Name: 将人诱导的多能干细胞分化为神经元和神经胶质的混合培养物进行神经毒性测试的方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 了解将人诱导多能干细胞分化为神经元和神经胶质混合培养物的详细方案。该方法利用hiPSCs建立体外神经毒性测试模型，适用于药物筛选和化学品安全性评估，为研究神经发育机制提供可靠工具。

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作者感谢法国埃夫里的I-Stem研究所Marc Peschanski博士提供了IMR90-hiPSCs；感谢意大利克雷莫纳Avantea srl公司的Giovanna Lazzari博士和Silvia Colleoni博士；感谢德国波恩大学Simone Haupt博士；感谢意大利罗马意大利技术研究院Tiziana Santini博士在免疫荧光染色评估方面提供的建议；感谢意大利帕多瓦大学Benedetta Accordi博士、Elena Rampazzo博士和Luca Persano博士在反相蛋白微阵列（RPPA）分析及抗体验证方面的贡献。经费支持：本研究由欧盟资助项目“SCR&amp;Tox”（资助协议编号 N&#176;. 266753).

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作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了一种稳健且相对快速的将IMR90-hiPSCs分化为终末期神经元和胶质细胞的方案。以往基于hESCs和hiPSCs发表的神经元分化方案通常可获得高比例的神经前体细胞25,26，以及大量目标神经元细胞27,28,29,30,31,32,33。类似地，本文所述的分化方案适用于生成包含GABA能、谷氨酸能和多巴胺能神经元细胞的混合培养物，同时伴有胶质细胞及少量nestin+细胞。谷氨酸能神经细胞（约35–42%）和GABA能神经细胞（约15–20%）的存在提示该培养体系具有前脑、皮层样特征，而多巴胺能神经元的少量存在（约13–20%）也可能指示中脑特异性。此外，少量nestin+细胞的持续存在可能适用于研究神经发生过程，以及化学物质对神经干细胞（NSCs）的潜在影响，因为NSCs主要局限于前脑的海马区和侧脑室下区（SVZ）34。进一步的免疫细胞化学和基因表达分析将有助于更精确地界定分化后细胞产物的区域特异性。
本文件所述分化方案中最关键的两个步骤是：（i）将hiPSC集落切割为均一的片段（这对生成大小均一的拟胚体至关重要）；以及（ii）切割神经外胚层结构（即玫瑰花环样结构）以进行神经干细胞分化，该步骤需要较高的手动操作技巧和精确性，以避免混入中胚层和内胚层细胞，从而防止最终分化获得的神经元和胶质细胞比例降低。
在扩增过程（作为未分化集落或神经干细胞）以及所有分化阶段中，对细胞的表型进行表征至关重要。特别是，神经/胶质细胞衍生物的基因和蛋白质表达谱应显示神经元相关信号通路的上调和激活，而多能性标志物的表达则应降低。
拟胚体（EBs）和神经外胚层衍生物（神经样集落）的生成在手动操作中可能具有挑战性，且容易产生变异。因此，我们开发了一种从神经样集落来源的神经干细胞（NSCs）扩增并进一步分化为神经元/胶质细胞的实验方案。
该分化方案的可能局限性主要包括：（i）分化的胶质细胞衍生物比例相对较低，以及（ii）缺乏成熟的神经元网络功能（表现为无簇状放电现象）。此外，特定亚群的星形胶质细胞可作为主要前体细胞或神经干细胞（NSCs）35。尽管在此类分化细胞培养物中未观察到nestin/GFAP双阳性细胞（数据未显示），但推测这些混合培养物中的GFAP+细胞为星形胶质前体细胞和星形胶质细胞。延长分化时间可能会增加星形胶质细胞的数量，并使其形态更加成熟，这已在此前Zhang团队的研究中得到初步提示36,37。
在新的毒性测试范式中，了解化学物质对生物通路的干扰效应在评估化学物质有害性时至关重要。因此， 体外 根据不良结局通路（AOP）的概念，测试系统应能够将不良效应与信号通路的扰动相关联。作为概念验证，可使用鱼藤酮评估Nrf2通路的激活，该通路参与细胞防御氧化应激或亲电应激的过程38，氧化应激是多种与发育性和成人性神经毒性相关的不良结局路径（AOP）中重要且常见的关键事件39.
鱼藤酮应可引发 Nrf2 通路的激活，可通过 Nrf2 蛋白的核转位以及 Nrf2 靶酶（包括 NQO1 和 SRXN1）表达水平的升高予以证实。研究发现，鱼藤酮可诱导 GFAP 蛋白水平呈剂量依赖性升高，提示星形胶质细胞被激活。40,41. 鱼藤酮还会减少多巴胺能（TH+) 细胞，这与之前的研究结果一致 体外 和 在体内 显示鱼藤酮依赖性多巴胺能细胞死亡的研究，因为这类神经元对氧化应激特别敏感21,22,23.
总之，这种由hiPSC衍生的神经元和胶质细胞培养模型是评估引发氧化应激并导致Nrf2通路激活的化学物质神经毒性效应的有力工具。由于该分化方案能够生成包含多种神经元（GABA能、多巴胺能和谷氨酸能神经元）与星形胶质细胞的混合培养体系，因此可能适用于研究生理和病理条件下神经元与胶质细胞之间的相互作用，例如在神经退行性疾病中的相互作用。例如， 帕金森病）。此外，存在较大量的神经干细胞（NSCs）可能有助于评估化学物质对神经前体细胞的潜在影响，因为神经前体细胞已知是化学诱导突变或病毒感染的主要靶标。42.

