透射电镜下体的样品制备与成像

该程序的总体目标是观察纯化的细胞外囊泡的形态，并使用电子显微镜在细胞外囊泡内进行特异性蛋白质定位。这种方法可以帮助回答细胞外囊泡研究期间的关键问题，例如外泌体和位于其内部的特定蛋白质的分类。该技术的主要优点是可用于观察位于外泌体内部和外部的特定蛋白质部分。

该技术的含义是确保诊断多种疾病，包括癌症和细菌感染。虽然这种方法可以提供对外泌体的了解，但它也可以应用于其他生物样品、微细胞孵育和特异性蛋白质定位。通常，刚接触这种方法的个体会因为在免疫金颗粒的非特异性结合时产生污染而感到困难。

使用标准技术，在培养物中制备外泌体。然后超速离心 HCT116 细胞的培养上清液，以沉淀培养基中的外泌体。沉淀后，小心去除培养上清液。

为了固定纯化的外泌体沉淀，在 PH 值为 7.0 的 0.1 摩尔二甲胂铈溶液中加入 1 毫升 2.5% 戊二醛。将脂质 bylayer 囊泡在 4 摄氏度下孵育 1 小时。接下来，去除固定剂，在室温下用 1 毫升 0.1 摩尔二甲胂酸钠缓冲溶液冲洗沉淀 10 分钟。

然后用 1 毫升 2% 四氧化锇在 4 摄氏度下固定样品 1 小时。取出固定剂，用 0.1 摩尔二甲胂酸钠缓冲液冲洗外泌体沉淀 3 次，每 10 分钟更换一次缓冲液。然后，通过以一系列分级丙酮浓度摇动样品 10 分钟来脱水样品。

接下来，混合三份丙酮和一份低粘度包埋混合物的溶液。用这种混合物替换丙酮，并将样品孵育 30 分钟。继续增加低粘度包埋介质的比例，每一步孵育 30 分钟。

最后，将外泌体沉淀在 100% 的低粘度包埋混合物中在室温下孵育过夜。第二天，使用包埋模具将样品包埋在纯低粘度包埋混合物中，并在 65 摄氏度下烘烤 24 小时。使用超薄切片机，制备厚度为 60 纳米的切片。

将切片放在镍网格上，用 2% 乙酸铀酰对其中一些切片进行双重染色 20 分钟，然后用柠檬酸铅染色 10 分钟。接下来，将染色切片放入透射电子显微镜中，使用 80 伏特观察样品，并遵循曝光时间的自动设置。查看外泌体图像后，使用显微镜软件采集并保存图像。

首先，将含有 60 纳米厚、未染色切片的网格放入 50 微升 0.02 摩尔甘氨酸液滴中孵育 10 分钟，以淬灭游离醛基。然后，用 100 微升蒸馏水冲洗切片 3 次，每次 10 分钟。最后一次冲洗后，在室温下在含有 1% BSA 的 PBS 中孵育切片 1 小时。

然后，将骨架板放入 50 至 100 微升抗 KRS 抗体液滴中孵育 1 小时。接下来，在一滴含 0.1% BSA 的 PBS 中洗涤网格 5 次，每次 10 分钟。然后，将骨架转移到一滴合适的二抗中，并在室温下孵育切片 1 小时。

现在，将网格洗涤 5 次，每次 10 分钟，每次用一滴含有 0.1% BSA 的 PBS 单独滴入。用 2% 乙酸铀酰在黑暗中对切片进行双重染色 20 分钟，然后用柠檬酸雷诺铅染色 10 分钟。将染色的切片放入透射电子显微镜中，使用 80 千伏观察样品，并如前所述对其进行成像。

为了进行阴性染色，在分离后用 1 毫升 2% 多聚甲醛固定纯化的外泌体 5 分钟。用辉光放电处理薄的 formvar/carbon 膜涂层的 200 目铜 EM 网格 1 分钟，然后将 5 到 7 微升外泌体悬浮液加载到网格上并孵育 1 分钟。如果外泌体的浓度过高，请将浓度稀释到适当的水平。

立即在 EM 网格表面用约 20 滴过滤的 1% 乙酸铀酰溶液对外泌体进行染色。用滤纸接触网格边缘，从网格中去除多余的乙酸铀酰溶液，然后用一滴水快速冲洗网格。用一把镊子将网格放在桌子上，并用培养皿部分覆盖网格。

让网格在室温下干燥 10 分钟，然后对网格进行成像或将其存放在电子显微镜网格盒中以备将来观察。首先用辉光放电处理薄 formvar/carbon 膜涂层的 200 目铜 EM 网格 30 秒。然后，将 5 到 7 微升固定在 2% 多聚甲醛溶液中的外泌体加载到网格上，并在那里孵育 5 分钟。

接下来，用 100 微升 PBS 冲洗外泌体，每次 3 次，每次 10 分钟。用 50 微升 0.5 摩尔甘氨酸溶液处理含有外泌体的网格 10 分钟，以淬灭游离醛基团。然后，将网格转移到一滴含 1% BSA 的 PBS 中并封闭 30 分钟。

现在，将骨架与 50 至 100 μL 抗 PD-L1 抗体在室温下孵育 1 小时或在 4 摄氏度下过夜。用 5 滴含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤网格，每滴 10 分钟，然后将网格转移到一滴二抗中 1 小时。接下来，用五滴含 0.1% BSA 的 PBS 清洗网格，每滴 10 分钟，然后用两滴单独的蒸馏水洗涤网格。

完成后，如前所述，用 2% 乙酸铀酰进行负染色，并对样品进行成像，或将它们储存在 EM 网格盒中以备将来观察。这里观察到的外泌体形态是阴性染色的产物。这些外泌体显示出典型的杯状形态，这是在干燥过程中可能发生的伪影。

使用整片免疫金染色可以获得其他信息，例如特定蛋白质在外泌体中的位置。此处，白色箭头表示 PD-L1 的位置。在切片图像中，囊泡显示出一种被称为外泌体结构特征的管腔结构。

这些也可以进行免疫金染色，以识别整个外泌体中的特定蛋白质。一旦掌握，如果作得当，免疫金染色技术可以在简单的制备和切片后在纤维细胞中进行。在此程序之后，可以执行其他方法（如双重免疫染色）来同时识别两种不同蛋白质的位置。

每次开发后，该技术可用于细胞外囊泡领域，以探索活检中的疾病诊断。观看此视频后，您应该对如何识别外泌体内的特定蛋白质定位有很好的了解。不要忘记他们正在使用固定溶液，例如氯水合物、多聚甲醛和四氧化锇，可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如通风通风橱和乳胶手套。