Name: 人类骨髓微环境在小鼠中的生物工程及其通过实时成像的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学习在小鼠体内生物工程化人类骨髓微环境的方法，利用明胶支架植入人间充质细胞和造血细胞，并通过双光子显微镜进行实时成像观察细胞动态。该技术为研究人类造血和细胞相互作用提供了重要工具。

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我们感谢弗朗西斯·克里克研究所核心设施（生物研究设施、体内成像和实验组织病理学）的工作人员，以及克里克研究所和伦敦研究学院（LRI）的兽医Yolanda Saavedra-Torres和Mercedes Sanchez-Garzon提供的宝贵帮助。&#160;我们感谢W. Grey博士对稿件的审阅。D.P. 获得了欧洲血液学协会（EHA）非临床研究奖学金的支持。本研究由弗朗西斯·克里克研究所资助，该研究所的核心资金来自英国癌症研究中心（FC001045）、英国医学研究理事会（FC001045）和惠康信托基金（FC001045）。

所有动物实验均在英国政府内政部批准的项目许可编号70/8904下进行，并遵循英国癌症研究组织的指导方针。人脐带血（UCB）及原代人急性髓系白血病（AML）样本的使用已获得东伦敦伦理委员会批准，在取得知情同意后进行，并遵循《赫尔辛基宣言》的规定。
1. 利用人类造血细胞和基质细胞生物工程化胶原基支架
注意：整个实验步骤应在无菌条件下使用无菌材料进行。细胞培养基1对应hMSC培养基（MEM-α、青霉素-链霉素、10% hMSC-FBS）；细胞培养基2对应EC培养基（M199、20% FBS、青霉素-链霉素、10 mM HEPES、50 µg/mL 肝素、2 mM 谷氨酰胺和50 μg/mL ECGS）；细胞培养基3对应造血细胞培养基（H5100和青霉素-链霉素）。
<ol>
	<li>采用Ficoll-Paque密度梯度法，根据已确立的实验方案53，制备脐带血单个核细胞（CB-MNCs）或原代急性髓系白血病细胞（AML，骨髓或外周血单个核细胞）。
	<ol>
		<li>对于AML样本，使用OKT.3抗体去除T细胞。每1 × 106个AML MNCs加入4 µg OKT.3，在室温下孵育30分钟，随后用PBS洗涤细胞。如需保存，将MNCs以每毫升2 × 108个细胞的密度悬浮于含10% DMSO的FBS中进行冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别制备hMSC（培养基1）和EC（培养基2）细胞培养物。将hMSC细胞（参见材料表）接种于普通细胞培养瓶中的hMSC培养基中。将EC细胞（参见材料表）接种于I型胶原包被的表面，并使用EC培养基进行培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到85–90%时，吸除培养基，用PBS洗涤两次，然后加入胰蛋白酶-EDTA溶液（每cm2加20 µL）。
	<ol>
		<li>5分钟后检查细胞是否已脱落。用细胞培养基按1:3比例稀释以终止消化反应。在300 × g离心5分钟，弃上清，用相应类型的细胞培养基重悬细胞，并使用血球计数板进行细胞计数。</li>
		<li>使用浓度为每毫升2 × 106 – 107个细胞的悬液。若需同时使用两种细胞类型，则将hMSC和EC悬液按1:1比例混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬液转移至胰岛素注射器中。</li>
	<li>使用手术刀将已灭菌的明胶海绵（例如，gelfoam）初始支架（20 mm × 60 mm × 7 mm）切割成24块大小相近的片段（6.6 mm × 7.5 mm × 7 mm；图1A和B）。</li>
	<li>通过将明胶支架浸入PBS中5分钟进行再水化。</li>
	<li>逐一将支架轻轻放置于无菌纱布上以去除多余PBS。将支架转移至24孔板的一个孔中（超低吸附表面），并用注射器向每个支架注入50 µL含105 – 106个细胞的悬液（单独hMSC或与hEC联合使用；图1C）。</li>
	<li>重复步骤1.7，直至所有所需支架均接种了基质细胞。</li>
	<li>将支架置于细胞培养箱中孵育1小时（37 °C，5% CO2）。</li>
	<li>向每孔加入3 mL细胞培养基1（图1D），并将支架放回细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中过夜培养。若支架中含有EC细胞，则使用细胞培养基2。</li>
	<li>解冻CB-MNCs，并按照合适的CD34+分选试剂盒说明书从中分离CD34+细胞。将分选出的CD34+细胞悬浮于培养基3中，并使用血球计数板进行计数。 
	注意：此处使用的细胞浓度为每毫升2 × 106个细胞。
	<ol>
		<li>若使用AML患者来源的原代样本，则解冻细胞后，用FBS按1:10稀释，300 × g离心5分钟，用含2% FBS的PBS重悬细胞，加入抗人CD3抗体（每106个细胞加2 – 4 µg），室温孵育30分钟。300 × g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于添加细胞因子的造血细胞培养基中（含20 ng/mL粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、20 ng/mL IL-3和20 ng/mL血小板生成素（TPO））。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤1.7 – 1.9，但此次接种1 × 105个人造血细胞而非基质成分，其余操作同上。