美国国家研究委员会报告1 设想了一种新的毒性测试范式，其中监管毒性测试将从依赖动物中观察到的表型变化的方法，转向关注作用机制的 体外 使用人类细胞的检测方法。多能干细胞（PSC）衍生物可能作为癌细胞模型的替代方案，因为所获得的细胞更接近人体组织的生理状态，可为研究化学物质诱导的不良效应提供更具相关性的工具。目前在基础研究和再生医学领域广泛应用的两种最有前景的用于毒性测试的PSC培养类型是人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs）。2,3这一专长如今可用于开发一类新型的毒理学方法 体外 旨在识别与不良效应发生相关的受干扰生理通路的检测方法 在体内然而，基于人胚胎干细胞（hESCs）的监管安全评估测试方法可能因涉及伦理问题以及各国对胚胎来源细胞使用的立法政策不同，而难以被所有欧盟成员国及全球各国所接受。
hiPSCs 具有与 hESCs 相似的特征4,5 并具有巨大的应用潜力 体外 方法，既可用于确定治疗靶点，也可用于安全性评估。此外，hiPSC技术克服了供体来源有限以及胚胎来源细胞所涉及的伦理问题。hiPSC面临的主要挑战在于证明这些细胞能够可重复地生成多种具有毒理学相关性的细胞衍生物，并表现出典型的人体组织特征与反应。通常采用预设水平的选定标志物来表征分化后细胞群体的特性，并评估分化过程的稳定性。
既往研究评估了hiPSCs生成神经元与胶质细胞混合培养物的适用性，并考察了线粒体呼吸链复合物I抑制剂鱼藤酮对Nrf2通路活化的影响，该通路是多种细胞类型中抗氧化防御机制的关键调控因子6,7。
本研究描述了一种将hiPSCs分化为神经元和胶质细胞混合培养物的实验方案，并提供了神经元/胶质细胞分化过程中被激活的信号通路（基因和蛋白水平）的详细信息。此外，本研究还展示了代表性结果，说明如何利用该hiPSC来源的神经元和胶质细胞模型评估急性（24小时）鱼藤酮处理所诱导的Nrf2信号通路激活，从而实现对氧化应激诱导的评估。
IMR90成纤维细胞由I-Stem（法国）通过使用pMIG载体病毒转导2种转录因子（Oct4和Sox2）重编程为hiPSCs6。类似的hiPSC模型也可应用。以下所述的方案总结了hiPSCs向神经干细胞（NSCs）分化，以及进一步向终末分化神经元和胶质细胞混合培养物分化的所有阶段（步骤1和2，有关该方案的详细描述请参见EURL ECVAM DBALM网站）8。
步骤3和4详细描述了另一种用于分离、扩增、冷冻保存以及进一步将神经干细胞（NSCs）分化为混合神经元和胶质细胞的方案（有关该方案的详细说明，请参见EURL ECVAM DBALM网站）9。步骤5描述了可在细胞承诺和分化各个阶段用于评估细胞表型特征的分析方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;完全hiPSC培养基：&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 基础培养基</td><td>干细胞技术</td><td>05851</td><td>（步骤 1.2.6）mTeSR1 完全培养基在 2 - 8 &amp;deg;C 长达 2 周。5x 补充剂可分装成工作 aliquots 并于 -20 &amp;deg;C在3个月内使用冷冻分装样品。</td></tr><tr><td>mTeSR1 5倍添加剂</td><td>干细胞技术</td><td>05852</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC-认证基质</td><td>康宁</td><td>354277</td><td>1:100（步骤1.1）。将Matrigel置于冰上解冻，准备 200 &amp;mu;L 分装并储存于 -80 &amp;deg;C。用于包被，稀释 200 &amp;mu;L 分装至20 mL DMEM/F12培养基中。</td></tr><tr><td>CryoStem 冻存培养基</td><td>Stemgent</td><td>01-0013-50</td><td>冻存约 100 个片段/250 &amp;mu;L/vial （步骤 1.2.1）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;&lt;strong&gt;hiPSC EB 培养基：&lt;/strong&gt;&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10829-018</td><td>（步骤 2.1.7）</td></tr><tr><td>Knockout血清替代物（KOSR）</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10828-028</td><td>20% 最终浓度（步骤 2.1.7）</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td><td>（步骤 2.1.7）</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL 终浓度（步骤 2.1.7）</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 溶液</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25030-081</td><td>2 mM 终浓度（步骤 2.1.7）</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Thermo-Fisher</td><td>31350-010</td><td>50 &amp;micro;M 终浓度（步骤 2.1.7）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;完全神经上皮诱导培养基（NRI）：&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3133-038</td><td>（步骤 2.3.1）</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td><td>（步骤 2.3.1）</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td><td>（步骤 2.3.1）</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL 终浓度（步骤 2.3.1）</td></tr><tr><td>肝素 I-A 型， &amp;ge;180 USP 单位/毫克</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>2 &amp;micro;g/mL 终浓度（步骤 2.3.1）</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13256-029</td><td>使用前添加，终浓度为 20 ng/mL（步骤 2.3.1）</td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>康宁</td><td>354234</td><td>1:100（步骤2.2）。将Matrigel置于冰上解冻，准备 200 &amp;mu;L 分装并储存于 -80 &amp;deg;C。用于包被，稀释 200 &amp;mu;L 分装至20 mL冷的DMEM/F12培养基中。</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>1:100（步骤2.2）。用1×PBS稀释。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;完全神经元分化培养基（ND）：&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Thermo-Fisher</td><td>21103049</td><td>（步骤 2.4.11）</td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩液）</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>（步骤 2.4.11）</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td><td>（步骤 2.4.11）</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL 终浓度（步骤 2.4.11）</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHC7045</td><td>终浓度为1 ng/mL。使用前添加。（步骤 2.4.11）</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHC7074</td><td>2.5 ng/mL 终浓度。使用前添加。