微型固相萃取和LC-MS / MS检测人尿中3-硝基酪氨酸的临床应用
July 14th, 2017
开发了选择性和灵敏的液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）方法与混合模式阳离子交换（MCX）96孔微量培养板上的有效固相萃取相结合，用于测量游离的3-硝基酪氨酸（ 3-NT），具有高通量，适用于临床应用。
这种小型化固相萃取与 LC-MS/MS 分析相结合的总体目标是准确定量人尿液中的游离 3-硝基酪氨酸，用于临床应用。游离 3-硝基酪氨酸有助于提高产量和氧化应激的生物标志物。然而，由于灵敏度、选择性不足且样品制备繁琐，在临床应用中准确定量 3-硝基酪氨酸仍将是一项特殊的挑战。
该技术在高灵敏度 LC-MS/MS 相互作用中结合了有效的固相萃取，无需体质和二维 LC，即可快速、特异性和准确地测定人尿液中低水平的内源性 3-硝基酪氨酸。这项技术的影响可以扩展到监测抗氧化治疗的有效性，因为抗氧化剂可以降低 3-硝基酪氨酸水平。为了开始此程序，涡旋先前制备并解冻的尿液样品、标准品和 QC 样品。
涡旋后，将 250 μL 每个样品和标准品加入干净的 2 ml 96 孔收集板的 32 个孔中。向除双空白样品孔外的每个孔中加入 50 μL 先前制备的内标工作溶液。然后向双空白样品孔中加入 50 μL LC-MS 级水和 0.01% 甲酸。
然后，向孔中加入 250 微升含 0.1% 甲酸的 LC-MS 级水。然后用 8 通道移液器将溶液混合 3 次，并盖上板直至加载 SPE。接下来，将混合模式阳离子交换 96 孔萃取微孔板和收集储液槽放在正压处理器上。
利用混合模式阳离子交换微孔板进行固相萃取，可在单次萃取中同时净化样品并富集 3-硝基酪氨酸。将 200 μL LC-MS 级甲醇流过吸附剂，以调节萃取板。转动正压处理器上的压力调节旋钮，设置较低的正压，以便让混合物缓慢流过吸附剂，并根据需要调整压力。
将 200 μL 含 2% 甲酸的 LC-MS 级水流过吸附剂进行平衡。使用八通道移液器，小心地将每个预混合样品的整个体积加载到预活化的萃取板上。在正压处理器上设置较低的正压，让混合物缓慢流过吸附剂，同时根据需要调整压力。
然后，将 200 微升含 2% 甲酸的 LC-MS 级水流过吸附剂，清洗孔。用 200 μL 甲醇和水清洗后，将正压处理器设置为高压，以便干燥孔。孔干燥后，用干净的 2 毫升 96 孔收集板更换储液槽。
现在，加入 50 μL 25 毫摩尔乙酸铵溶液，从萃取板中缓慢洗脱保留的分析物和内标。然后加入 50 μL 含 5% 甲酸的 LC-MS 级水以中和洗脱液。使用温和的乙酸铵溶液洗脱 3-硝基酪氨酸，可显著提高选择性和灵敏度。
用八通道移液器将样品混合 3 次，以准备液相色谱串联质谱分析。设置 LC-MS/MS 仪器后，使用 LC 梯度洗脱，平衡 3-硝基酪氨酸 LC-MS/MS 方法10 min。通过平衡该方法，LC 梯度将平衡至初始梯度洗脱。
自动进样器温度将设置为 4 摄氏度，烘箱温度将设置为 30 摄氏度。创建包含尿液样品、标准品和 QC 样品的批次列表。然后通过注入准备好的样品开始批次。
完成所有进样后，通过对 3-硝基酪氨酸和内标的峰面积比与标称 3-硝基酪氨酸浓度进行线性回归，建立一条范围为 10 至 2， 500 pg/mL 的标准曲线，用于 3-硝基酪氨酸定量。最后，使用既定的标准曲线定量所有其他样品，并确定 QC 样品是否在既定范围内。人尿液样品的液相色谱数据显示，在优化条件下，3-硝基酪氨酸与其他结构相似的酪氨酸类似物经色谱分离，消除了这些过量化合物引起的共洗脱干扰，从而提高了分析选择性。
在双空白样品的多反应监测色谱图中未观察到 3-硝基酪氨酸信号，表明整个过程未形成 3-硝基酪氨酸。此处显示了健康个体的 3-硝基酪氨酸和内标的代表性多反应监测色谱图。在 3-硝基酪氨酸和内标的保留时间处未观察到干扰信号。
此处显示了一条具有代表性的标准曲线。定义为信噪比大于 3 的最低浓度的检测限被确定为 2 pg/mL。定量下限确定为 10 pg/mL，定义为不精密度和准确度在 20% 以内且信噪比大于 10 的最低浓度。
微调的整合分析可显著提高特异性、灵敏度和通量，同时减少基质效应、吸附剂用量和废物处理。通过这种简单快速的检测方法，可以在 24 小时内处理尿液样本。考虑到无创且廉价的尿液采样。
这种显着改进的方法非常适合评估 3-硝基酪氨酸在临床前和临床研究中作为氧化应激生物标志物的作用。
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概览
本研究提出了一种高度敏感的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）用于定量测定人尿液中的游离3-硝基酪氨酸。该方法结合了固相萃取，使其适用于临床应用和氧化应激的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 临床生物化学
- 氧化应激研究
背景
- 游离3-硝基酪氨酸是氧化应激的生物标志物。
- 由于敏感性和选择性问题，在生物样品中准确定量具有挑战性。
- 现有方法通常涉及繁琐的样品制备。
- 氧化应激与多种病理状况有关，包括神经退行性疾病。
研究目的
- 开发一种用于准确定量人尿液中游离3-硝基酪氨酸的方法。
- 促进氧化应激的临床应用和研究。
- 能够监测抗氧化治疗的有效性。
使用的方法
- 微型固相萃取。
- 液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）。
- 尿液样品的高通量分析。
- 标准品和质量控制样品的制备。
主要结果
- 该方法允许快速和特异性地确定低水平的3-硝基酪氨酸。
- 相比传统方法，它提高了灵敏度和选择性。
- 结果可以提供关于氧化应激和相关条件的见解。
- 在监测抗氧化治疗方面的潜在应用。
结论
- 开发的LC-MS/MS方法对临床应用有效。
- 它解决了在生物样品中定量3-硝基酪氨酸的挑战。
- 该技术可以增强对氧化应激及其影响的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of low-abundance biomarkers like 3-nitrotyrosine in human urine is critical for oxidative stress research and clinical biomarker validation. This miniaturized SPE-LC/MS/MS method delivers enhanced sensitivity and selectivity, enabling reliable detection of endogenous 3-NT levels without derivatization or lengthy sample preparation. The high-throughput format supports preclinical and clinical studies requiring rapid, non-invasive biomarker assessment for go/no-go decisions in antioxidant therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oxidative stress pathways by providing quantitative 3-NT measurements as a functional biomarker.