	<ol>
		<li>向孔中加入3 mL细胞培养基3（图1D），并将支架放回细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中过夜培养。若支架中含有EC细胞，则使用细胞培养基2和3按1:1比例混合的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于仅作为重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）载体的支架，逐一将支架轻轻放置于无菌纱布上以去除多余PBS。将支架转移至U型底96孔板的一个孔中（图1E），并加入5 µL rhBMP-2，确保完全覆盖支架表面。
	<ol>
		<li>随后加入20 µL凝血酶，再加入20 µL纤维蛋白原，每次均需充分覆盖支架表面（图1F）。对每个支架重复此操作，直至所有所需支架均处理完毕，然后在37 °C孵育5 – 10分钟。检查是否已成功形成凝块。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 生物工程支架的外科植入
注意：此处使用6至12周龄的雄性或雌性NSG小鼠。由于动物为免疫缺陷型，所有操作均应在无菌条件下进行。步骤2.10至2.13涉及存活策略及术后护理。
<ol>
	<li>手术前60至120分钟，皮下注射镇痛药物（卡洛芬，5 mg/kg体重/小鼠）。</li>
	<li>在麻醉舱内使用0.5%异氟烷和2 L/min氧气诱导麻醉2. &#160;小鼠在手术过程中应持续监测。将动物以俯卧位转移至手术区域，以便于接触背部。通过鼻罩持续供给1.5%异氟烷和2 L/min氧气，维持动物处于麻醉状态。2手术过程中保持小鼠处于麻醉状态，并频繁检查动物状况。</li>
	<li>在麻醉状态下，使用眼用凝胶涂抹小鼠眼睛以防止干燥，并将小鼠体温维持在 37 °C。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除小鼠背部手术区域的毛发。为对皮肤进行消毒，将棉签浸入稀释的氯己定溶液（按1:10比例用PBS稀释）中，用该棉签擦拭皮肤表面，重复此操作两次。</li>
	<li>使用无菌镊子和手术刀（或剪刀），在皮肤上做一道0.5至0.7厘米长、从前向后的全层切口。将镊子插入皮下组织下方，分离形成一个皮下囊袋。</li>
	<li>将支架皮下植入，确保其置于深部组织腔隙内（图1G 和 H）。使用手术胶水闭合切口（图1I 和 J).</li>
	<li>用于治疗术后疼痛，皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）&#160;体重）。</li>
	<li>恢复期间，将动物侧卧于预热的笼子中，并监测其恢复情况，直至观察到正常行为。</li>
	<li>将止痛药（卡洛芬，0.1 mg/mL 水）用蒸馏水稀释后作为饮用水提供给动物，术后连续给予 4 天。</li>
	<li>在术后48小时内，应定期检查动物及其伤口，以观察可能出现的不良反应。</li>
</ol>
3. 小鼠处理、安乐死及成像样本采集
注意：支架的分析在植入后 8 至 24 周之间进行。
<ol>
	<li>成像前60分钟，将植入小鼠置于37 °C的加热箱中保温，并静脉注射100 µL人免疫球蛋白以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>成像前30分钟，静脉注射10 µg（每只小鼠）特异性抗体，用于标记目标细胞。</li>
	<li>成像前5分钟，静脉注射15 µL（用100 µL PBS稀释）655 nm荧光标记的血管示踪剂（655-VPA），以显示血管结构。</li>
	<li>通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>使用锋利的剪刀，在小鼠背部靠近原始植入部位处做一纵向皮肤切口。</li>
	<li>借助镊子和剪刀，小心地将皮肤与皮下植入支架的囊腔分离。</li>
	<li>用镊子夹住支架，使用剪刀剪断周围残留的膜和组织，轻柔地将支架从皮肤中取出。支架回收示例见图2。</li>
	<li>用速干胶将支架固定在成像板（35 mm × 10 mm培养皿）上，并加入室温的生理盐水（PBS）浸没。</li>
	<li>对于BMP支架，在加入PBS前，需在显微外科显微镜下使用外科微型钻头对骨表面进行减薄处理，以便荧光团的可视化和高分辨率图像采集。根据支架大小选择1.2 mm或1.6 mm钻头。 
	注意：钻削深度需根据骨组织厚度自行判断。通常情况下，由于BMP支架已实现血管化，当接近适宜成像的厚度时，骨组织颜色会略有变化，呈现较红的色泽。</li>
	<li>将成像板放置于共聚焦显微镜的载物台上。</li>
</ol>
4. 使用双光子显微镜进行活体成像
注意：使用非扫描探测器（NDD）时，始终应使用 NDD 滑块进行成像，以将荧光引导至 NDD。显微镜配置详见图3。
<ol>
	<li>打开显微镜和计算机，通过点击启动软件 &#34;启动系统，&#34; 并前往 &#34;采集&#34; 模式。</li>
	<li>勾选 &#34;显示手动工具&#34; 盒中。在 &#34;激光&#34; 菜单切换 &#34;在&#34; 双光子激光器并使其预热和稳定。</li>
	<li>在 &#34;成像装置设置&#34; 菜单，同时激活 &#34;通道模式&#34; 和 &#34;逐帧切换轨道。&#34; 在 &#34;光路&#34; 菜单，选择 &#34;非扫描式"和 &#34;主光束分光器 MBS 760+&#34; 勾选以激活四个 NDD 并按图示设置配置 图3. 