（步骤 2.4.11）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;神经诱导培养基（NI）：&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3133-038</td><td>（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11140-035</td><td>（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17502-048</td><td>（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140-122</td><td>50 U/mL 终浓度（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>肝素 I-A 型， &amp;ge;180 USP 单位/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>2 &amp;micro;g/mL 终浓度（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（50倍浓度），不含维生素A</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12587010</td><td>（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM 溶液</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25030-081</td><td>2 mM 终浓度（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13256-029</td><td>终浓度为10 ng/mL。使用前添加（步骤3.3）</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHG6045</td><td>终浓度为 10 ng/mL。使用前添加（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PHC7074</td><td>2.5 ng/mL 终浓度。使用前添加（步骤 3.3）</td></tr><tr><td>定义的胰蛋白酶抑制剂（DTI）</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R007-100</td><td>预热于 37 &amp;deg;C. 向胰蛋白酶-EDTA（步骤 3.10）中加入等量的 DTI</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15400054</td><td>1:10。用不含钙和镁的1×PBS稀释胰蛋白酶-EDTA，将溶液预热至 37 &amp;deg;C （步骤 3.8）</td></tr><tr><td>CryoStor 细胞冻存培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2874-100ML</td><td>（步骤 4.2）</td></tr><tr><td>台盼蓝（0.4%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>多家制造商/供应商</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;TaqMan 探针组和基因表达分析试剂：&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro 试剂盒</td><td>Thermo-Fisher</td><td>AM1931</td><td>（步骤 5.1.6）</td></tr><tr><td>高容量 cDNA 逆转录试剂盒</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达主混合液</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00909233_m1</td><td></td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00258900_m1</td><td></td></tr><tr><td>NQO1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs02512143_s1</td><td></td></tr><tr><td>SRXN1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00607800_m1</td><td></td></tr><tr><td>HMOX1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01110250_m1</td><td></td></tr><tr><td>GSR</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00167317_m1</td><td></td></tr><tr><td>PAX6</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01088112_m1</td><td></td></tr><tr><td>神经外胚层干细胞</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00707120_s1</td><td></td></tr><tr><td>GRIA1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00181348_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAP43</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00967138_m1</td><td></td></tr><tr><td>GABRA3</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00968132_m1</td><td></td></tr><tr><td>GABRA1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00168058_m1</td><td></td></tr><tr><td>NR4A2</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00428691_m1</td><td></td></tr><tr><td>TH</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00165941_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>ACTB</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs99999903_m1</td><td></td></tr><tr><td>MAPT</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00902194_m1</td><td></td></tr><tr><td>SYP</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00300531_m1</td><td></td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs04260366_g1</td><td></td></tr><tr><td>POU5F1 (OCT4)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs04195369_s1</td><td></td></tr><tr><td>SOX1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01057642_s1</td><td></td></tr><tr><td>甲胎蛋白</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00173490_m1</td><td></td></tr><tr><td>KRT18</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01941416_g1</td><td></td></tr><tr><td>NPPA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00383230_g1</td><td></td></tr><tr><td>T</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00610080_m1</td><td></td></tr><tr><td>NCAM1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00941821_m1</td><td></td></tr><tr><td>NR4A1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00374226_m1</td><td></td></tr><tr><td>PHOX2A</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00605931_mH</td><td></td></tr><tr><td>PHOX2B</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00243679_m1</td><td></td></tr><tr><td>NARG2</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00973298_g1</td><td></td></tr><tr><td>SLC18A3</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00268179_s1</td><td></td></tr><tr><td>SLC5A7</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00222367_m1</td><td></td></tr><tr><td>ISL1</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs00158126_m1</td><td></td></tr><tr><td>LHX3</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Hs01033412_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 人蛋白激酶阵列</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4418721</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;免疫染色用抗体和试剂：&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-III-微管蛋白（Tuj1）</td><td>科文斯</td><td>MMS-435P</td><td>1:500（步骤 5.2.5）。