子油苷，但也可应用于土壤或加工食品。由于主要使用常规实验室设备，该提取步骤几乎可在任何实验室中进行。通常，初次接触该方法的人员若至少阅读并观看过一次视频，将能更好地完成分析和检测。开始实验步骤时，将10克G-25交联葡聚糖凝胶与125毫升超纯水混合。将混合物储存于带盖瓶中，置于4摄氏度条件下。然后，将10,000单位的H-1型芳基硫酸酯酶溶解于30毫升超纯水中。加入30毫升无水乙醇，充分搅拌混合物。在室温下以2,650 × g离心20分钟。将上清液与90毫升无水乙醇在烧杯中混合。混合后转移至新的离心管中。在室温下以1,030 × g离心15分钟。弃去上清液。将沉淀物溶解并合并于总共25毫升超纯水中。充分涡旋混匀，然后将混合液转移至1毫升离心管中。将硫酸化样品在20摄氏度下储存，可保存长达一年。接下来，称取约90毫克的原儿茶酸，精确至1微克并记录重量。然后，将原儿茶酸一水合物溶解于10毫升超纯水中。由此原儿茶酸储备液配制五种浓度在50至750微摩尔之间的标准溶液。将参考溶液储存于1.5毫升离心管中，置于20摄氏度条件下。随后，为每个样品和参考溶液，在柱状排列的离心管架位置上标记一个2毫升的微量离心管。用解剖针在每个微量离心管盖上穿孔，以备后续冻干使用。将标记好的试管按照标记列相同的排列方式和间距放入试管架中。准备玻璃移液管柱时，使用木棒或玻璃棒将一块1厘米×1厘米的玻璃棉轻轻压入移液管中，并将玻璃棉压实于移液管管体与管颈的连接处。将移液枪头柱放入支架上每个已标记的位置。将支架置于废液托盘上方。剪掉一个塑料1毫升移液枪头的末端。充分混匀制备好的糊精凝胶。然后使用加宽的移液器吸头，将0.5毫升的糊精凝胶加入每个层析柱中。检查层析柱是否有糊精凝胶泄漏，如有泄漏，需更换相应层析柱。所有层析柱装入葡聚糖凝胶后，用1毫升超纯水洗涤每根层析柱。取50至100毫克游离步态的、充分研磨的植物材料，精确称重至0.1毫克，放入带安全盖的2毫升反应管中，并记录重量。在每个反应管中放入两颗直径为3毫米的金属球。向每根试管中加入 1 毫升超纯水中配制的 70% 甲醇，短暂涡旋混匀。用额外的安全盖封闭试管，并立即放入 90 至 92 摄氏度的水浴中。加热试管直至锯末开始沸腾。将试管转移至超声波清洗器中，对样品进行超声加热处理15分钟。在超声处理期间，开始解冻硫酸盐样品及sinogram参考样本。超声处理结束后，在室温下以2,700 × g离心10分钟。将上清液和解冻的正弦图参考物分别加入对应的柱中，注意不要将植物残渣吸入移液器。向每根管中加入1毫升70%甲醇。涡旋混匀混合物。超声处理混合物15分钟。在相同条件下再次离心试管。将上清液加载至相应的层析柱中。向每个柱中加入两份1毫升的70%甲醇，每份加入后让柱子流干。用1毫升超纯水洗涤每个柱子以去除残留的甲醇。然后用两份1毫升的20毫摩尔/升醋酸钠缓冲液（pH 5.5）洗涤每个柱子。当醋酸钠缓冲液的最后部分流尽并进入废液架后，将废液架从废液托盘中取出，并用纸巾擦干架脚。将废液架置于标记好的微量离心管阵列上方，使层析柱尖端对准相应的离心管。向每根层析柱中加入 20 µL 硫酸化溶液，确保溶液完全覆盖层析柱填料表面。用50微升醋酸钠缓冲液将硫酸酯溶液冲洗至柱材料中。必须确保硫酸酯被充分洗入柱内，因为酶必须位于柱上才能与柱上结合的完整芥子油苷发生反应。将硫酸酯溶液冲洗至各柱后，用铝箔覆盖各柱，静置过夜。随后，用两份0.75毫升超纯水依次洗脱各柱中的去硫酸根芥子油苷。当层析柱流干后，取下柱架并盖紧每个管盖。将管子在液氮中或-80摄氏度下冷冻至少30分钟。将样品冻干12至24小时。将每种残留物溶解于1毫升超纯水中。然后将每个样品和参照物转移至已标记的HPLC样品瓶中。使用反相CAT色谱柱分离提取物。使用229纳米的检测波长。经HPLC分离后，可通过与已知芥子油苷标准品的保留时间和紫外光谱进行比对，鉴定芥子油苷。样品中芥子油苷的浓度根据芥子油苷校准曲线及文献报道的响应因子计算得出。由此可测定原始植物样品中芥子油苷的浓度。在所用的高效液相色谱条件下，有害的促甲状腺原苷出峰较早，并与具有生物学益处的萝卜硫苷实现了良好分离。内源性芥子油苷也得到了良好分离。随着醇类、甲基醇类以及更长链的甲基亚砜基葡糖苷类化合物侧链长度的增加，可观察到溶致序列现象。因此，未知葡糖苷类化合物可根据这些溶致序列结合紫外光谱进行初步分类。在适当操作条件下，一人可在一天工作时间内完成150至200个样品的提取。还需要一天时间来冻干样品并为HPLC分析做准备。完成此步骤后，可进一步采用其他方法（如LCMS）来鉴定色谱图中未知的脱硫-硫代葡萄糖苷。观看本视频后，您应能充分掌握如何从生物样品中提取硫代葡萄糖苷，并通过HPLC进行分析。请务必注意，使用甲醇可能具有极高的危险性，操作时必须在通风橱内进行。

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一种简便的芥子油苷提取与高效液相色谱（HPLC）分析方法

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