Name: 透射电镜下体的样品制备与成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学习透射电镜技术用于细胞外囊泡形态观察与特定蛋白定位。该方法结合负染、超薄切片和免疫金标记技术，为外泌体分类及疾病诊断研究提供高分辨率成像支持。

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本研究由 Bio 资助 &amp;#38; 国家研究基金会（NRF）医疗技术开发计划 &amp;#38; 由韩国政府（MSIP）资助&amp;#38;MOHW)（编号 2016M3A9B6904244）。我们还感谢医药生物融合研究中心成员在外泌体纯化方面的工作。

1. 外泌体的包埋、切片、染色与成像
<ol>
	<li>通过在 100,000 × g 条件下离心 1.5 小时，从 HCT116 细胞的培养上清液中沉淀外泌体23。弃去培养上清液，用 1 mL 含 2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠溶液（pH 7.0）在 4 °C 下固定纯化的外泌体沉淀物 1 小时。配制 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液：将 4.28 g 二甲胂酸溶解于 160 mL 蒸馏水中，用 0.1 M HCl 调节 pH 至 7.4，再用蒸馏水定容至 200 mL。</li>
	<li>去除固定液，用 1 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液在室温下冲洗沉淀物。每次更换缓冲液，重复冲洗三次，每次持续 10 分钟。</li>
	<li>用 1 mL 2% 四氧化锇在 4 °C 下对样品进行后固定 1 小时。</li>
	<li>去除固定液，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗三次，每次 10 分钟。</li>
	<li>在摇床上依次用梯度丙酮溶液（分别为 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）孵育 10 分钟。</li>
	<li>去除丙酮，加入 3:1 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。外泌体沉淀物位于离心管中。</li>
	<li>去除介质，加入 1:1 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。</li>
	<li>去除介质，加入 1:3 的丙酮与低黏度包埋介质混合液，孵育 30 分钟。</li>
	<li>去除介质，加入 100% 低黏度包埋介质，室温下孵育过夜。</li>
	<li>使用包埋模具将样品包埋于纯低黏度包埋介质中，并在 65 °C 下烘烤 24 小时。</li>
	<li>使用超薄切片机切出厚度为 60 nm 的切片。</li>
	<li>先用 2% 醋酸铀染色 20 分钟，再用柠檬酸铅染色 10 分钟。 
	配制 Reynolds 铅染液：将 1.33 g 硝酸铅和 1.76 g 柠檬酸钠溶于总共 50 mL 蒸馏水中。</li>
	<li>在 80 kV 下通过透射电子显微镜观察载网。</li>
	<li>在 80 kV 下的电子显微镜 CCD 相机系统中，点击“采集”，然后点击“文件”和“另存为”。按照自动设置调整曝光时间。</li>
</ol>
2. 切片免疫染色与成像（图1）
<ol>
	<li>使用超薄切片机切取60 nm的超薄切片，并收集于镍网上。</li>
	<li>孵育载网于 50 µL 加入0.02 M甘氨酸溶液，孵育10分钟，以淬灭游离醛基。</li>
	<li>冲洗 100 μL 用去离子水洗涤三次，每次10分钟。在含1% BSA的PBS中室温孵育1小时。</li>
	<li>将载网置于 50 - 100 µL 抗KRS抗体滴液24 （在含有0.1% BSA的PBS中按1:100稀释）孵育1小时（如有必要，此步骤应在 4 °C 过夜。</li>
	<li>用五滴不同的溶液分别清洗载网（50 µL) 含有0.1% BSA的PBS缓冲液中，每次10分钟。</li>
	<li>将载网转移至2滴nd 抗体孵育1小时（使用与10 nm金颗粒偶联的抗兔IgG抗体（1:100稀释），溶于含0.1% BSA的PBS中）。</li>
	<li>用五个独立的液滴冲洗载网（50 µL) 含0.1% BSA的PBS，每次10分钟。</li>
	<li>在避光条件下，分别用2%醋酸铀染色20分钟，再用Reynold铅柠檬酸盐染色10分钟。</li>
	<li>在透射电镜（80 kV）下，于CCD相机系统中点击“采集”，然后点击“文件”并选择“另存为”。曝光时间采用自动设置。</li>