也可使用其他抗体。</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4403</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NF200</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4142</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Acris Antibodies GmbH</td><td>AP02002SU-N</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5413</td><td>1:200</td></tr><tr><td>突触素（SYN）</td><td>Abcam</td><td>AB14692</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Tau</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MA5-12808</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nrf2</td><td>Abcam</td><td>AB62352</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Keap1</td><td>Abcam</td><td>AB66620</td><td>1:200</td></tr><tr><td>硫氧还蛋白还原酶1（SRXN1）</td><td>Abcam</td><td>AB92298</td><td>1:200</td></tr><tr><td>NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）</td><td>Abcam</td><td>AB2346</td><td>1:200</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Millipore</td><td>MAB4401</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>默克密理博</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>1:250</td></tr><tr><td>酪氨酸羟化酶（TH）</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200</td></tr><tr><td>γ-氨基丁酸（GABA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0310</td><td>1:100</td></tr><tr><td>囊泡型谷氨酸转运蛋白1（VGlut1）</td><td>Abcam</td><td>AB72311</td><td>1:500</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>4%（也可使用4%甲醛）</td></tr><tr><td>DPBS，无钙，无镁</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>BSA 35%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979-50ML</td><td>3.5%</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 594标记</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SA5-10040</td><td>1:500。（步骤 5.2.7）也可使用其他荧光染料标记的二抗。在此情况下，最终使用者应测试适当的稀释比例。</td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 488标记</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SA5-10166</td><td>1:500</td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 488标记</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SA5-10086</td><td>1:500</td></tr><tr><td>DAPI溶液（1 mg/mL）</td><td>Thermo-Fisher</td><td>62248</td><td>1:1000（步骤 5.2.7）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;用于反相蛋白质微阵列（RPPA）的抗体：&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4E-BP1（S65）</td><td>Abcam</td><td>AB81297</td><td>1:250（步骤 5.2.8 后注）</td></tr><tr><td>Akt（T308）</td><td>细胞信号传导</td><td>9275</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Akt（S473）</td><td>细胞信号传导</td><td>9271</td><td>1:100</td></tr><tr><td>AMPKα（T172）</td><td>细胞信号传导</td><td>2531</td><td>1:100</td></tr><tr><td>AMPKβ1（S108）</td><td>细胞信号传导</td><td>4181</td><td>1:100</td></tr><tr><td>ATF-2（T71）</td><td>细胞信号传导</td><td>9221</td><td>1:100</td></tr><tr><td>c-Jun（S63）</td><td>细胞信号传导</td><td>9261</td><td>1:200</td></tr><tr><td>c-Jun（S73）</td><td>细胞信号传导</td><td>9164</td><td>1:200</td></tr><tr><td>c-Kit（Y719）</td><td>细胞信号传导</td><td>3391</td><td>1:250</td></tr><tr><td>CREB（S133）</td><td>细胞信号传导</td><td>9191</td><td>1:100</td></tr><tr><td>EGFR（Y1068）</td><td>细胞信号传导</td><td>2234</td><td>1:50</td></tr><tr><td>ErbB2/HER2（Y1248）</td><td>细胞信号传导</td><td>2247</td><td>1:100</td></tr><tr><td>ERK 1/2，p44/42（T202/Y204）</td><td>细胞信号传导</td><td>9101</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>GSK-3α (S21)</td><td>细胞信号传导</td><td>9337</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Jak1 (Y1022/1023)</td><td>细胞信号传导</td><td>3331</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Lck (Y505)</td><td>细胞信号传导</td><td>2751</td><td>1:500</td></tr><tr><td>LKB1（S428）</td><td>细胞信号传导</td><td>3051</td><td>1:100</td></tr><tr><td>mTOR（S2448）</td><td>细胞信号传导</td><td>5536</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NFκB p65 (S536)</td><td>细胞信号传导</td><td>3031</td><td>1:50</td></tr><tr><td>p70 S6激酶（T389）</td><td>细胞信号传导</td><td>9205</td><td>1:200</td></tr><tr><td>PDK1（S241）</td><td>细胞信号传导</td><td>3061</td><td>1:100</td></tr><tr><td>PKA