	注意：在此配置下，骨结构的胶原信号（二次谐波生成，SHG）在380 - 485 nm范围内采集，FITC-hCD31+人内皮细胞和AF488-hCD45+人造血细胞在500 - 550 nm范围内采集，655-VPA在640 - 690 nm范围内采集。</li>
	<li>在 &#34;通道&#34; 菜单，设置 &#34;激光波长&#34; 至890 nm，功率设为50%。设置 &#34;增益（主控）&#34; 500-600 &#34;数码胶印&#34; 至 0，以及 &#34;数字增益&#34; 每个通道调整为15。在采集开始后调节这些数值。</li>
	<li>在 &#34;采集模式，&#34; 设置必要的参数，以在不损伤组织和不淬灭荧光染料的情况下获得高分辨率图像。设置 &#34;扫描模式&#34; 至 &#34;帧，&#34; &#34;帧大小&#34; 到 &#34;x512 y512,&#34; 线性步骤&#34; 1， &#34;速度&#34; 至 9， &#34;平均次数&#34; 至 8， &#34;位深度&#34; 到 &#34;8 位&#34; &#34;模式&#34; 到 &#34;线&#34; &#34;方向&#34; 到 &#34;双向的&#34; 和 &#34;方法&#34; 到 &#34;平均值&#34;
	<ol>
		<li>设定 &#34;缩放&#34; 图像初始扫描时设为1，如有需要可增加以聚焦特定区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有支架的培养皿置于显微镜载物台上，使用20倍、1.0 NA的水浸物镜，降低物镜直至接触生理盐水溶液。以灯源为照明，通过显微镜目镜调节物镜焦点至支架处。</li>
	<li>激活 &#34;Z轴扫描&#34; 菜单，选择 &#34;首/末&#34; 功能，并设置两个连续切片之间的必要间隔（例如， 2-µm Z轴扫描）。在Z轴扫描过程中保持间隔恒定。</li>
	<li>选择 &#34;活体&#34; 对样品进行活体扫描成像并调节 &#34;数字增益&#34; 和 &#34;数码胶印&#34; 以获得最佳曝光效果。要同时显示多个通道，请选择 &#34;分离&#34; 功能</li>
	<li>在 &#34;阶段&#34; 菜单，而在 &#34;活体&#34; 模式，扫描图像并 &#34;马克&#34; 感兴趣区域（ROI），例如人造血细胞和血管结构的位置。当样本扫描完成后，移至第一个 ROI 开始成像。</li>
	<li>在 &#34;活体&#34; 模式，使用3D Z-stack 设置围绕目标区域的顶部和底部 &#34;设置第一步&#34; 和 &#34;设置最后一个&#34; 功能。完成后，设置中心， &#34;C.&#34; 开始对 ROI 进行采集 &#34;开始实验&#34; 按钮。参见图像示例 图4, 图5，以及 图6.</li>
	<li>成像完成后，将图像保存至指定文件夹。移动到下一个感兴趣区域（ROI），重复步骤4.10。实验结束后，从显微镜上取下成像板，小心将样本从板上剥离，并清除残留的胶水。</li>
	<li>为下一项分析技术准备样品。</li>
</ol>
5. 组织学和免疫染色样品处理
注意：样品处理应按照 JoVE 通用实验技术54中描述的样品固定、包埋和切片流程进行。成骨样品在固定和包埋步骤之间，需用基于 EDTA 的脱钙剂处理 7 天。封闭/通透溶液为含 1% Triton X-100、1% 牛血清白蛋白（BSA）和 10% 正常山羊血清（NGS）的 10 mM PBS 缓冲液（pH 7.4）。
<ol>
	<li>将切片放入二甲苯中 10 分钟，再放入二甲苯中 5 分钟，100% 乙醇中 5 分钟，70% 乙醇中 5 分钟，50% 乙醇中 5 分钟，最后放入 H2O 中 5 分钟。</li>
	<li>将切片转移至柠檬酸盐抗原修复工作液中。</li>
	<li>煮沸切片 15 分钟，然后使其冷却至室温。</li>
	<li>用含 1% Triton X-100 的 10 mM PBS（pH 7.4）溶液洗涤切片（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
	<li>将样本转移至封闭/通透溶液中，孵育 30 分钟。</li>
	<li>加入用封闭/通透溶液稀释的一抗，于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>用含 1% Triton X-100 的 10 mM PBS（pH 7.4）溶液洗涤切片（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
	<li>在避光、室温条件下，加入用封闭/通透溶液稀释的二抗，孵育 1 小时。</li>
	<li>用 H2O 洗涤（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
	<li>为降低背景荧光，将切片在避光、室温条件下浸入苏丹黑工作液中 10 分钟。</li>
	<li>用 H2O 洗涤切片（每次 5 分钟，共 3 次）。</li>
	<li>使用含 DAPI（0.5 µg/mL）的荧光封片剂封片。</li>
	<li>将切片于 4 °C 保存，并在进行荧光成像前确认封片剂已干燥。示例图像见 图 7。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

