人心脏组织对细胞外基质自组装水凝胶的处理体外和体内应用
2017年12月4日
该协议描述了人类心肌的完整细胞, 同时保留了其胞外基质成分。细胞外基质的进一步处理导致微粒和细胞自组装水凝胶的生产。
该程序的总体目标是将心脏细胞外基质加工成水凝胶，从而能够研究基质在各种基于细胞的测定中的作用。这种方法可以帮助回答心脏领域的关键问题，例如细胞外基质如何影响细胞行为。该技术的主要优点是它有助于使用细胞外基质在体外或体内进行大规模实验。
该技术的应用可以扩展到心肌梗死的治疗，因为基质可以提供必要的生存线索。要开始实验，请使用带有 10 号刀片的无菌手术刀，从先前获得的左心室心肌中去除脂肪组织。使用手术刀将心肌切成大约 1 x 1 x 1 厘米的方块。
接下来，将立方体放入无菌 50 mL 试管中。将装有立方体的试管储存在 80 摄氏度。从冰箱中取出装有准备好的立方体的试管，然后在冰上将其运送到低温恒温器。
将低温恒温器的物体和腔室温度设置为 15 摄氏度。在腔室中冷却空 50 mL 试管和邮票。在冷印上添加一层冷冻切片培养基，让它冻结直到变成白色和固体。
加入第二层冷冻切片培养基，并将心肌管放入第二层。确保冷冻切片培养基和心肌完全冷冻。然后，将带有冷冻心肌的邮票插入支架并拧紧所有螺钉。
修剪组织表面，直到获得均匀的切片表面。通过自动切片对冰冻心肌进行切片，以确保切割切片均匀。一个立方体可以切出大约 30 到 40 个切片。
切片后，将每片松散地放入预冷的 50 mL 试管中。关闭装满的试管并将它们放在冰上。将所有 50 mL 试管的冷冻切片转移到一个无菌烧杯中。
每 50 mL 含有心肌切片的试管加入 50 mL 裂解液。接下来，在无菌烧杯中摇动心肌切片。通过粗过滤器过滤带有组织切片的液体。
然后，用钝镊子将组织切片转移到新的无菌烧杯中。每管初始 50 mL 心肌切片添加 50 mL 0.5% SDS 的 PBS 溶液。在室温下以 100-150 rpm 的速度连续摇动烧杯 6 小时。
摇晃后，通过粗过滤器过滤液体和组织切片。使用钝镊子，将组织切片转移到新的无菌烧杯中，并用 50 mL PBS 洗涤切片 3 次。接下来，用 1% 青霉素链霉素和 1% 制霉菌素在 PBS 中洗涤切片过夜。
第二天，去除洗涤液，将 25 mL 在 37 摄氏度下预热的 FBS 与 1% 青霉素链霉素和 1% 制霉菌素一起添加到每管初始 50 mL 心肌切片的脱细胞切片中。将切片在 37 摄氏度下孵育 3 小时，以去除基质中残留的 DNA。然后，将切片转移到新的无菌烧杯中，用 50 mL PBS 洗涤 3 次。
将 ECM 切片松散地放入新的无菌 6 孔板中。将 ECM 在 80 摄氏度下冷冻，并在冻干中冻干两天。对于 ECM 切片的粉碎，使用含有 1.4 mm 陶瓷珠的研磨管。
使用无菌钝镊子，用冻干的 ECM 松散地填充试管。在液氮中快速冷冻试管。将冷冻管插入研磨机并粉碎 ECM。
将持续时间设置为 30 秒，调整最大速度，然后启动设备。粉碎后，取出试管，再次在液氮中快速冷冻。每管加入 1 mL ddH20 洗涤管中的微粒，然后摇动以完全溶解。
然后，通过 200 微米网孔将异质溶液过滤到 50 mL 试管中。将试管冷冻在液氮中。将标准管盖更换为 0.22 微米过滤器，以防止粉末从管中流出。
将试管插入冻干机中，然后再次冻干以去除洗涤步骤中的水。将先前制备的冻干人 ECM 粉末溶解在胃蛋白酶溶液中，终浓度为 10 mg/mL。将溶液转移至 2 mL 试管中，每管体积为 1 mL。
移液管溶液以充分混合。接下来，将试管放入摇床中，在 27 摄氏度下以 1200 rpm 摇动 48 小时。从摇床中取出试管，将它们放在冰上或预冷的试管架上。
将 1/9 体积的冷 10X PBS ECM 溶液与 1/10 体积的冷 0.1 摩尔氢氧化钠 ECM 溶液混合，并将其置于冰上，以中和消化的 ECM 溶液并灭活胃蛋白酶。最后，将 ECM 溶液添加到中和混合物中，并通过移液或涡旋充分混合。单个 ECM 成分的定量分析显示，与单独通过 SDS 脱细胞相比，DNA 去除更完全，总胶原蛋白、弹性蛋白和糖凝糖聚糖的保存效果更好。
RT-PCR 用于定量小鼠 ESC 中结构性心肌蛋白、早期和晚期心肌生成转录因子以及内皮细胞表面标志基因的表达，这些基因正在自发分化。与 cECM 接触会驱动多能干细胞，最好是朝着心肌样表型移动。相差光学显微镜表明，cECM 的酶消化 48 小时，可产生更均匀的 ECM 溶液。
cECM 水凝胶上人心脏成纤维细胞的活/死染色显示活力增加。与标准培养物中的细胞相比，cECM 微粒和 cECM 水凝胶在缺血条件下均可增强收缩性 HL-1 细胞的代谢活性。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在一周内完成，从组织到水凝胶。
开发后，这项技术为心脏再生领域的研究人员铺平了道路，以探索心脏细胞外基质、体外和体内模型系统的影响。
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概述
本协议概述了人类心肌的去细胞化过程，保留了细胞外基质成分。它能够生产微粒子和细胞保护性水凝胶，用于基于细胞的测定。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏组织工程
- 细胞外基质研究
- 水凝胶应用
背景
- 了解细胞外基质在心脏健康中的作用。
- 细胞对基质线索反应的行为的重要性。
- 心肌梗塞的潜在治疗应用。
- 需要大规模的体外和体内实验。
研究目的
- 将心脏细胞外基质处理成可用的水凝胶。
- 调查基质对细胞行为的影响。
- 促进心脏研究中的大规模实验。
使用的方法
- 人类心肌的去细胞化。
- 准备心肌立方体以进行处理。
- 从细胞外基质中生产微粒子。
- 创建细胞保护性自组装水凝胶。
主要结果
- 成功保留了细胞外基质成分。
- 生产了适合基于细胞的测定的水凝胶。
- 展示了潜在的治疗应用。
- 促进了大规模实验设置。
结论
- 该方法允许有效研究心脏细胞外基质。
- 水凝胶为细胞提供了必要的生存线索。
- 该技术可以推进心脏治疗研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables the production of human-derived cardiac extracellular matrix hydrogels and microparticles, providing a tissue-specific microenvironment for studying cell-matrix interactions in cardiac regeneration research. By preserving key biomolecules such as collagen, elastin, and glycosaminoglycans while removing cellular material, the method supports physiologically relevant in vitro and in vivo models. This approach addresses the lack of tissue-specific biological activity in commercial ECM products, offering a scalable source for mechanistic de-risking in cardiac therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac extracellular matrix effects on pluripotent stem cell differentiation toward cardiomyocyte-like phenotypes.