C (T197)</td><td>细胞信号传导</td><td>4781</td><td>1:250</td></tr><tr><td>PRAS40（T246）</td><td>BioSource</td><td>44-1100</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>PTEN（S380）</td><td>细胞信号传导</td><td>9551</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Smad1（S463/465）、Smad5（S463/465）、Smad8（S426/428）</td><td>细胞信号传导</td><td>9511</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Src（Y527）</td><td>细胞信号传导</td><td>2105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Src家族（Y416）</td><td>细胞信号传导</td><td>2101</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Stat1（Y701）</td><td>细胞信号传导</td><td>9171</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Stat3（S727）</td><td>细胞信号传导</td><td>9134</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Zap-70 (Y319)</td><td>Enogene</td><td>E011159</td><td>1:100</td></tr><tr><td>&amp;beta;连环蛋白（S33/37/T41）</td><td>细胞信号传导</td><td>9561</td><td>1:250</td></tr><tr><td>CREB</td><td>Upstate Biotechnologies</td><td>06-863</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fos B</td><td>细胞信号传导</td><td>2251</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GRB2</td><td>细胞信号传导</td><td>3972</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>HSP70</td><td>Stressgen</td><td>SPA-810</td><td>1:100</td></tr><tr><td>c-Jun</td><td>细胞信号传导</td><td>9165</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Kip1/p27</td><td>BD</td><td>610241</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Lck</td><td>细胞信号传导</td><td>2984</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Mcl-1</td><td>细胞信号传导</td><td>4572</td><td>1:80</td></tr><tr><td>Musashi</td><td>细胞信号传导</td><td>2154</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NOTCH1</td><td>细胞信号传导</td><td>3439</td><td>1:100</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>细胞信号传导</td><td>9552</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SGK1</td><td>Abnova</td><td>PAB4590</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Zap-70</td><td>细胞信号传导</td><td>2705</td><td>1:250</td></tr><tr><td>&amp;beta;-连环蛋白</td><td>Abcam</td><td>AB32572</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Dll4</td><td>Abcam</td><td>AB7280</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Abcam</td><td>AB53281</td><td>1:250</td></tr><tr><td>HIF-1&amp;alpha;</td><td>BD</td><td>610958</td><td>1:50</td></tr><tr><td>NUMB 全亚型</td><td>Upstate Biotechnologies</td><td>07-207</td><td>1:400</td></tr><tr><td>NUMB-L</td><td>Chemicon</td><td>AB15145</td><td>1:750</td></tr><tr><td>细胞周期蛋白B</td><td>BD</td><td>610220</td><td>1:75</td></tr><tr><td>c-Myc</td><td>Calbiochem</td><td>OP-10</td><td>1:100</td></tr><tr><td>BCIP/NBT 试剂盒</td><td>Thermo-Fisher</td><td>002209</td><td>（步骤5.2.8后的说明）。用于检测碱性磷酸酶活性的试剂盒，类似试剂盒亦可使用。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;流式细胞术抗体：&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA1 抗体，Pacific Blue 标记</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MHCD1528</td><td>1:100（步骤 5.2.8 后注）</td></tr><tr><td>SSEA4 抗体（MC813-70），Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SSEA421</td><td>1:100</td></tr><tr><td>名称</td><td>公司</td><td>目录号</td><td>评论</td></tr><tr><td>特定仪器、工具和软件：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>Thermo-Fisher</td><td>C10227</td><td>可使用血细胞计数板或其他合适的玻璃血细胞计数器。</td></tr><tr><td>MEA1060-Inv-BC</td><td>多通道系统</td><td>MEA1060-Inv-BC</td><td>（步骤 5.3）</td></tr><tr><td>MEA1060-BC 控制软件</td><td>多通道系统</td><td>MEA1060-BC</td><td>（步骤 5.3）</td></tr><tr><td>NeuroExplorer</td><td>多通道系统</td><td>NeuroExplorer (NE)</td><td>（步骤 5.3）用于MEA数据的后处理</td></tr><tr><td>多电极阵列（MEA）</td><td>多通道系统</td><td>60MEA100/10iR-Ti-gr</td><td>（步骤 5.3）单孔微电极阵列芯片</td></tr><tr><td>ArrayScan XTI 高内涵分析平台</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ASN00002P</td><td>（步骤 5.2.8）可使用特定的 ArrayScan 算法（例如 Cytotoxicity V.4 和 NucTrans V.4 生物应用）对平均荧光强度进行定量。建议每孔至少采集 20 张图像，每种条件设置 7–8 个内部重复</td></tr><tr><td>7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4351405</td><td>（步骤 5.1.6）</td></tr><tr><td>BD ULTRA-FINE 胰岛素注射器（带30G针头）</td><td>BD</td><td>328280</td><td>（步骤 1.3.1、2.1.2 和 2.4.1）</td></tr><tr><td>StemPro EZPassage 一次性干细胞传代工具</td><td>ThermoFisher</td><td>23181010</td><td>该集落切割工具可作为30G针头1 mL注射器（步骤1.3.1）的替代使用</td></tr><tr><td>超低吸附培养皿（60 mm）</td><td>康宁</td><td>10010582</td><td>（步骤 2.1.8）也可使用其他品牌。</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷冻容器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

