人类骨髓微环境在小鼠中的生物工程及其通过实时成像的可视化
August 1st, 2017
提出了一种在小鼠中创建和实时映射不同人源化骨髓小生境的方法。基于由人间充质细胞产生的支持性利基，人内皮细胞的添加诱导人血管的形成，而添加rhBMP-2诱导人 - 小鼠嵌合成熟骨组织的形成。
该方法的总体目标是将人类细胞载体支架植入小鼠体内，以创建人源化骨髓生态位，然后对植入物内人体细胞的行为进行实时成像。这种方法将有助于回答人类造血领域的关键问题，因为它允许以单细胞分辨率复制和实时成像骨髓的不同成分。该系统的多功能性是其主要优势之一，因为它允许一个接或组合植入不同的利基组件。
这种方法有可能应用于其他研究领域，如肿瘤转移或药物筛选研究。使用适当的无菌技术，首先将消毒的明胶海绵切成 24 块大小相似的块。通过浸入乙醇中，然后浸入 PBS 中来重构明胶支架。
然后轻轻地将每个支架轻拍在无菌组织上以去除多余的液体，并将支架转移到超低附着 24 孔板的各个孔中。使用胰岛素注射器，小心地将 50 μL 培养基中的 1 次 10 至 5 次至 10 次至第 6 次基质细胞注射到每个支架中，然后将板放入细胞培养箱中。将细胞注射到支架中时，请确保支架没有泄漏。
1 小时后，在每个孔中填充 3 mL 新鲜细胞培养基，然后将支架放回培养箱中。24 小时后，将第五个造血细胞注射 10 次到支架中，然后孵育并进一步添加培养基，然后孵育 24 小时，如刚才所示。为了生成重组人骨形态发生蛋白两个载体支架，将重组的支架放入 U 形底 96 孔板的各个孔中，并向每个支架中加入 5 微升重组人骨形态发生蛋白 2。
然后用 20 微升凝血酶和 20 微升纤维蛋白原覆盖支架。对于生物工程支架的手术植入，首先剃掉实验小鼠背部的手术区域，并使用蘸有稀释洗必泰的棉签在每个方向清洁暴露的皮肤表面 3 次。接下来，使用无菌镊子和手术刀在皮肤前后切开 0.5 至 0.7 厘米，然后将镊子插入皮下组织以形成口袋。
将支架深深插入口袋中，并用手术胶水闭合切口。在外植体前让植入的支架发育 8 到 24 周。在静脉注射荧光物质和对动物实施安乐死后，如刚才所示对皮肤进行消毒，并在动物背部靠近原始植入部位的地方做一个纵向皮肤切口。
小心地将皮肤与植入支架的皮下袋分开，然后用镊子轻轻抓住支架，小心切割支架周围的残留膜和组织，以恢复结构。使用速效胶粘剂将支架固定到 35 x 10 毫升的培养皿上。对于骨形态发生蛋白两个支架，在用 PBS 填充板之前，在显微外科显微镜下使用手术显微钻头减薄骨表面，从而实现荧光团的可视化和图像的高分辨率捕获。
在钻孔过程中要特别小心，因为骨骼的厚度通常因支架而异，重要的是不要破坏表面。用室温 PBS 填充培养皿。对于生物工程支架的 2 光子显微镜成像，将支架放在共聚焦显微镜载物台上，然后选择 20 倍 1.0 NA 水浸透镜。
然后，在成像软件的采集模式下，选中 show manual tools 框。在激光菜单中，打开 2 光子激光，并让激光预热和稳定。激光准备就绪后，在成像设置菜单中，激活通道模式并每帧切换跟踪。
在光路菜单中，选择非退扫描和主分束器 MBS 760 plus。激活四个非 descanned 检测器并设置配置，如图所示。在通道菜单中，将激光波长设置为 890 纳米，将功率设置为 50%将每个通道的增益主设置为 500 到 600，将数字偏移设置为 0，将数字增益设置为 15。
在采集模式下，设置适当的参数以获得高分辨率图像，而不会损坏组织和漂白荧光团。然后将 zoom 设置为 1 以进行图像的初始扫描。设置完所有参数后，降低镜头直到它接触到盐水溶液，然后使用灯作为光源手动设置镜头焦距。
现在激活 Z-stack 菜单，并选择 first last 函数。在两个后续切片之间设置所需的间隔，并选择实时对样品的实时扫描进行成像，根据需要调整数字增益和数字偏移以实现最佳曝光。要同时可视化多个通道，请选择 split 函数。
在舞台菜单中，在实时模式下，扫描图像并标记感兴趣的区域，例如骨腔的位置。样品扫描完成后，移动到第一个感兴趣区域，并在实时模式下使用 set first 和 set last 功能来设置感兴趣区域周围 3D Z 堆栈的顶部和底部。然后设置中心 C，然后单击 start experiment 按钮开始感兴趣区域的 Z 堆栈图像采集。
采集完成后，将图像保存在指定的文件夹中，并扫描下一个感兴趣的区域。在这些代表性图像中，可以观察到植入后 8 周从免疫缺陷 NSG 小鼠中回收的不同支架的大体形态。与人内皮细胞共接种增加了支架的血管化，而添加重组人骨形态发生蛋白 2 诱导骨形成。
这些支架通过实时 2 光子显微镜成像，揭示了支架中存在血管，并且人造血细胞长期植入支架薄壁组织。用人内皮细胞和间充质基质细胞接种的支架表明，人内皮细胞参与支架内血管的形成，导致小鼠-人凝乳血管系统。骨组织的形成可以通过 2 光子显微镜观察，以及骨内膜组织中人源化脉管系统中空腔的形成，这与骨髓骨内膜组织高度相似。
此外，在重组人骨形态发生蛋白两个载体支架中，支架内组织的形态类似于具有脂肪组织的成熟骨髓，表明人间充质基质细胞也有助于脂肪组织的形成。看完这个视频，你应该对所有生物工程和主要的小鼠支架有很好的了解。永远记住要保持苦行的环境，并在处理脚手架时格外小心。
请记住与此方法相关的限制，例如组织的人鼠嵌合体。请记住，成像后，样品可用于进一步研究，因为支架可以被消化，因此可以从中取出活细胞。
概述
本文介绍了一种在小鼠中创建和实时成像人源化骨髓微环境的方法。该方法涉及人类细胞载体支架的植入，使得可以在植入物内观察人类细胞行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 骨髓研究
- 细胞成像
背景
- 人源化骨髓微环境对于研究造血至关重要。
- 人类间充质和内皮细胞之间的相互作用对于血管形成非常重要。
- 单细胞分辨率的实时成像提供了对细胞动力学的洞察。
- 这种方法在各种研究领域都有潜在应用。
研究目的
- 开发一种将人类细胞支架植入小鼠的方法。
- 在受控环境中实现人类细胞的实时成像。
- 研究人-小鼠嵌合体骨组织的形成。
使用的方法
- 为细胞植入准备明胶支架。
- 将基质细胞和造血细胞注射到支架中。
- 将支架手术植入小鼠。
- 使用二光子显微镜对植入的支架进行实时成像。
主要结果
- 在小鼠中成功创建人源化骨髓微环境。
- 观察到人类内皮细胞增强了血管形成。
- 确认了嵌合体成熟骨组织的形成。
- 该方法允许对微环境组分进行多样化的实验。
结论
- 该方法为研究人类造血提供了一个有价值的工具。
- 实时成像允许对细胞相互作用进行实时观察。