- Operational Value: Provides a consistent, human-derived matrix substrate for functional target validation in cardiac pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized cardiac ECM microparticles and hydrogels suitable for high-throughput cell-based assays under ischemic conditions.
- Operational Value: Supports reproducible preparation of bioactive matrices for assessing compound effects on cell viability and metabolic activity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system to evaluate matrix-mediated survival cues in models of myocardial infarction.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by providing implantable hydrogel formats with preserved bioactivity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through matrix-dependent phenotypic screening and enabling translational progression via preclinical testing of ECM-based therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how cardiac extracellular matrix influences stem cell fate and cell survival in ischemic environments.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as metabolic activity and viability metrics for evaluating cellular responses to matrix cues.
- Analytics: Enables measurement of ECM composition (collagen, elastin, glycosaminoglycans) and DNA removal efficiency to assess matrix quality.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing implantable hydrogels that retain bioactive properties for regenerative applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized process for generating patient-relevant cardiac ECM materials across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by providing a human cardiac matrix model that reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization, pulverization, and hydrogel reassembly steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of matrix-dependent cellular responses in disease-relevant contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of cardiac regenerative candidates by validating microenvironmental effects prior to costly in vivo studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, decellularization, and hydrogel preparation.
- Dependent on access to sterile laboratory equipment including cryostat, lyophilizer, and milling apparatus.
- Necessitates standardized protocols for tissue sourcing, washing, and pepsin digestion to ensure batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the matrix to different cardiac cell types or species.
- Limited by the availability of human cardiac tissue and the need for aseptic processing to prevent contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Sectioning Human Myocardium into Slices
2:27
Decellularization of Human Myocardium Slices
4:20
Processing the Decellularized cECM to a Powder
5:50
Enzyme-based Homogenization of cECM Micro-particles
6:56
Results: Effective Removal of Cellular Material Enhances Analysis
8:10
Conclusion