相对于现有方法的意义：
在此方案中，我们描述了一种在小鼠体内构建不同人源化微环境的方法，并通过双光子显微镜和组织学技术可视化其结构。所提供的代表性数据展示了该方法的可行性，即利用不同类型基质细胞构建人源化组织。本方案可特异性应用于研究正常与病理条件下的人类造血细胞及骨髓微环境来源的细胞，具体应用包括克隆演化研究、药物筛选以及人源造血干细胞与基质成分之间的相互作用研究。在组织工程这一新兴领域中，已有多种替代性方法被提出，其中值得注意的方法包括三维人源化骨髓结构的构建。 体外55,56,57,58,59,60,61,62,63 小鼠体内人源化骨髓支架的原位移植64. 我们的方法具有同时结合复杂性的优势 体内 具有人源化组织移植物易于解剖接触的系统。
修改与故障排除：
该方案中一个变异来源在于用于接种支架的细胞选择。在本研究中，我们使用了骨髓来源的人间充质干细胞（hMSCs）。然而，间充质细胞可来源于多种组织，其特性可能因来源不同而有所差异。因此，可考虑使用来自不同器官的hMSCs。但这些细胞形成骨组织的能力 体内 在用于本方案之前应进行测试。本方案使用一种市售的人内皮细胞来源（即， E4ORF1 转导的 HUVEC。近期已有报道使用器官特异性内皮细胞用于不同目的65,66此外，采用源自骨髓的原代人内皮细胞（hECs）可能是对本方案的一项有趣改进。因此，使用不同来源的内皮细胞可能会产生不同的结果 体内 结果。
我们采用NSG免疫缺陷型受体小鼠，以促进人源化支架的植入并避免组织排斥反应。我们不排除将本方案用于在其他小鼠品系中构建异位骨髓组织的可能性。事实上，重组人BMP-2（rhBMP-2）可在多种哺乳动物模型中诱导骨形成47,48,49,50,52。然而，在使用不同品系或模型时，细胞存活率和长期移植效果可能存在差异。
支架回收的时间也可根据实验的最终目的灵活调整。在本方案中，我们在植入后8至12周回收样本，以评估长期造血嵌合情况。若要研究人类骨髓微环境形成的早期阶段（例如，成骨/软骨组织形成47或血管发育），可选择不同的时间点。
本方案中描述的活体成像技术适用于外植体的短期成像。对于长期成像（例如研究细胞运动行为）的情况，应考虑使用可维持生理温度、氧气张力和CO2浓度的平衡培养舱。
方案中的关键步骤：
在与该方案相关的挑战中，我们需强调某些步骤所需的技术技能。间充质细胞和内皮细胞应使用较低代次的细胞；否则，它们将无法支持人造血细胞的植入。 体内 或参与 从头合成 血管系统与骨形成 体内建议使用第1至第5代的hMSCs和hECs。支架制备与细胞接种步骤需要具备基本的细胞培养技能，并了解实验中所用特定细胞的特性。手术操作流程较为简单，但需要一定的练习。维持无菌环境以防止免疫缺陷小鼠体内植入支架发生污染，对于确保实验成功至关重要。样本取出及活体成像需要一定的外科操作经验（尤其是微型钻头的使用）以及对显微镜系统的了解。最后，样本处理与组织学分析需要掌握相关技术的基本知识。
该技术的局限性：
我们所描述的方法能够实现对活体人类造血细胞在人源化骨髓微环境中定植过程的可视化，其中人类内皮细胞形成血管结构，间充质细胞形成骨/骨髓腔隙。随着组织的形成 体内最终构建的支架仍将是嵌合型的（人源与鼠源）。这一点需加以考虑，因为嵌合组织可能无法完全模拟人类骨髓的复杂性及其微环境。
所植入的支架尺寸有限（我们尝试的最大尺寸为 6.6 x 7.5 x 7 mm），因此其可容纳的异种移植细胞数量也有限。回收细胞的绝对数量也将受限；因此，应根据实验所需细胞数量来计算植入支架的数量。
我们所描述的成像应用特别适用于在不破坏组织结构和损伤细胞的情况下，观察距表面深度为150-200 µm的活体组织大范围区域。因此，该方法无法实现对整个支架的可视化。如果需要对组织进行完整扫描，采用标准的免疫荧光方法将更为合适。
未来应用：
该生物工程模型的未来发展方向是增加组织中人类组分的复杂性。近年来，人类骨髓微环境的研究和特征鉴定已取得进展67，而本研究所描述的方案可作为一个有趣的平台，用于研究这些新细胞组分和可溶性因子的功能，以及它们在支持正常或恶性造血干细胞（HSCs）中的作用。
此外，该成像技术为支架在纵向研究中的活体成像提供了可能，这需要在术后恢复条件下，对活体麻醉小鼠体内的支架成像进行技术改进。该方法需要额外的步骤，目前实验室正在对此进行研究。

干细胞区室中观察到的细胞命运决定受到内在和外在因素的严格调控。特别是，目前普遍认为骨髓（BM）微环境在调控造血干细胞（HSCs）从静息状态向活跃状态的转换，以及其自我更新或分化命运决定中发挥着根本性作用1。此外，最近的研究发现，血液系统恶性肿瘤会影响骨髓微环境的功能，表明这两个区室之间存在活跃的相互作用2,3,4,5,6。尽管近年来取得了进展，但关于特定骨髓微环境组分的活性如何影响HSC行为及恶性转化，仍有许多关键问题有待解答。
骨髓微环境是由多种不同细胞类型组成的高度异质性和复杂的混合体，每种细胞都具有特定的功能。其中丰富的内皮细胞（EC）和血管成分可调节营养物质和代谢物的转换，调控各类细胞进入和离开骨髓的过程，并参与多种造血干细胞（HSC）功能的调节。7,8间充质基质细胞（MSCs）是一类异质性的未分化干细胞及其前体细胞群体，可向三个不同谱系分化即， 成骨、软骨生成和脂肪生成性的间充质干细胞（MSCs）是骨髓（BM）微环境的另一个基本组成成分。这些MSCs不仅定位于骨髓中央区域，也存在于骨内膜区域附近。它们可能与血管结构相关，并参与调控造血干细胞（HSC）的功能。9,10,11,12,13,14,15.