</ol>
<img alt="使用免疫测定法进行病毒检测的顺序过程：样品、芯片、分析、结果显示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56482/56482fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：样品制备与免疫染色过程。 (A) 双固定外泌体经脱水后，用低粘度包埋介质树脂进行渗透处理。(B) 树脂包埋。(C) 使用金刚石刀进行超薄切片。(D) 免疫金标记实验装置。将带有超薄切片的载网置于Parafilm表面的液滴上，并用湿润的纸巾保持湿度。每个切片与50–100 µL抗体液滴孵育，随后用缓冲液洗涤。(E) 使用醋酸铀和柠檬酸铅进行双重染色。染色过程中用铝箔覆盖盖子，以进行重金属染色。(F) 用滤纸去除染色液。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56482/56482fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 负染色法
<ol>
	<li>使用电晕放电仪对覆有薄层火棉胶/碳膜的200目铜质电镜载网进行1分钟的电晕放电处理。</li>
	<li>用1 mL的2%多聚甲醛（PFA）固定纯化的外泌体，作用5分钟。 
	注意：多聚甲醛蒸气有毒，所有操作应在通风良好的通风橱中进行。</li>
	<li>将5–7 µL外泌体悬液滴加到载网上，孵育1分钟。若外泌体浓度过高，可将其稀释至原浓度的1/2–1/5。</li>
	<li>用注射器将约20滴过滤后的1%醋酸铀酰（UA）染色液滴加至电镜载网表面，立即进行染色。</li>
	<li>用滤纸接触载网边缘，吸除载网上的多余UA溶液。</li>
	<li>用一滴水快速冲洗载网，以去除残留的染色液。</li>
	<li>用镊子夹持载网放置于桌面上，并用培养皿部分覆盖，于室温下干燥10分钟。</li>
	<li>将载网存放在电镜载网盒中，以备后续在80 kV透射电镜下观察使用。</li>
</ol>
4. 免疫染色用整体封片
<ol>
	<li>对覆有薄层聚乙烯醇缩醛/碳膜的 200 目铜质透射电镜载网进行 30 秒的辉光放电处理。</li>
	<li>用1 mL 2%多聚甲醛（PFA）固定纯化的外泌体5 min。 
	注意：聚甲醛蒸气有毒，所有操作均应在通风橱内进行。</li>
	<li>加载 5 - 7 µL 将固定后的外泌体溶液滴加至载网上，孵育5分钟，用去离子水冲洗 100 µL 用 PBS 每次 10 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>处理载网 50 µL 用 0.05 M 甘氨酸孵育 10 分钟，以淬灭游离醛基。</li>
	<li>将载网转移至封闭缓冲液（含1% BSA的PBS）液滴中，孵育30分钟。</li>
	<li>孵育载网与 50 - 100 µL 抗PD-L1抗体（1:100，溶于含0.1% BSA的PBS中）孵育1小时（如必要，此步骤应在 4 °C 过夜。</li>
	<li>用五个独立的液滴分别清洗载网（50 µL) 含有0.1% BSA的PBS缓冲液中，每次10分钟。</li>
	<li>将载网转移至一滴 2nd 抗体孵育1小时。将与9 - 11 nm金颗粒偶联的抗小鼠IgG以1:100比例溶于含0.1% BSA的PBS中。</li>
	<li>用五滴不同的溶液分别清洗载网50 µL)含0.1% BSA的PBS溶液，每次10分钟。用两滴独立的溶液清洗网格（50 µL) 的去离子水。按照3.4至3.8步骤，使用2%醋酸铀进行负染。</li>
	<li>将载网存放在透射电镜载网盒中，以备后续在80 kV下通过透射电镜观察。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种用于观察外泌体精细结构并标记其特异性蛋白质的实验方案。负染色法被认为是外泌体成像的最佳方法17。该传统技术显示外泌体呈杯状结构。然而，这种杯状形态是由于干燥过程所导致的人工假象。冷冻透射电镜（cryo-TEM）结果显示，外泌体在水溶液中具有完全球形的结构25,26。冷冻透射电镜是一种研究外泌体天然结构的强有力方法，但难以应用于免疫金标记技术。Raso 及其同事指出，传统方法（整体负染法）中的干燥步骤导致了杯状形态的产生。本研究采用了常规的细胞制备方法（常规电镜技术；包括固定、脱水、包埋和切片），以减少外泌体的干燥效应。使用塑料包埋的常规电镜技术可避免或减少因变性引起的假象（体积和形状的变化）。化学固定中采用戊二醛（GA）进行交联（氨基之间的共价相互作用）。通常还使用四氧化锇（OsO4）固定脂质，并提高样品的对比度。
本研究中，负染色法有助于确认外泌体典型的形态特征，该特征已在先前的文...