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through specific detection of free 3-NT in complex biological matrices.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating 3-NT levels with disease states and antioxidant intervention outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized, reproducible assay with low matrix effect for consistent compound screening.
- Operational Value: Miniaturized SPE on 96-well plates allows processing of 192 samples in 24 hours, improving workflow efficiency.
- Scalability: Reduced solvent consumption and waste disposal lower operational costs for large-scale biomarker studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase oxidative stress mechanisms to preclinical validation via quantifiable urinary biomarker.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables monitoring of antioxidant treatment effectiveness through measurable reductions in 3-NT levels.
- Disease Relevance: Applicable to inflammatory and neurodegenerative disorders where oxidative stress plays a pathogenic role.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing a robust oxidative stress readout.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by quantifying 3-NT as a downstream effector of reactive nitrogen species.
- Screening: Enables assay readiness with high sensitivity (LLOQ 10 pg/mL) and selectivity for reliable compound evaluation in urine.
- Analytics: Provides quantitative MRM-based readouts with signal-to-noise >10 for accurate concentration determination across a 10–2500 pg/mL range.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment with oxidative stress pathology and antioxidant response.
- Enterprise Reuse: The miniaturized SPE-LC/MS/MS platform is reusable across multiple studies, reducing revalidation burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in oxidative stress biomarker measurement, reduction of false positives from interferences.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and high throughput (192 samples/24h) enable consistent cross-study comparisons.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in antioxidant development via quantifiable biomarker modulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on biomarker engagement and mechanism validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in LC-MS/MS method development and solid phase extraction optimization.
- Needs access to positive pressure processors, 96-well SPE plates, and PFP chromatographic columns.
- Demands standardization of sample handling, internal standard use, and MRM transition settings across sites.
- Adaptation to other biological matrices may require reoptimization of elution and cleanup conditions.
- Practical limitation: Method is specific to free 3-NT; total 3-NT measurement would require hydrolysis steps not included here.