- 这种方法可以适用于其他研究领域，包括药物筛选。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to model human hematopoietic stem cell interactions within a tunable bone marrow microenvironment, supporting target validation and mechanistic de-risking in hematologic drug discovery. Live imaging at single-cell resolution provides quantitative readouts for assessing compound effects on cell engraftment, differentiation, and niche interactions, improving predictive confidence in preclinical models. The system’s versatility allows for systematic interrogation of stromal components, facilitating assay development and translational biomarker discovery in leukemia, lymphoma, and bone marrow failure disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of human hematopoietic stem cell behavior in response to stromal signals, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible system to assess how niche components influence HSC quiescence, self-renewal, and differentiation.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing human-mouse chimeric tissue formation and cellular crosstalk in situ.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable imaging outputs such as vascularization density, engraftment levels, and cavity formation for compound screening.
- Operational Value: Standardized scaffold preparation and implantation enable scalable, reproducible assays across multiple conditions.
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream drug screening and phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant human bone marrow microenvironment to study malignant hematopoiesis and therapy resistance.
- Operational Value: Supports longitudinal tracking of human cell engraftment over 8–24 weeks, enabling chronic preclinical studies.
- Scientific Value: Enhances translational continuity by allowing retrieval of live cells post-imaging for further functional analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, particularly for hematologic malignancies and bone marrow-targeted therapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal factors influencing HSC fate decisions and malignant transformation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, vascularized humanized niches with quantifiable imaging endpoints.
- Analytics: Provides high-resolution, multiplexed imaging data on cell localization, vessel formation, and tissue architecture for comparative condition analysis.
- Translational Research: Models human-specific niche interactions relevant to preclinical validation of hematopoietic therapies.
- Enterprise Reuse: Platform adaptability allows reuse across multiple projects by varying stromal, endothelial, or hematopoietic cell inputs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on xenograft models lacking human stromal context.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized scaffold fabrication and implantation procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insights into drug effects on niche-HSC interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on engraftment, differentiation, and niche remodeling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell culture, microsurgical implantation, and two-photon microscopy operation.
- Dependent on access to two-photon microscopes with non-descanned detectors and appropriate laser tuning (e.g., 890 nm).
- Necessitates cross-team standardization between cell biology, imaging, and animal surgery teams for consistent scaffold preparation.
- Adaptation considerations include varying human cell sources (e.g., patient-derived HSCs, stromal lines) and niche components (BMP2, endothelial cells).
- Practical limitations include human-mouse chimera formation and variability in scaffold integration, which may affect imaging consistency.