许多研究表明，造血干细胞（HSCs）存在于骨髓内多个特定的解剖位点，其功能可能依赖于其精确定位。目前关于HSCs及其与骨髓微环境相互作用的知识，主要来源于小鼠研究1。异种移植模型的应用已将这些发现拓展至人类正常及恶性HSCs，这些细胞能够在免疫缺陷小鼠的骨髓中定植并重建造血功能16,17,18,19,20。尽管该模型具有有效性，但仍面临诸多挑战，例如在多数情况下需对受体小鼠进行预处理，以促进人源HSC的归巢与植入，以及种间屏障对细胞间相互作用和功能带来的尚不明确的影响。
中和抗体、基因修饰小鼠以及异种移植技术的应用，对于揭示人造血干细胞（HSCs）与其微环境之间复杂的相互作用起到了关键作用。活体双光子共聚焦显微镜的引入与发展进一步推动了这些研究，使得骨髓的直接、高分辨率和动态成像成为可能19,20,21,22，为骨髓微环境的功能表征及其在调控HSC功能中作用的研究提供了强有力的工具。为了克服经典异种移植模型中存在的一些问题，“构建人源化骨髓结构”的概念应运而生。通过整合生物材料与细胞植入策略，已有研究证实可在异位区域成功模拟人类骨髓微环境23,24,25,26,27。这为利用生物工程手段在小鼠模型中研究人类正常与恶性造血过程28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39、肿瘤发生及转移机制40,41,42,43,44开辟了新的可能性。
基于以往在骨组织工程领域的经验 体内 成像19,22,45,46,47,48,49,50,51,52我们描述了一种用于生物工程构建并实时成像类器官型人骨髓组织的实验方案。这些结构来源于将人骨髓来源的基质细胞植入基于胶原的支架中，并皮下移植至免疫缺陷小鼠体内。在先前的报道中，我们证明了人源间充质干细胞能够形成适合人造血细胞植入的人源微环境45此外，本文还描述了共移植其他人类骨髓细胞成分（如人类内皮细胞（hEC））和/或对骨形成重要的细胞因子的方法例如， hBMP2）与hMSCs协同作用，生成不同的人源化微环境，可进行活体成像 原位.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Ge Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>CD34 阳性筛选试剂盒</td><td>Stemcell</td><td>18056</td><td>储存于 4&amp;deg;C。</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD3 抗体，克隆 OKT-3</td><td>Bioxcell</td><td>BE0001-2</td><td>储存于 4&amp;deg;C。用于原代急性髓系白血病（AML）样本中的 T 细胞去除。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞因子（IL3、G-CSF 和 TPO）</td><td>PeproTech</td><td>200-03, 300-23 和 300-18</td><td>配制储备液：将每种细胞因子分别用 100 &amp;mu;L 水稀释后混合。加入 200 &amp;mu;L，分装成每管 45 &amp;mu;L 的小份，储存于 -20 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life technologies</td><td>10270106</td><td>56 &amp;deg;C 水浴中热灭活 30 分钟，分装后冻存。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>MEM-&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>32571-028</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>Myelocult H5100</td><td>corning</td><td>5100</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>199</td><td>Gibco</td><td>41150-020</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>hMSC-FBS，热灭活</td><td>Gibco</td><td>12662-029</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>用培养基稀释后，使用 0.22 mm 滤器过滤。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1558-50ML</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>胶原蛋白 I 包被的细胞培养板</td><td>corning</td><td>354505</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25200056</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>hMSC</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>另可选用由 Dosquet 博士（巴黎狄德罗大学，巴黎）在获得伦理批准编号 10-038（IRB00006477）后，从骨科手术中获取的人类骨髓来源的 hMSC。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VeraVec HUVEC 内皮细胞</td><td>Angiocrine bioscience</td><td>hVera101</td><td>也可使用其他人类内皮细胞来源。</td></tr><tr><td>人造血细胞</td><td></td><td></td><td>脐带血或原发性急性髓系白血病（AML）样本来自英国伦敦皇家伦敦医院，在获得知情同意并经东伦敦伦理委员会批准后，按照《赫尔辛基宣言》的规定进行采集。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gelfoam，尺寸 12 - 7 mm</td><td>Pfizer</td><td>00009-0315-08</td><td>替代供应商：Febelco</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>外科材料</td><td>多个</td><td></td><td>无菌镊子、镊子和锋利剪刀。</td></tr><tr><td>无菌纸巾</td><td></td><td></td><td>经热灭菌处理的纸巾。</td></tr><tr><td>1 mL 注射器配 25G 针头</td><td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附多孔板</td><td>Corning</td><td>3473 或 3471</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Noricum</td><td>rhBMP-2</td><td>用 50 mM 乙酸稀释至 5 mg/mL，并储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T8885</td><td>用 2% CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 稀释，每瓶 500 mL，储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td>用 PBS 稀释至 4 mg/100 mL。储存于 -20 &amp;deg;C。使用前预热。