细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌的脂质双层囊泡，其大小在30至300 nm之间。1978年首次报道了细胞外囊泡的存在，相关证据来自霍奇金病患者的囊泡1，这些囊泡的直径为40至120纳米。1980年有研究报道，EVs参与癌症患者体内血液凝固系统及血栓形成，即在血管内形成血凝块的过程2。30年后，EVs被证实是促进肿瘤侵袭、免疫逃逸和血管生成的重要因素3。此外，EVs在炎症、免疫紊乱、神经系统疾病和癌症等领域的细胞相互作用调节功能也已被广泛研究4。由于EVs含有特定的生物分子，如蛋白质、mRNA和microRNA5，其在诊断和治疗中的潜在应用价值已得到分析6,7。EVs是一类包含多个亚群的囊泡，根据其细胞来源和生物学功能，可分为外泌体（exosomes）、前列腺体（prostasomes）、肿瘤体（oncosomes）、dexosomes、微颗粒（microparticles）、promininosomes、argosomes以及类外泌体囊泡（exosome-like vesicles）等3。此外，根据其生物发生途径，这些EVs还可分为微囊泡（shed microvesicles，100–1000 nm）和外泌体（30–300 nm）8,9。其中，外泌体已被报道在免疫应答10、癌症11,12以及感染性疾病13中作为细胞间通讯的重要媒介。
外泌体作为早期诊断生物标志物的研究兴趣正在迅速增长，而外泌体的纯化与表征必须结合分子成像技术。由于外泌体的大小和形态随其来源和功能不同而有所差异14，可通过高分辨率显微技术（如电子显微镜）加以区分。大多数外泌体通过负染透射电子显微镜（TEM）进行观察15,16,17，并通过整体囊泡的特异性蛋白免疫标记加以验证18。多个研究团队已报道通过扫描电子显微镜、原子力显微镜19,20以及冷冻电镜（Cryo-TEM）21,22获得的外泌体结构。然而，尽管这些技术适用于研究外泌体结构，却不足以观察位于外泌体内部的特定蛋白的位置。因此，我们提出了一种针对特定蛋白标记的外泌体成像方案。通过包埋块制备、超薄切片和免疫染色技术，确定目标蛋白在外泌体中的精确定位，并将其与传统的负染色法和整体免疫染色法进行比较，后者常用于外泌体的表征。

<table><tbody><tr><td>戊二醛</td><td>EMS</td><td>16200</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠&amp;nbsp;</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 1 g 晶体</td><td>EMS</td><td>19100</td><td>仅可在通风橱中使用</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>JUNSEI</td><td>1B2031</td><td></td></tr><tr><td>Spurr 包埋介质</td><td>TED PELLA</td><td>18108</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>UCT</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>危险化学品</td></tr><tr><td>柠檬酸铅</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Hitachi</td><td>H7600</td><td></td></tr><tr><td>镍网</td><td>EMS</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>铜网</td><td>EMS</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>SIGMA</td><td>022K5404</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Aurion</td><td>25557</td><td></td></tr><tr><td>一抗</td><td></td><td></td><td>手动纯化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>纯化的抗人 CD274（B7-H1，PD-L1）抗体</td><td>BioLegend</td><td>329710</td><td>整体免疫金标记</td></tr><tr><td>纯化的小鼠 IgG2b，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BioLegend</td><td>401202</td><td>整体免疫金标记（对照）</td></tr><tr><td>二抗：偶联 9-11 nm 金颗粒的抗小鼠 IgG 抗体</td><td>sigma</td><td>G7652</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM2200FS</td><td></td></tr><tr><td>电晕放电仪</td><td>JEOL</td><td>JFC1100E</td><td></td></tr><tr><td>碳支持膜镍网</td><td>EMS</td><td>121119</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMS</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 碳涂层铜网（200 目）</td><td>EMS</td><td>FCF200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 碳涂层&amp;nbsp; 镍网（200 目）</td><td>EMS</td><td>FCF200-NI</td><td></td></tr></tbody></table>

