从人脐带血中分离内皮祖细胞

本实验的总体目标是从人脐带血中分离内皮祖细胞。该方法描述了从脐带血中分离内皮祖细胞的过程，这些细胞有望作为自体细胞用于血管移植物的组织工程。该技术的主要优势在于，分离过程可在专用培养基中完成，无需进行任何抗原分选。

分离得到的内皮祖细胞可用于研究新生血管形成，已有研究报告指出这些细胞还可作为生物标志物，用于识别心血管疾病风险患者。在开始分离操作前，每孔加入两毫升新配制的大鼠尾部I型胶原溶液，对6孔板进行预包被。将培养板置于37摄氏度、5%CO2的培养箱中，平衡至少一小时。

然后将约25毫升脐带血以1:1的比例用HBSS稀释。接着将20毫升密度梯度介质试剂加入50毫升锥形管中，并沿管壁缓慢加入20毫升稀释后的脐带血，使血液分层覆盖于介质上方。通过离心分离细胞，随后小心移除血浆层。

使用带有18号针头的注射器，将含有单个核细胞的血沉棕黄层收集到一个新的50毫升离心管中。向细胞中加入等体积的内皮细胞基础培养基。通过离心洗涤细胞，并在冰上用5毫升氯化铵溶液裂解所得沉淀中的红细胞。

轻轻振荡5到10分钟后，通过离心收集细胞，并将白色沉淀重悬于新鲜的内皮细胞生长培养基中。计数后，吸除六孔板中每孔的胶原蛋白溶液，并用PBS洗涤每孔三次。以每孔2毫升培养基中接种1×10⁷个细胞的浓度接种单个核细胞。

将培养板放回培养箱中孵育24小时。第二天，用新鲜的内皮细胞生长培养基冲洗细胞一次。然后更换为3毫升新鲜的内皮细胞生长培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养。

使用明场显微镜每日获取细胞图像，以监测内皮细胞克隆的生长进展，并标记克隆出现的培养板位置以追踪其生长情况。当内皮细胞克隆大小达到约三毫米时，在细胞培养孵育箱中用新鲜的大鼠尾尾胶原蛋白包被T25培养瓶，至少孵育一小时。随后在细胞培养孵育箱中每孔加入150 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，消化2至3分钟，以收获细胞。

轻轻敲击培养板以使贴壁细胞脱落。当细胞开始脱离时，立即加入2 mL新鲜的内皮细胞生长培养基，并将细胞收集至一个15 mL的圆锥形离心管中。通过离心收集细胞，然后将沉淀重悬于新鲜的内皮细胞生长培养基中。

计数后，将细胞以每毫升培养基含5×10⁵个细胞的密度接种于胶原蛋白包被的培养瓶中，每瓶加入3毫升培养基，并将该培养瓶标记为第1代。随后将培养瓶放回培养箱中培养，当细胞集落达到90%融合度时，进行传代。接种至胶原蛋白处理的培养板后，通常在第5至第9天之间可观察到首个细胞集落的生长。

在培养的早期阶段，细胞集落持续生长并呈现纺锤形的细胞形态，随后逐渐发展为鹅卵石样的形态。每次传代所收获的细胞总数与培养天数呈直接正相关。Western 印迹分析显示，培养的内皮细胞在早期表达 CD31 和 CD34，但随着后续传代，其表达水平似乎逐渐降低。

然而，血管内皮生长因子受体2的表达随时间推移得以维持，尽管其表达水平略低于第一代培养时所观察到的水平。值得注意的是，内皮祖细胞不表达间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白，这一点不同于例如瓣膜间质细胞裂解物，后者可作为阳性对照。整个分离过程可在5小时之内完成，具体时间取决于所获得的脐带血样本。

在内皮细胞生长培养基中分离并接种单个核细胞后，通常需要5至9天，内皮祖细胞（EPC）集落才会在培养物中出现。该分离方法采用专用于培养内皮祖细胞的培养基，并且在检测内皮细胞标志物方面避免了流式细胞仪的使用。该方法还提供了一种高效方案，可在较短时间内获得大量内皮祖细胞。

观看本视频后，您应能够充分了解如何从人脐带血单位中分离内皮祖细胞。请务必注意，人脐带血可能具有生物危害性，废弃的血液和细胞培养产物应按照规范进行妥善处理。