人诱导性多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案用于神经毒性检测

本实验的总体目标是将来源于人诱导性多能干细胞克隆的神经干细胞分化为神经元细胞与胶质细胞的混合培养物。该模型适用于药物和化学物质的毒性筛选。这种体外模型可用于评估化学物质对神经元和胶质细胞分化过程中所激活的信号通路的干扰作用。

该系统的主要优势在于采用来源于诱导性多能干细胞的人源模型，为传统上使用的癌细胞和动物原代培养提供了一种替代方案，可用于研究神经元和胶质细胞混合群体中的神经毒性。本实验操作将由本实验室的博士后研究员Francesca Pistollato和研究生Carolina Nunes进行演示。首先对hiPSC细胞集落进行传代培养。

在超净台中，于体视显微镜下以4倍放大倍数操作，使用1毫升注射器配30号针头，将干细胞集落切割成约200微米×200微米的方形小块。切割集落需要熟练的手动操作技能，以获得大小均一的片段。

使用市售的切割工具可能会有所帮助。然后使用200微升移液器，轻轻吸取菌落碎片下方的培养基，以将碎片从培养皿表面剥离并抬起。将约100个菌落碎片转移至已包被合格基质DMEM F12的60毫米培养皿中，该培养皿内含有4毫升完全hiPSC培养基。

然后将新培养皿置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。每天进行一次完全换液，并在4倍和10倍放大倍数下使用相差显微镜观察集落的形态。在分化程序的第0天，通过每60毫米培养皿添加3毫升培养基来更新hiPSC培养基。

然后像之前一样切割并分离出200微米的片段。用移液器将分离的片段和培养基转移至15毫升离心管中。用2毫升完全hiPSC培养基冲洗培养皿，回收所有片段。

然后以112 ×g离心1分钟。离心后，吸除上清液，并将沉淀物在5 mL完全培养基中轻轻重悬。将全部体积接种至60 mm超低吸附组织培养皿中。

将培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜。第二天使用倒置显微镜观察细胞。第1天的拟胚体应呈现为圆形，且彼此分离，如图所示。

然后用移液器将类胚体和培养基从培养皿中转移至15毫升离心管中。以112 ×g离心1分钟。在第2天，吸去预先准备好的60毫米培养皿中的标准基质包被液，并向培养皿中加入5毫升完全神经上皮诱导培养基（NRI）。

在体视显微镜下以4倍放大倍数操作，使用200微升移液器收集约50个悬浮的类胚体，并转移至一个包被好的培养皿中。随后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。次日，即分化程序的第3天，在10倍放大倍数下于显微镜下检查培养皿，确保所有类胚体均已贴壁。

随后用完全NRI培养基轻轻进行全量换液。每隔一天更换一次NRI培养基，直至第7天，此时应可见类玫瑰花环样的神经上皮细胞聚集体。在第7天，通过移液将100微升用培养基稀释的标准基质液加入每个孔中，对96孔板进行包被。

第8天，在无菌条件下，于体视显微镜下以10倍放大倍数将类玫瑰花结样集落切割成小块。注意，当用针触碰时，这些集落容易从培养皿上脱落。若发生脱落，可用针尖将脱落的集落部分解离。

如果莲座叶仍部分附着，可使用200微升移液器完成莲座叶片段的分离。莲座叶切段操作需要良好的手动技巧和精确性，以避免切到非神经外胚层衍生物。随后将莲座叶片段及其培养基收集至15毫升锥形管中。

用两毫升 NRI 培养基冲洗培养皿，以回收所有组织碎片。随后在 112 ×g 条件下离心 1 至 2 分钟，使花环状碎片沉淀。吸除上清液后，将沉淀物轻轻重悬于 1 毫升预热的不含钙和镁的 1× DPBS 中。

轻轻吹打花环状碎片以部分解离。然后加入4毫升完全NRI培养基，使用台盼蓝和自动细胞计数仪进行细胞计数。接着从96孔板中吸除标准基质包被液，并将细胞以约15,000个细胞/平方厘米的密度接种至各孔中，使用NRI培养基。

将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。第10天，使用完全神经元分化培养基进行全量换液。该代表性图像显示了体外培养12天后经nestin（绿色）和beta three tubulin（红色）染色的神经玫瑰花环结构。

此处为体外培养28天的细胞，分别用红色标记βIII微管蛋白，绿色标记NF200。该代表性图像显示了神经干细胞在体外培养21天后分化的神经元细胞，其中NF200以红色标记，tow以绿色标记。此处同一培养物中的胶质细胞以红色标记GFAP。

该直方图比较了IMR90 hiPSC衍生物以及由IMR90 hiPSC来源的NSC分化而来的细胞中巢蛋白（nestin）、微管相关蛋白2（MAP two）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid）、囊泡型谷氨酸转运蛋白1（vesicular glutamate transporter one）和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）阳性细胞的定量结果。这些使用10倍物镜拍摄的相差图像显示了神经干细胞经过21天分化的过程。通过遵循这些操作步骤，还可进行其他检测，例如定量实时PCR和多层面重新分析，以评估神经元和胶质细胞的生理特性与表型，并分析化学物质的作用效果。

请务必注意，操作化学化合物可能具有极高的危险性。因此，在进行化学处理时，尤其是在通风橱内操作时，必须始终采取相应的预防措施，佩戴护目镜、手套或口罩。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人诱导性多能干细胞出发，获得包含神经元和胶质细胞的混合分化细胞群体。该体系可作为一种合适的体外模型，用于神经毒性检测的相关研究。