人诱导性多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案用于神经毒性检测

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

人类多能干细胞可分化为多种细胞类型，可用于基于人类细胞的体外毒性检测。其中一大优势在于，通过重编程体细胞获得人诱导多能干细胞（hiPSCs）可避免使用人胚胎干细胞（hESCs）所涉及的伦理和立法问题。hiPSCs能够扩增并高效分化为多种神经元和胶质细胞，可作为毒性测试的实验系统，尤其适用于评估参与神经毒性的不同信号通路。本研究描述了一种将hiPSCs分化为神经元与胶质细胞混合培养物的实验方案。文中明确了神经元分化过程中被调控和/或激活的信号通路。这些信息对于将该细胞模型应用于新的毒性测试范式至关重要，在该范式中，化学物质的评估依据是其干扰生物通路的能力。作为概念验证，使用线粒体呼吸链复合物I抑制剂鱼藤酮来评估Nrf2信号通路的激活情况，该通路是调控抗氧化反应元件（ARE）介导的细胞防御机制以抵抗氧化应激的关键因子。

人诱导多能干细胞（hiPSCs）被认为是药物和化学物质筛选以及新药开发的有力工具 体外 用于毒性测试（包括神经毒性）的模型。本文描述了一种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为神经元和胶质细胞的详细方案。

