一种简便的芥子油苷提取与高效液相色谱（HPLC）分析方法

本实验方案的总体目标是对植物及其他生物样品中的芥子油苷进行简便且直接的分析。该芥子油苷提取与分析方法可用于解答植物-昆虫生态学、植物病理学、植物育种以及食品科学领域的关键问题。该技术的主要优势在于其经过充分验证，且可广泛适用于多种生物样品。

尽管该方法主要用于定量植物材料中的硫代葡萄糖苷，但也可应用于土壤或加工食品。由于主要使用常规实验室设备，该提取步骤几乎可在任何实验室中进行。通常，初次接触该方法的人员在至少阅读并观看一次视频后，能更好地完成分析和检测。

开始实验步骤时，将10克G-25交联葡聚糖凝胶与125毫升超纯水混合。将混合物储存于带盖瓶中，置于4摄氏度条件下。然后，将10,000单位的H-1型芳基硫酸酯酶溶解于30毫升超纯水中。

向其中加入30毫升无水乙醇，充分搅拌混合物。在室温下以2,650 × g离心20分钟。将上清液与90毫升无水乙醇在烧杯中混合。

混合后倒入新的离心管中。在室温下以1,030 ×g离心15分钟。弃去上清液。

将沉淀物溶解并混匀于总共25毫升超纯水中。充分涡旋混匀后，将混合液转移至1毫升离心管中。硫酸化样品可在-20摄氏度保存长达一年。

接下来，称取约90毫克的辛诺格拉姆，并将重量记录至1微克精度。然后，将辛诺格拉姆一水合物溶解于10毫升超纯水中。由此辛诺格拉姆储备液配制五种浓度范围为50至750微摩尔的对照溶液。

将参考溶液储存于1.5毫升离心管中，置于20摄氏度条件下。接着，为每个样品和参考溶液，在2毫升微量离心管上标记，并将其放置于列式管架中的相应位置。用解剖针在每个微量离心管盖上穿孔，以备后续冻干使用。

将标记好的试管以与标记列相同的排列方式和间距放入试管架中。准备玻璃移液管柱时，使用木棒或玻璃棒轻轻将一块 1 厘米 × 1 厘米的玻璃棉压入移液管中，将玻璃棉压实于移液管管体与管颈的连接处。

将移液枪吸头柱放入支架上每个已标记的位置。将支架置于废液托盘上方。剪掉一个塑料1毫升移液枪吸头的末端。

充分振荡制备好的糊精凝胶。然后使用加宽的移液枪头，将0.5毫升制备好的糊精凝胶加入每根层析柱中。检查层析柱是否有糊精凝胶泄漏，如有泄漏，需更换相应层析柱。

所有柱子加载葡聚糖凝胶后，用1毫升超纯水洗涤每个柱子。取50至100毫克游离步态的、充分研磨的植物材料，精确称重至0.1毫克，放入带安全盖的2毫升反应管中，并记录重量。在每个管中放入两颗直径为3毫米的金属球。

向每支试管中加入1毫升超纯水中配制的70%甲醇，短暂涡旋混匀。用额外的安全盖封闭试管，并立即放入90至92摄氏度的水浴中。加热试管直至锯末开始沸腾。

将试管转移至超声波清洗仪中，对样品进行超声加热处理15分钟。在超声处理期间，开始解冻硫酸盐样品及正弦图参考样品。超声处理结束后，在室温下以2,700 ×g离心样品10分钟。

将上清液和解冻后的正弦图参考样品加载到相应的柱子中，注意不要将植物材料吸入移液器。向每根试管中加入1毫升70%甲醇。涡旋混合物。

超声处理混合物15分钟。在与之前相同的条件下再次离心试管。将上清液加载到相应的层析柱中。

向每个柱中加入两份1毫升的70%甲醇，每份加入后让柱子流干。用1毫升超纯水洗涤每个柱子以去除残留的甲醇。然后用两份1毫升的20毫摩尔/升乙酸钠缓冲液（pH 5.5）洗涤每个柱子。

当最后一部分乙酸钠缓冲液流入废液架后，将废液架从废液托盘中取出，并用纸巾擦干架脚。将废液架置于标记好的微量离心管阵列上方，使层析柱的尖端对准相应的离心管。向每根层析柱中加入 20 µL 硫酸化溶液，确保溶液完全接触层析柱材料的表面。

用50微升醋酸钠缓冲液将硫酸酯溶液冲洗至柱材料中。确保硫酸酯被充分洗入柱中至关重要。酶必须位于柱上，才能与柱上结合的完整芥子油苷发生反应。

将硫酸酯溶液冲洗至各柱后，用铝箔覆盖各柱，静置过夜。随后，用两份每份0.75毫升的超纯水从每根柱中洗脱脱硫酸根芥子油苷。

当层析柱流干后，取下柱架并盖紧各管盖。将管子在液氮中或-80摄氏度下冷冻至少30分钟。将样品冷冻干燥12至24小时。

将每种残留物溶解于1毫升超纯水中。然后将每个样品和参照物转移至已标记的HPLC样品瓶中。使用反相CAT色谱柱分离提取物。

采用 229 纳米的检测波长。通过高效液相色谱分离后，可通过与已知芥子油苷标准品的保留时间和紫外光谱进行比对，鉴定芥子油苷。样品中芥子油苷的浓度根据芥子油苷校准曲线及文献中的响应因子数值计算得出。

由此可确定原始植物样品中芥子油苷的浓度。在所用的高效液相色谱条件下，有害的恶唑烷硫酮葡萄糖苷出峰较早，并与具有生物学益处的萝卜硫苷有效分离。内源性芥子油苷也得到了良好分离。

随着醇类、甲基醇类以及更长链的甲基亚砜基葡糖苷类化合物侧链长度的增加，可观察到溶致序列。因此，未知的葡糖苷类化合物可根据这些溶致序列结合紫外光谱进行初步分类。在适当准备条件下，一个人在一个工作日内可提取150至200个样品。

还需要一天时间来冻干样品并进行HPLC前处理。完成此步骤后，可进一步采用其他方法（如LCMS）来鉴定色谱图中未知的脱硫酸根芥子油苷。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从生物样品中提取芥子油苷，并通过HPLC对其进行分析。

请务必注意，甲醇操作可能具有极高危险性，必须始终在通风橱内进行。