一种高效快速的HPLC-QQQ-MS法用于测定药用植物中托烷类生物碱含量

我们建立了一种HPLC-QQQ-MS方法，用于快速定量测定藏茵陈中三种主要的托烷类生物碱。传统的HPLC对托烷类生物碱缺乏足够的灵敏度。本方法采用高灵敏度的质谱技术解决了这一问题。

首先，准确称取10.0毫克的莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱和氢溴酸山莨菪碱对照品，分别置于10毫升容量瓶中。向每个容量瓶中加入色谱级甲醇至刻度线。

使用超声处理将标准品充分溶解，制备浓度为1.0毫克/毫升的单一标准储备溶液。然后将储备溶液转移至棕色试剂瓶中，于4摄氏度避光保存。为制备10微克/毫升的混合标准中间溶液，用移液器吸取100微升上述已制备的每种储备溶液，加入10毫升容量瓶中。

然后，加入色谱级甲醇至刻度线，以稀释溶液。接着，对新鲜的苦参材料进行冷冻干燥。然后，使用高速研磨机将干燥后的材料研磨成均匀的粉末。

将粉末过0.25毫米标准试验筛。准确称取20毫克过筛后的粉末，转移至100毫升容量瓶中，加入色谱级甲醇至刻度线下方。

接下来，在室温下进行超声提取30分钟。然后取出容量瓶，于室温下冷却至25摄氏度。加入色谱级甲醇至100毫升刻度线，涡旋混匀2分钟。

然后，取1 mL已制备的提取液加入100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，充分振摇使其混合均匀，得到用于HPLC进样的母液。

进行样品过滤时，准备一支1毫升一次性无针注射器和一个0.22微米有机相微孔滤膜。吸取1.2毫升母液注入注射器中，缓慢推动液体使其通过滤膜过滤。将滤液收集至带有内插管的2毫升样品瓶中，并用瓶盖 tightly 密封。

通过量取1000毫升超纯水来配制流动相A。加入1.0毫升色谱级甲酸，使用磁力搅拌器均匀混合10分钟。接下来，直接使用色谱级甲醇配制流动相B，无需额外处理。

使用独立的超声波脱气装置，分别对流动相 A 和 B 在 40 千赫兹条件下脱气 15 分钟。将脱气后的流动相分别装入不同的溶剂瓶，并连接至高效液相色谱系统对应的 A 和 B 管路。采用 C18 柱进行色谱分离。

以甲醇与水按80:20的比例平衡色谱柱，流速为0.3毫升/分钟，持续30分钟。将色谱柱柱温箱温度设置为30°C，并提前预热10分钟。然后，将流速设为0.60毫升/分钟，进样体积设为2微升，检测波长设为210纳米。

随后，根据所提供的条件设置梯度洗脱程序。使用配备电喷雾离子源的三重四极杆质谱仪，在正离子模式下进行质谱检测。设定雾化器压力为15 psi，毛细管电压为4,000 V，气体温度为300 °C，气体流速为11 L/min。

然后，设置多反应监测离子对的参数。为鉴定前体离子，将各标准溶液直接注入质谱仪，在MS2扫描模式下进行检测。方法学验证完成后，采用多反应监测模式进行数据采集。

使用此处提供的每种分析物的优化参数，包括前体离子、产物离子跃迁、碎裂电压和碰撞能量。启动定性分析软件。选择文件并选择导入数据，以导入所有收集的数据文件。

检查每个提取离子色谱图中目标峰的峰形对称性和保留时间一致性。在定量模块中选择 MRM 转换，输入各组分的前体离子和产物离子对，并提取相应的提取离子色谱图。

计算峰面积以进行定量分析。在优化的高效液相色谱条件下，三种目标托烷生物碱均在20分钟内成功分离。山莨菪碱与东莨菪碱之间的分离度为8.67。

尽管山莨菪碱与莨菪碱之间的分离度达到11.58，所有分离度数值均显著超过1.5的基线分离标准。所有分析物在0.014至0.320微克/毫升浓度范围内均表现出良好的线性关系，相关系数大于0.99。东莨菪碱、山莨菪碱和莨菪碱的平均回收率分别为101.44%、100.25%和99.56%，相对标准偏差分别为1.85%、2.35%和1.9%。

对10份唐古特山莨菪样品中三种托烷类生物碱的含量进行定量分析显示，东莨菪碱含量在6号样品中为0.3667毫克/克，在7号样品中最高，达1.0356毫克/克。山莨菪碱含量在6号样品中为0.0269毫克/克，在10号样品中为0.3590毫克/克。莨菪碱含量在2号样品中为0.2930毫克/克，在10号样品中最高，达1.4989毫克/克，其中4号、7号、9号和10号样品中的含量相对较高。

本方案可实现对三种主要托烷类生物碱的快速、准确定量。关键挑战在于确保仪器操作和样品标准化制备，以获得准确的测量结果。该方法可进一步拓展用于分析和定量唐古特山莨菪中的其他代谢物。