人类多能干细胞可分化为多种细胞类型，可用于基于人类细胞的体外毒性检测。一个主要优势是……

本实验的总体目标是将来源于人诱导性多能干细胞克隆的神经干细胞分化为神经元细胞与胶质细胞的混合培养物。该模型适用于药物和化学物质的毒性筛选。这种体外模型可用于评估化学物质对神经元和胶质细胞分化过程中所激活的信号通路的干扰作用。该系统的主要优势在于采用来源于诱导性多能干细胞的人源模型，为传统上使用的癌细胞和动物原代培养提供了一种替代方案，可用于研究神经元和胶质细胞混合群体中的神经毒性。本实验操作将由本实验室的博士后研究员Francesca Pistollato和研究生Carolina Nunes进行演示。首先对hiPSC细胞集落进行传代培养。在超净台中，于体视显微镜下以4倍放大倍数操作，使用1毫升注射器配30号针头，将干细胞集落切割成约200微米×200微米的方形小块。切割集落需要熟练的手动操作技能，以获得大小均一的片段。使用市售的切割工具可能会有所帮助。然后使用200微升移液器，轻轻吸取菌落碎片下方的培养基，以将碎片从培养皿表面剥离并抬起。将约100个菌落碎片转移至已包被合格基质DMEM F12的60毫米培养皿中，该培养皿内含有4毫升完全hiPSC培养基。然后将新培养皿置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。每天进行一次完全换液，并在4倍和10倍放大倍数下使用相差显微镜观察集落的形态。在分化程序的第0天，通过每60毫米培养皿添加3毫升培养基来更新hiPSC培养基。然后像之前一样切割并分离出200微米的片段。用移液器将分离的片段和培养基转移至15毫升离心管中。用2毫升完全hiPSC培养基冲洗培养皿，回收所有片段。然后以112 ×g离心1分钟。离心后，吸除上清液，并将沉淀物在5 mL完全培养基中轻轻重悬。将全部体积接种至60 mm超低吸附组织培养皿中。将培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜。第二天使用倒置显微镜观察细胞。第1天的拟胚体应呈现为圆形，且彼此分离，如图所示。然后用移液器将类胚体和培养基从培养皿中转移至15毫升离心管中。以112 ×g离心1分钟。在第2天，吸去预先准备好的60毫米培养皿中的标准基质包被液，并向培养皿中加入5毫升完全神经上皮诱导培养基（NRI）。在体视显微镜下以4倍放大倍数操作，使用200微升移液器收集约50个悬浮的类胚体，并转移至一个包被好的培养皿中。随后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。次日，即分化程序的第3天，在10倍放大倍数下于显微镜下检查培养皿，确保所有类胚体均已贴壁。随后用完全NRI培养基轻轻进行全量换液。每隔一天更换一次NRI培养基，直至第7天，此时应可见类玫瑰花环样的神经上皮细胞聚集体。在第7天，通过移液将100微升用培养基稀释的标准基质液加入每个孔中，对96孔板进行包被。第8天，在无菌条件下，于体视显微镜下以10倍放大倍数将类玫瑰花结样集落切割成小块。注意，当用针触碰时，这些集落容易从培养皿上脱落。若发生脱落，可用针尖将脱落的集落部分解离。如果莲座叶仍部分附着，可使用200微升移液器完成莲座叶片段的分离。莲座叶切段操作需要良好的手动技巧和精确性，以避免切到非神经外胚层衍生物。随后将莲座叶片段及其培养基收集至15毫升锥形管中。用两毫升 NRI 培养基冲洗培养皿，以回收所有组织碎片。随后在 112 ×g 条件下离心 1 至 2 分钟，使花环状碎片沉淀。吸除上清液后，将沉淀物轻轻重悬于 1 毫升预热的不含钙和镁的 1× DPBS 中。轻轻吹打花环状碎片以部分解离。然后加入4毫升完全NRI培养基，使用台盼蓝和自动细胞计数仪进行细胞计数。接着从96孔板中吸除标准基质包被液，并将细胞以约15,000个细胞/平方厘米的密度接种至各孔中，使用NRI培养基。将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。第10天，使用完全神经元分化培养基进行全量换液。该代表性图像显示了体外培养12天后经nestin（绿色）和beta three tubulin（红色）染色的神经玫瑰花环结构。此处为体外培养28天的细胞，分别用红色标记βIII微管蛋白，绿色标记NF200。该代表性图像显示了神经干细胞在体外培养21天后分化的神经元细胞，其中NF200以红色标记，tow以绿色标记。此处同一培养物中的胶质细胞以红色标记GFAP。该直方图比较了IMR90 hiPSC衍生物以及由IMR90 hiPSC来源的NSC分化而来的细胞中巢蛋白（nestin）、微管相关蛋白2（MAP two）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid）、囊泡型谷氨酸转运蛋白1（vesicular glutamate transporter one）和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）阳性细胞的定量结果。这些使用10倍物镜拍摄的相差图像显示了神经干细胞经过21天分化的过程。通过遵循这些操作步骤，还可进行其他检测，例如定量实时PCR和多层面重新分析，以评估神经元和胶质细胞的生理特性与表型，并分析化学物质的作用效果。请务必注意，操作化学化合物可能具有极高的危险性。因此，在进行化学处理时，尤其是在通风橱内操作时，必须始终采取相应的预防措施，佩戴护目镜、手套或口罩。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人诱导性多能干细胞出发，获得包含神经元和胶质细胞的混合分化细胞群体。该体系可作为一种合适的体外模型，用于神经毒性检测的相关研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