外泌体的透射电子显微镜样品制备与成像

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

外泌体是由体液分泌的纳米级细胞外囊泡，能够反映分泌细胞的特性。这些分泌囊泡的内容物和形态可体现细胞的行为或生理状态，例如细胞生长、迁移、分裂和死亡。外泌体的功能可能与其大小密切相关，其尺寸通常在30至300 nm之间。目前最常用的外泌体成像方法是负染色法，其他研究结果则基于冷冻透射电子显微镜、扫描电子显微镜和原子力显微镜获得。通过负染色法观察到的典型外泌体形态呈杯状，但更详细的结构特征尚不明确。在医学和药学领域，尤其需要通过结构研究对外泌体进行充分表征。因此，应利用电子显微镜技术（如对外泌体精细结构中的特定蛋白进行标记）来验证其功能相关的形态特征。为了观察其精细结构，本文比较了超薄切片图像与负染色图像。在本实验方案中，我们推荐使用透射电子显微镜对外泌体进行成像，包括负染色、整体免疫染色、包埋块制备、超薄切片以及免疫金标记等方法。

目前，外泌体主要通过透射电子显微镜根据其大小和形态进行分类。图2展示了整体封片状态下经负染色的外泌体以及免疫标记的外泌体。图3展示了经超薄切片后染色的外泌体以及免疫标记的外泌体。利用针对特定蛋白的抗体进行免疫金标染色，可用于明确鉴定外泌体，并对外泌体中的蛋白类型进行分类。本文所采用的实验方案包括对外泌体进行整体封片免疫染色以及对塑料切片外泌体进行免疫染色。
<img alt="病毒颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像；比例尺为100 nm，用于尺寸参考。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56482/56482fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：负染色法与整体免疫染色法。</str...