</td></tr><tr><td>组织培养皿 35 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>U 型底 96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>NSG 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NSG 小鼠由 Leonard Shultz 博士（The Jackson Laboratory）惠赠。</td></tr><tr><td>氯己定</td><td>G9</td><td></td><td>使用前稀释 1:10</td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl</td><td>每公斤小鼠体重 5 mg</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Alstoe</td><td>Vetergesic</td><td>每公斤小鼠体重 0.1 mg</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>麻醉诱导 2%，维持 1%</td></tr><tr><td>毛发修剪器</td><td>Wella</td><td>Contura HS61</td><td></td></tr><tr><td>外科胶水</td><td>3M</td><td>Vetbond</td><td></td></tr><tr><td>卡波姆（聚丙烯酸）作为眼用凝胶</td><td>Novartis</td><td>Viscotears Liquid Gel</td><td></td></tr><tr><td>人正常免疫球蛋白</td><td>Gammaplex</td><td>10g 瓶</td><td>每只小鼠静脉注射 100 mL，特异性抗体输注前 30 分钟给予。</td></tr><tr><td>NT-QTracker</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>血管示踪剂。成像前 5 分钟每只小鼠静脉注射 15 mL。</td></tr><tr><td>AF488-hCD45</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>每只小鼠静脉注射 100 mL，成像前 30 分钟给予。</td></tr><tr><td>FITC-hCD31</td><td>BD Pharmigen</td><td>555445</td><td>每只小鼠静脉注射 100 mL，成像前 30 分钟给予。</td></tr><tr><td>强力胶</td><td>Loctite</td><td>Super Glue</td><td></td></tr><tr><td>微型钻孔工具包</td><td>IDEAL - Fisher Scientific</td><td>NC9010016</td><td></td></tr><tr><td>显微外科手术显微镜</td><td></td><td></td><td>不推荐特定品牌或公司。</td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Zeiss</td><td></td><td>配备电动载物台、双光子激光和 20X 1.0 NA 水浸物镜的直立共聚焦显微镜。也可使用具有类似规格的显微镜。</td></tr><tr><td>MaiTai &amp;ldquo;高性能&amp;rdquo; 全自动一体化 517 模式锁定 Ti:Sapphire 激光器，配备 DeepSee 色散补偿</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32294</td><td></td></tr><tr><td>Osteosoft</td><td>Millipore</td><td>1.01728.1000</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸载玻片</td><td>Thermo scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>抗原修复液</td><td>Vector</td><td>H-3300</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。使用时用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释 1:100 配制成工作液。</td></tr><tr><td>Triton 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A96470</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>内源黏蛋白抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-65495</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>人波形蛋白抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>人 CD31 抗体</td><td>DAKO</td><td>M0823</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>人 CD45 抗体</td><td>DAKO</td><td>M0701</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>ADRP（Perilipin2）</td><td>antibodies-online</td><td>ABIN283918</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11029 或 A11005</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>山羊抗兔二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11037 或 A11008</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11007 或 A21247</td><td>储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>苏丹黑</td><td>Sigma</td><td>S2380</td><td>配制 1% 苏丹黑乙醇溶液作为储备液。室温储存。使用前用 70% 乙醇配制 0.1% 工作液，并用滤纸过滤。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 配制 100 mg/mg 储备液。储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>荧光封片剂</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>使用前加入 DAPI（按 DAPI 储备液 1:400 稀释）。</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0147</td><td></td></tr></tbody></table>

人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

人类造血干细胞（HSCs）定位于骨髓（BM）微环境，该微环境是由多种成分构成的复杂多因素网络，可产生细胞因子、生长因子和细胞外基质。HSCs能否维持静息状态、自我更新或分化，以及是否发生突变并转化为恶性细胞，取决于其与不同基质成分之间建立的复杂相互作用。为了在生理和病理条件下观察人类HSCs与人类骨髓微环境之间的相互作用，我们设计了一种在免疫缺陷小鼠体内异位构建并成像人源化骨髓微环境的实验方案。我们证明，利用不同的细胞成分可形成人源化结构，并支持长期的人类造血细胞植入。通过双光子显微镜，可对这些结构进行活体成像 原位 在单细胞分辨率下，为人类骨髓微环境的功能表征及其在调控正常与恶性造血中的作用提供了强大的新工具。