将人诱导的多能干细胞分化为神经元和神经胶质的混合培养物进行神经毒性测试的方案

本视频展示了一种在微流控装置内共培养谷氨酸能神经元与儿童高级别胶质瘤（pHGG）细胞的技术。将人诱导性多能干细胞引入微流控系统，并进行孵育以促进其分化为成熟的皮层谷氨酸能神经元。随后，将pHGG细胞接种至成熟神经元上，建立共培养体系，从而实现神经元与pHGG细胞之间的相互作用。...

共培养谷氨酸能神经元与儿童高级别胶质瘤细胞

本视频展示了如何从非转基因和转基因的人类多能干细胞（hPSCs）生成神经前体细胞。通过使用神经分化培养基，将hPSCs分化为神经前体细胞。在非转基因细胞中，使用小分子诱导分化；而在转基因hPSCs中，则通过添加抗生素来激活神经分化特异性转录因子的启动子，从而诱导其分化。...

非转基因与转基因人类多能干细胞向神经前体细胞的分化

本视频演示了将拟胚体（EBs）分化为神经外胚层聚集体，并进一步将其分离为神经元和胶质细胞的过程。该方法可高效生成神经元和胶质细胞。...

从人诱导性多能干细胞衍生的拟胚体生成神经元和胶质细胞

本方案描述了两种 体外 基于人类胚胎干细胞和转录组研究的发育毒性测试系统（UKK 和...

基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成

本文描述了一种定制方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为特定的高纯度神经元群体，这些神经元具有功能性的突触并表现出网络活动特征。电生理学分析表明，在暴露于A至G型肉毒神经毒素及破伤风神经毒素后，突触传递功能丧失。...

利用干细胞来源的中枢神经系统神经元网络培养物对生物性神经毒素进行功能评估

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

本方案详细描述了人干细胞来源神经元的重悬与培养步骤，这些神经元此前已在体外由神经前体细胞分化数周。该操作流程适用于基于成像的检测方法，可对神经突、突触以及晚期表达的神经元标志物进行分析，且兼容光学显微镜和高内涵筛选实验体系。...

人多能干细胞来源神经元的分化后重接种，用于神经突起形成和突触成熟的高内涵筛选

线粒体运输和形态异常与多种神经退行性疾病相关。本方案利用诱导性多能干细胞分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中的线粒体运输和形态。该方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于推动神经退行性疾病的机制研究。...

分析遗传性痉挛性截瘫患者来源的人诱导多能干细胞衍生神经元中的线粒体运输与形态

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。...

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

本研究报道了一种基于流式细胞术和两种荧光报告分子或抗体双重染色的新型方法，用于测量多种线粒体功能参数，以检测线粒体体积、线粒体膜电位、活性氧水平、线粒体呼吸链组成以及线粒体DNA的变化。...

人类诱导多能干细胞及其神经和胶质分化衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

了解将人诱导多能干细胞分化为神经元和神经胶质混合培养物的详细方案。该方法利用hiPSCs建立体外神经毒性测试模型，适用于药物筛选和化学品安全性评估，为研究神经发育机制提供可靠工具。

人诱导性多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案用于神经毒性检测

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