本方案描述了进行透射电子显微镜观察所需的多种技术，包括负染色法、用于观察精细结构的超薄切片法，以及免疫金标记法以确定外泌体中特定蛋白质的位置。

外泌体是由体液分泌的纳米级细胞外囊泡，已知能够代表分泌细胞的特性。

本实验的总体目标是利用电子显微镜观察纯化后的细胞外囊泡的形态，并在细胞外囊泡内进行特定蛋白质的定位。该方法有助于解答细胞外囊泡研究领域中的一些关键问题，例如外泌体的分类及其内部特定蛋白质的定位。该技术的主要优势在于，可用于观察位于外泌体内部和外部的特定蛋白质分布情况。该技术的意义在于确保多种疾病的诊断，包括癌症和细菌感染。尽管该方法可用于外泌体研究，也可应用于其他生物样本、微细胞培养以及特定蛋白质的定位分析。通常，初次使用该方法的研究人员会因免疫金颗粒的非特异性结合而导致污染问题而遇到困难。采用标准技术在培养物中制备外泌体。然后对HCT116细胞的培养上清液进行超速离心，以沉淀培养基中的外泌体。沉淀完成后，小心移除培养上清液。为固定纯化的外泌体沉淀，加入1毫升含2.5%戊二醛的0.1摩尔/升二甲胂酸钠溶液（pH 7.0）。将脂质双层囊泡在4摄氏度下孵育1小时。随后，去除固定液，并用1毫升0.1摩尔/升磷酸钠缓冲液在室温下冲洗沉淀物10分钟。然后在4摄氏度条件下，用一毫升2%的四氧化锇对样品后固定一小时。去除固定液后，用0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液洗涤外泌体沉淀三次，每十分钟更换一次缓冲液。随后将样品依次置于浓度梯度递增的丙酮溶液中，每种浓度振荡处理10分钟，以完成脱水步骤。接下来，配制一份由三份丙酮和一份低黏度包埋混合液组成的溶液。用该混合液替换丙酮，并将样品孵育30分钟。随后逐步增加低黏度包埋介质的比例，每步均孵育30分钟。最后，将外泌体沉淀物在室温下于100%低黏度包埋剂中孵育过夜。次日，使用包埋模具将样品包埋于纯低黏度包埋剂中，并在65摄氏度下烘烤24小时。使用超薄切片机制备厚度为60纳米的切片。将切片置于镍网上，其中部分切片用2%醋酸铀染色20分钟，随后用柠檬酸铅染色10分钟。接着，将染色后的切片放入透射电子显微镜中，以80千伏电压观察样品，并根据曝光时间的自动设置进行操作。当观察到外泌体图像时，使用显微镜软件采集并保存图像。首先，将含有60纳米厚未染色切片的载网置于50微升0.02摩尔甘氨酸溶液中孵育10分钟，以淬灭游离的醛基。然后，用100微升蒸馏水清洗切片，每次10分钟，共清洗三次。最后一次清洗后，将切片在含1% BSA的PBS溶液中室温孵育1小时。然后，将载网置于50至100微升的抗KRS抗体液滴中，室温孵育1小时。接着，用含有0.1% BSA的PBS液滴，将载网洗涤5次，每次10分钟。随后，将载网转移至适当二抗的液滴中，在室温下孵育1小时。现在，用含有0.1%BSA的PBS分别滴加于载网上，每次10分钟，洗涤5次。先在避光条件下用2%醋酸铀染色20分钟，再用Reynolds柠檬酸铅染色10分钟，对切片进行双重染色。将染色后的切片放入透射电子显微镜中，以80千伏的加速电压观察样品，并按照之前所示方法进行成像。为了进行负染色，外泌体分离后，用一毫升 2% 多聚甲醛固定五分钟。将薄型、甲醛/碳膜包被的 200 目铜制透射电镜载网进行辉光放电处理一分钟，然后在载网上加载五至七微升外泌体悬液，孵育一分钟。若外泌体浓度过高，需将其稀释至适当浓度。立即在电镜载网表面加入约20滴过滤后的1%醋酸铀溶液对外泌体进行染色。用滤纸接触载网边缘以去除多余的醋酸铀溶液，然后迅速用一滴水冲洗载网。使用一对镊子将载网放置于桌面上，并用培养皿部分覆盖载网。将载网在室温下干燥10分钟，然后对载网进行成像，或将其存放在透射电子显微镜载网盒中以备后续观察。首先，对覆有薄层甲醛/碳膜的200目铜网进行辉光放电处理30秒。随后，将5至7微升用2%多聚甲醛溶液固定的外泌体样品加载到载网上，并在载网上孵育5分钟。接下来，用100微升PBS清洗外泌体，每次10分钟，共清洗三次。将含有外泌体的载网置于50微升0.5摩尔甘氨酸溶液中处理10分钟，以淬灭游离的醛基。然后，将载网转移至含有1% BSA的PBS液滴中，封闭30分钟。现在将载网与50至100微升抗PD-L1抗体在室温下孵育一小时，或在4摄氏度下孵育过夜。用五滴含有0.1% BSA的PBS分别洗涤载网，每滴10分钟。然后将载网转移至二抗溶液中孵育一小时。接着，再次用五滴含有0.1% BSA的PBS分别洗涤载网，每滴10分钟，随后用两滴蒸馏水分别洗涤载网。完成后，用2%醋酸铀进行负染色，如前所述，并对样品进行成像，或将其保存在电镜载网盒中以备后续观察。此处观察到的外泌体形态是负染色的结果。这些外泌体呈现出典型的杯状形态，这是在干燥过程中可能产生的假象。通过全 mount 免疫金染色可获得更多信息，例如外泌体中特定蛋白质的定位。此处白色箭头指示 PD-L1 的位置。在切片图像中，囊泡显示出腔样结构，这是外泌体的已知结构特征。这些也可以通过免疫金染色来鉴定外泌体中的特定蛋白质。一旦掌握，只要操作得当，在经过简单的制备和切片后，即可对纤维状细胞进行免疫金染色。在此步骤之后，还可采用其他方法，如双重免疫染色，以同时确定两种不同蛋白质的定位。每次实验操作后，该技术可用于细胞外囊泡领域，以探索活检样本中的疾病诊断。观看本视频后，您应能够充分理解如何鉴定外泌体中特定蛋白质的定位。请注意，实验中所使用的固定剂溶液（如盐酸、多聚甲醛和四氧化锇）具有极高危险性，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如在通风橱中操作并佩戴乳胶手套。

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生物学

透射电镜下体的样品制备与成像

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利用随机锥形倾斜法通过单颗粒电子显微镜重构外泌体复合物

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含RNA外泌体的分离与表征

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关键词：外泌体，负染色，透射电子显微镜，形态学，纯化，纳米囊泡

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本文描述了一种从液体样本中无标记固定外泌体和细胞外囊泡，并通过原子力显微镜（AFM）对其进行成像的逐步操作方法。利用AFM图像可估算溶液中外泌体的尺寸，并表征其其他生物物理特性。...

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外泌体的透射电子显微镜样品制备与成像

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