在图1中，展示了支架细胞接种和植入过程的代表性图像。图1C显示细胞被直接注射到支架中。图1G显示在小鼠背部做切口，以创建皮下囊腔并植入支架。图2展示了植入NSG小鼠体内8周后回收的不同支架的大体形态。注意，在接种人骨髓间充质干细胞（hMSC）的支架中可见轻微的血管化现象（图2A）。当在支架中共同接种人内皮细胞（ECs）与hMSCs时，可促进形成更具生理相关性的血管结构（图2B）。最后，重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）的存在可诱导骨组织形成。在此情况下，回收的支架体积更大，并由类似骨组织的硬质组织构成。
图3展示了在显微镜上进行活体成像时使用NDD的通道配置设置（详见图注）。图4和视频1显示了人源间充质干细胞（hMSC）包被支架中的人造血细胞。支架在植入后8周取出，并在取出前经静脉注射AF488-hCD45抗体和655-VPA。该操作可通过双光子共聚焦显微镜实现对植入的人造血细胞及血管结构的可视化。在此情况下，图像显示了支架中的血管（655-VPA）以及人造血细胞（AF488-hCD45）在支架实质中的长期植入情况。图5和视频2对应接种了人内皮细胞（hECs）和人源间充质干细胞（hMSCs）的人源支架。术后8周，在静脉注射FITC-hCD31抗体和655-VPA后取出支架，并如前所述使用双光子共聚焦显微镜采集图像。图像显示hECs参与了支架内血管的形成，从而形成了小鼠-人嵌合血管系统。
图6A展示了用于刺激MSC支架中骨组织形成的代表性数据。与之前图示类似，在植入8周后，通过静脉接种655-VPA，随后回收支架，并利用双光子共聚焦显微镜获取图像。经rhBMP-2刺激的支架可诱导骨组织形成，由于骨中钙离子产生的二次谐波信号（图像中呈青色），可清晰可视化骨组织。所提供的图像还显示了腔隙及血管化骨内膜样组织的形成，其形态特征与骨髓（BM）骨内膜组织高度相似。在图6B和视频3中，人内皮细胞（hECs）与人骨髓间充质干细胞（hMSCs）共同植入。在静脉注射FITC标记的抗hCD31抗体和655-VPA后回收支架，双光子共聚焦显微图像显示hECs参与了成骨支架中的新生血管形成过程。
图7展示了组织学的代表性图像，该实验用于验证先前描述的结果。免疫荧光图像显示了小鼠血管系统、人内皮细胞（hECs）、人骨髓间充质干细胞（hMSCs）以及在支架结构中长期植入的人造血细胞。从小鼠体内回收的支架经固定后用于免疫荧光分析。在rhBMP-2载体成骨支架（图7D-F）中，可见组织形态类似于成熟的骨髓组织，并含有脂肪组织。在此成骨支架中，我们发现hMSCs表现为成纤维细胞，表明其作为基质细胞参与了新组织的形成。我们还观察到人脂肪细胞标志物的表达，提示hMSCs也参与了脂肪组织的形成。
<img alt="组织工程过程；支架制备与细胞培养；实验室设置中的实验步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 细胞接种与植入过程的代表性图像。A) 初始支架及其使用手术刀的切割方法。B) 从初始支架获得的24个片段。C) 使用注射器进行支架细胞接种的方法。D) 接种细胞后的支架加入培养基，准备植入。E-F) 成骨支架的特定步骤：E) 将支架转移至96孔U型底板，以及F) 向支架添加rhBMP2、凝血酶和纤维蛋白原的方法的代表性图像。G-J) 在全身麻醉下的外科植入手术：G) 皮肤切口及支架植入，H) 植入方法，以及I-J) 使用外科胶水关闭切口的过程。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织工程支架比较，MSC，MSC+EC，MSC+EC+BMP2，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 从小鼠体内取出的不同支架。 MSC 支架（左）、MSC+EC 支架（中）和 MSC+EC+BMP 支架（右）的代表性图像。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光成像中显微镜光学设置示意图及发射光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 通道配置。 显示了显微镜滤光片设置。A) 共有四个NDD检测器模块：第一个模块包含两个滤光片组；第二和第三个模块各有一个滤光片组；最后一个模块无滤光片组（未使用）。第一个光电倍增管（PMT）用于远红通道（640 - 690 nm），反射较短波长；随后的通道依次为380 - 485 nm、500 - 550 nm和555 - 625 nm（顺序始终从短波长到长波长）。B) 上述配置可检测到的荧光染料发射光谱（以颜色编码）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，细胞标记，AF488-hCD45，655-VPA，合并图像，免疫荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. MSC支架可支持人类造血细胞微环境的形成。 A) 和 B) 移植后获取的Z轴层扫描图像的三维重建结果，经静脉接种AF488-hCD45（绿色）以标记人类造血细胞，以及655-VPA（品红色）以标记血管系统。标尺在A和B（上排图像）中代表20 µm，在B（下排图像）中代表5 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示细胞结构、蛋白质定位和细胞分析的荧光显微图像" src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="视频 1"> 
视频 1. MSC 支架可为人类造血细胞形成微环境。在 MSC 支架中，人类造血细胞（AF488-hCD45）与血管系统（655-VPA）相关联的三维重建图像（胶原结构：SHG，青色）。每个图像堆栈大小为 140 × 140 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）</a>
<img alt="荧光显微镜，FITC-hCD31 和 VPA-655，细胞结构，显微图像，蛋白质标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5. 人源内皮细胞参与间充质干细胞支架中人源化血管的形成。 在 MSC+EC 支架中，由人源内皮细胞（FITC-hCD31）排列形成的血管系统（655-VPA）的三维重建图像。比例尺代表 20 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；显示细胞分析中红色和绿色染色模式的组织结构。" src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="视频 2"> 
视频 2. 人内皮细胞参与MSC支架中人源化血管的形成。 人内皮细胞（FITC-hCD31）沿MSC+EC支架中血管系统（655-VPA）排列的三维重建图像。每个图像堆栈尺寸为 240 x 240 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">请点击此处观看视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="使用SHG、FITC-cd31标记和荧光成像对组织进行显微分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. rhBMP-2载体支架具有与骨髓相似的骨表面和人源化血管系统。 A) MSC+BMP支架的三维重建图像，显示骨结构（SHG-青色）和血管系统（655-VPA）的形成。比例尺分别为100 µm（左）、70 µm（中）和50 µm（右）。 B) MSC+EC+BMP支架的三维重建图像，显示由人源内皮细胞（FITC-hCD31）衬覆的人源化血管（655-VPA）。比例尺分别为50 µm（左）和30 µm（中、右）。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构中荧光蛋白的显微图像；细胞过程的研究。" src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="视频 3"> 
