细胞凋亡细胞的吞噬作用果蝇胚胎

该程序的总体目标是测量果蝇的体内吞噬作用，以评估感兴趣的特定基因参与凋亡细胞吞噬。这种方法可以帮助回答免疫学和发育生物学领域关于凋亡细胞吞噬机制的关键问题。该技术的主要优点是可以轻松使用细胞，并在体内精确测量吞噬水平。

该技术的含义延伸到炎症性疾病和自身免疫性疾病的治疗，因为通过吞噬作用凋亡的细胞对于去除引起炎症的危险细胞是必要的。首先将 200 只成年雌性果蝇和 200 只成年雄性果蝇和一盘新鲜葡萄汁琼脂加入 50 毫升锥形管中。用海绵盖住试管，将果蝇在 16 摄氏度的光照下孵育 2 到 3 天。

孵育结束时，将果蝇在黑暗中移至 25 摄氏度 1 小时，然后用不含酵母的新板替换旧板。让苍蝇产卵两个小时。然后将板在 16 摄氏度下孵育 26 小时。

第二天，使用油漆刷将胚胎转移到一毫升补充有 0.2%Triton X-100 的 PBS 中。洗涤两次后，向胚胎中加入 1.2 毫升次氯酸钠溶液以去除绒毛膜。三分钟后，在新鲜的 PBS 和 Triton X-100 中洗涤胚胎四次。

将洗涤后的胚胎转移到 6 厘米琼脂糖板上，并将板置于解剖显微镜下。使用微型尖端识别 16 期胚胎。使用微量移液器将大约 50 个 16 期胚胎转移到 1.5 毫升微量试管中。

要分离胚胎细胞，首先用 150 微升 PBS 洗涤胚胎两次。将胚胎转移到新的 1.5 毫升微量试管中。然后加入 200 微升胶原酶，并用沉淀混合器将胚胎匀浆 30 次。

匀浆结束时，将胚胎细胞研磨 10 次，并将细胞悬液转移到新的 1.5 毫升试管中。将细胞在 37 摄氏度下孵育 1 分钟。然后将细胞再研磨 10 次，并将它们放回 37 摄氏度的培养箱中再研磨一分钟。

在第二次孵育结束时，向细胞中加入 800 微升 PBS，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于 200 μL 胰蛋白酶中，然后通过 70 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液。在 800 微升 PBS 中用 40 微升热灭活胎牛血清终止酶活性，并通过离心收集细胞。

沉淀的细胞重悬于 200 微升新鲜 PBS 中，并再次离心收集细胞。将沉淀重悬于 30 微升 PBS 中，并将细胞安装在氨丙基三乙氧基硅烷涂层的载玻片上。当细胞附着后，使用移液器从载玻片上去除多余的 PBS，并用 60 至 70 微升 4% 多聚甲醛固定细胞。

10 到 15 分钟后，去除固定剂并在 PBS 中洗涤细胞 1 分钟。为了用抗 Croquemort 抗体对细胞进行免疫染色，首先将载玻片连续浸泡在甲醇中，然后用补充有 0.2%Triton X-100 的 PBS 浸泡，然后单独用 PBS。接下来，用 20 微升 5% 全猪血清的 PBS 溶液和 0.2% Triton X-100 在室温下封闭非特异性结合 20 分钟。

去除多余的封闭溶液，并在 4 摄氏度下用 20 微升抗 Croquemort 抗血清标记细胞过夜。第二天早上，在 PBS 加 Triton X-100 中洗涤玻片，孵育 5 次，每次 10 分钟。最后一次洗涤后，用 PBS 冲洗玻片 10 分钟。

然后在室温下用 20 μL 碱性磷酸酶标记的抗大鼠 IgG 标记细胞 1 小时。孵育结束时，如图所示，在 PBS 和 Triton X-100 中洗涤玻片 5 次，然后在缓冲溶液中浸泡 10 分钟。然后用磷酸酶底物溶液标记细胞，并在光学显微镜下观察细胞。

当血细胞颗粒中出现强烈的紫色信号时，去除多余的底物，并将玻片浸泡在补充有 EDTA 的缓冲液中 5 至 10 分钟。孵育结束时，用两次 5 分钟的 PBS 洗涤液冲洗细胞，并用平衡缓冲液处理 10 分钟。去除溶液后，用 20 μL 37 摄氏度的末端脱氧核苷酸转移酶溶液标记细胞 1 小时。

然后从玻片中取出溶液，将细胞浸泡在 0.5 mL、终止洗涤缓冲液和 17 mL水中 10 分钟。接下来，用 3 次 5 分钟的 PBS 洗涤液冲洗细胞，并在室温下用 20 微升抗地高辛过氧化物酶标记 30 分钟。孵育结束时，如图所示，在 PBS 中洗涤细胞四次，并将玻片浸泡在过氧化物酶底物中 30 秒，直到凋亡细胞变成棕色。

当达到最佳染色效果时，将玻片浸泡在水中以停止过氧化物酶反应。在这些图像中，称为血细胞的果蝇巨噬细胞对血细胞标志物 Croquemort 和刚刚证明的分散胚胎细胞中 TUNEL 存在吞噬凋亡细胞进行染色。Croquemort 阳性细胞在其细胞的小颗粒中表现出紫色信号，而 TUNEL 阳性细胞在其整个细胞体中表现出棕色信号。

或者，可以用抗 GFP 抗体对血细胞进行染色，该抗体对整个血细胞进行染色，而不仅仅是对颗粒进行染色。在本实验中，分析了野生型或单个突变胚胎中吞噬血细胞与总血细胞的比率，表明两种单一突变菌株的吞噬指数均低于野生型果蝇，而血细胞和凋亡细胞的总数相似，表明突变基因需要凋亡细胞吞噬。单个基因的 RNAi 敲除也降低了吞噬指数，而血细胞和凋亡细胞的总数保持相当，进一步强调了所研究的吞噬受体参与凋亡细胞介导的吞噬作用。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约 15 小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住避免过多的血细胞标志物和 TUNEL 染色，以便对细胞的吞噬能力进行最佳评估。按照此程序，可以对所有果蝇胚胎进行原位吞噬作用测定，以回答有关吞噬部位或血细胞分布的其他问题。

开发后，这项技术为免疫学领域的研究人员探索果蝇凋亡细胞吞噬的机制铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何测量果蝇胚胎的体内吞噬作用有一个很好的了解。