人脐血内皮祖细胞的分离

该协议的目的是分离脐血内皮祖细胞。一些应用包括利用这些细胞作为生物标志物来识别心血管风险患者, 治疗缺血性疾病, 并创建组织工程的血管和心脏瓣膜结构。

该程序的总体目标是从人脐带血中分离内皮祖细胞。该方法描述了从脐带血中分离内皮祖细胞，以将其潜在用作血管移植物组织工程的自体细胞。该技术的主要优点是分离程序可以在专用培养基中完成，而无需任何氨基分选。

分离的内皮祖细胞可用于研究新生血管形成，报告还表明这些细胞可用作生物标志物来识别有心血管疾病风险的患者。在开始分离程序之前，用 2 毫升新鲜制备的大鼠尾预涂 6 个孔板，每孔 1 个胶原蛋白溶液。在 37 摄氏度和 5% CO2 培养箱中平衡板至少 1 小时。

然后用 HBSS 以 1：1 的浓度稀释大约 25 毫升的脐带血。接下来，将 20 mL 密度梯度培养基试剂添加到 50 mL 锥形管中，并小心地将 20 mL 稀释的脐带血沿管壁分配，以将血液分层到培养基上。通过离心分离细胞，然后小心去除血浆层。

使用装有 18 号针头的注射器，将含有血沉棕黄层的单核细胞收集到一个新的 50 毫升试管中。并向细胞中加入等体积的内皮基础培养基。通过离心洗涤细胞，并在冰上用 5 毫升氯化铵溶液裂解所得上颚中的红细胞。

偶尔摇晃 5 至 10 分钟后，通过离心收集细胞，并将白色沉淀重悬于新鲜的内皮生长培养基中。计数后，从六孔板的每个孔中吸出胶原蛋白，并在 PBS 中洗涤孔 3 次。以每孔浓度 2 毫升培养基的 1 乘 10 至第 7 个细胞接种单核细胞。

并将板放回培养箱中 24 小时。第二天，用新鲜的内皮生长培养基冲洗细胞一次。然后用 3 mL 新鲜的内皮生长培养基替换洗涤液，并将细胞放回细胞培养箱中。

使用明场显微镜获取细胞的每日图像，以监测内皮细胞集落的进展，标记集落出现的板以跟踪其生长。当内皮细胞集落达到约 3 毫米大小时，在细胞培养箱中用新鲜大鼠尾部 1 份胶原蛋白包被 T25 培养瓶至少 1 小时。然后在细胞培养箱中用每孔 150 μL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 收获细胞，持续 2 至 3 分钟。

轻轻敲击板以去除附着的细胞。当细胞开始分离时，立即加入 2 mL 新鲜的内皮生长培养基，并将细胞拉入单个 15 mL 锥形管中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜的内皮生长培养基中。

计数后，将细胞以 5 乘以 10 的 10 倍接种到第五个细胞中，每个培养瓶密度为 3 毫升培养基，并将培养瓶标记为传代 1。然后将培养瓶放回培养箱中，每当菌落达到 90% 汇合时重新接种细胞。接种到胶原蛋白处理的平板上后，通常在第 5 天到第 9 天之间观察到第一个菌落生长。

菌落继续生长，并在培养的早期阶段获得纺锤形细胞形态，随后发展为鹅卵石状形态。每次传代时收获的细胞总数与培养总天数直接相关。Western blot 分析显示培养的内皮细胞早期表达 CD 31 和 CD 34，随着随后的传代，这种表达似乎会降低。

然而，血管内皮生长因子受体 2 的表达会随着时间的推移而维持，尽管表达水平略低于首次传代后观察到的表达水平。值得注意的是，内皮祖细胞对间充质细胞标志物 α 平滑肌肌动蛋白不呈阳性，这与瓣膜间质细胞裂解物不同，它可以作为阳性对照包括在内。整个分离程序可以在不到 5 小时内完成，具体取决于获得的脐带血单位。

在内皮生长培养基中分离和接种单核细胞后，通常需要 5 到 9 天才能使 EPC 集落出现在培养物中。提出的分离方法使用专门的培养基来培养内皮祖细胞，并且避免使用流式细胞仪，只要需要具有内皮标志物。该方法还提供了一种有效的方案，可在短时间内获得大量内皮祖细胞。

看完这个视频，你应该对如何从人脐带血单位中分离内皮祖细胞有一个很好的了解。不要忘记人类脐带血可能很危险，应妥善处理废血和细胞培养产品。