视频 3. rhBMP-2 载体支架具有类似于骨髓的骨表面和人源化血管系统。 MSC+VERA+BMP 支架的三维重建图像（骨组织：SHG；血管：655-VPA；人源内皮细胞：FITC-hCD31）。每幅图像堆栈尺寸为 600 x 600 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">请点击此处观看视频。（右键可下载。）</a>
<img alt="经DAPI染色和蛋白标记细胞的免疫荧光显微镜图像；细胞类型鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7. 固定支架上免疫荧光实验的代表性图像。 A-F) 对植入支架中的人源细胞进行免疫荧光分析以定位其分布。 A-C) 植入hECs、hMSCs和hHSCs的支架。 D-F) 促进成骨的支架，其中植入了hECs、hMSCs和hHSCs。各荧光通道如下：A-D) 人源内皮细胞（hCD31）与小鼠血管结构（endomucin, ENDOM），B-E) 人源间充质干细胞（hVimentin, hVIM）与小鼠血管细胞（endomucin, ENDOM），C) 人源造血细胞（hCD45）与小鼠血管系统（endomucin, ENDOM），以及 F) 人源脂肪分化相关蛋白（hADRP）与小鼠血管系统（endomucin, ENDOM）。比例尺表示：10 µm（A和C）、20 µm（B和E）、40 µm（D和F）。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在小鼠体内构建并进行活体成像不同类型人源化骨髓微环境的方法。该方法基于人源间充质细胞所构建的支持性微环境，通过添加人源内皮细胞可诱导形成人源血管，而添加重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）则可诱导形成人-鼠嵌合的成熟骨组织。

人类造血干细胞（HSCs）定位于骨髓（BM）微环境，这是一个复杂的、由多种因素构成的网络结构，可产生细胞因子、生长……

本方法的总体目标是将人源细胞载体支架植入小鼠体内，以构建人源化骨髓微环境，并对植入物内人源细胞的行为进行活体成像。该方法将有助于回答人类造血领域的关键科学问题，因为它能够以单细胞分辨率重现并进行活体成像，观察骨髓微环境中的不同组分。该系统的多功能性是其主要优势之一，允许逐个或联合植入不同的微环境组分。该方法学可能适用于其他研究领域，例如肿瘤转移或药物筛选研究。采用适当的无菌技术，首先将灭菌的明胶海绵切割成24个大小相近的片状。通过将明胶支架浸入乙醇，随后浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，使其重新水化。然后用无菌纸巾轻轻吸去每个支架上的多余液体，并将支架转移至超低吸附24孔板的各个孔中。使用胰岛素注射器，将50微升培养基中含有1×10⁵至1×10⁶个基质细胞的细胞悬液小心注入每个支架内，随后将培养板放入细胞培养箱中。在向支架内注射细胞时，应确保无细胞悬液从支架中渗漏。一小时后，向每个孔中加入三毫升新鲜细胞培养基，并将支架放回培养箱中。24小时后，向支架中接种1×10⁵个造血细胞，随后进行培养并补充培养基，再继续培养24小时，操作方法同上。为制备重组人骨形态发生蛋白2载体支架，将重悬的支架放入U型底96孔板的各个孔中，每个支架加入5 µL重组人骨形态发生蛋白2。然后用 20 微升凝血酶和 20 微升纤维蛋白原覆盖支架。手术植入生物工程支架时，首先剃除实验小鼠背部的手术区域，用浸有稀释氯己定的棉签在暴露的皮肤表面每个方向擦拭三次进行清洁。接着，使用无菌镊子和手术刀在皮肤上做一道由前至后长约 0.5 至 0.7 厘米的切口，并将镊子插入皮下组织下方以形成一个皮下囊袋。将支架深入植入囊袋中，并用手术胶水闭合切口。植入的支架需在体内发育8至24周后再进行取出。经静脉注射荧光物质并处死动物后，按前述方法对皮肤进行消毒，在动物背部靠近原植入部位处做一纵向皮肤切口。小心地将皮肤与植入支架的皮下囊分离，然后用镊子轻轻夹住支架，并小心剪除支架周围残留的膜和组织，以回收支架结构。使用速干型粘合胶将支架固定在35 mm × 10 mL的培养皿上。对于含有骨形态发生蛋白2的支架，在向培养皿中加入PBS之前，需在显微外科手术显微镜下使用外科微型钻头对骨表面进行减薄处理，以便观察荧光标记物并实现高分辨率图像采集。在钻孔过程中需格外小心，因为不同支架的骨厚度通常存在差异，应注意避免破坏表面。用室温的PBS填充培养皿。进行生物工程支架的双光子显微镜成像时，将支架放置在共聚焦显微镜载物台上，并选择20倍、1.0 NA的水浸物镜。然后，在成像软件的采集模式下，选中显示手动工具选项。在激光器菜单中，打开双光子激光器，并让激光器预热并稳定。当激光器准备就绪后，在成像设置菜单中，启用通道模式并设置为每帧切换轨道。在光路菜单中选择非扫描型和主分光镜 MBS 760 plus。激活四个非扫描型探测器，并按照示意图所示设置配置。在通道菜单中，将激光波长设置为 890 纳米，功率设置为 50%。将总增益设为 500 至 600，数字偏移设为零，每个通道的数字增益设为 15。在采集模式下，设置适当的参数以获得高分辨率图像，同时避免损伤组织和漂白荧光染料。然后将放大倍数设为1，进行图像的初始扫描。当所有参数设置完毕后，降低物镜直至其接触盐溶液，并使用光源灯手动调节物镜焦距。现在激活Z轴层扫菜单，选择首尾功能。设置相邻两层切片所需的间隔距离，选择“实时”以对样本进行实时扫描成像，并根据需要调整数字增益和数字偏移，以获得最佳曝光效果。如需同时观察多个通道，请选择分屏功能。在活体模式下，于阶段菜单中扫描图像，并标记出感兴趣区域，例如骨腔的位置。当样本扫描完成后，移动至第一个感兴趣区域，使用活体模式下的“设置首个”和“设置末个”功能，设定围绕该感兴趣区域的三维Z轴堆栈的顶部和底部。然后设定中心点C，点击“开始实验”按钮，以开始对该感兴趣区域进行Z轴堆栈图像采集。成像完成后，将图像保存至指定文件夹，并扫描下一个感兴趣区域。在这些代表性图像中，可观察到植入八周后从免疫缺陷型 NSG 小鼠体内回收的不同支架材料的大体形态。与人内皮细胞共接种可增加支架的血管化程度，而添加重组人骨形态发生蛋白 2 可诱导骨组织形成。通过活体双光子显微镜成像的这些支架显示了支架内存在血管，以及人源造血细胞在支架实质中的长期定植。接种了人源内皮细胞和间充质基质细胞的支架表明，人源内皮细胞参与了支架内血管的形成，从而产生了小鼠-人嵌合的血管系统。骨组织的形成可通过双光子显微镜观察到，同时还能观察到终骨组织中人源化血管内形成的腔隙，其形态高度类似于骨髓终骨组织。此外，在重组人骨形态发生蛋白2的载体支架中，支架内组织的形态类似于含有脂肪组织的成熟骨髓，表明人源间充质基质细胞也参与了脂肪组织的形成。观看本视频后，您应对所有生物工程操作及主要的小鼠支架模型有充分的理解。操作过程中务必始终保持无菌环境，并在处理支架时格外小心。需注意该方法的相关局限性，例如组织中存在人-鼠嵌合体。需牢记成像后样本仍可用于进一步研究，因为支架可被消化，从而能够从中回收活细胞。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

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颅骨骨髓血管动态的活体纵向成像

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人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

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